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- La proteína Tau se localiza periféricamente en el nucléolo de las células de cáncer colorrectal y ayuda a mantener la estructura nucleolar. En su mayoría, estas células expresan la proteína tau hiperfosforilada, lo que da lugar a la resistencia a los fármacos. Por lo tanto, analizamos los niveles de fosforilación de tau mediante la realización de un ensayo de fosfatasa.
Comience tomando el lisado celular que contiene la proteína total de las células de cáncer colorrectal humano en dos viales etiquetados como prueba y control. Tratar la muestra de ensayo con la enzima fosfatasa alcalina. La fosfatasa alcalina elimina los grupos fosfato de la proteína tau, mientras que el vial de control retiene la proteína tau fosforilada.
A continuación, pase la muestra y la tau de control en un gel de poliacrilamida para separar las proteínas. La proteína tau fosforilada se mueve más lentamente en el gel que la proteína tau no fosforilada. Electrocsolar la muestra de proteína a una membrana adecuada y añadir anticuerpos primarios correspondientes tanto a la tau fosforilada como a la normal.
Incuba la mancha durante la noche. Trate el blot con un anticuerpo secundario conjugado con enzima reportera que se une a la región Fc del anticuerpo primario. Por último, desarrolle el blot utilizando un sustrato quimioluminiscente para identificar la proteína tau a partir de la muestra total de proteínas presente en el blot. En el siguiente protocolo, demostraremos el ensayo de fosfatasa para evaluar el estado general de fosforilación de tau en células de CCR.
- Después de preparar muestras que contengan 20 microgramos de proteína total, agregue dos microlitros de tampón de fosfatasa alcalina y 10 microlitros de fosfatasa alcalina a cada uno. A continuación, añade agua destilada de forma que el volumen final de cada muestra sea de 20 microlitros.
Incubar las muestras a 37 grados centígrados durante una hora. Mientras se incuban las muestras, prepare muestras adicionales a la misma concentración, pero sin fosfatasa para comparar. Después de una hora, detenga la reacción agregando EDTA a una concentración final de 50 milimolares u ortovanadato de sodio a una concentración final de 10 milimolares.
Agregue un tampón de carga de gel 4X SDS recién preparado que contenga 400 milimolares de DTT. Usando un bloque de calor, incube las muestras a 100 grados centígrados durante cinco minutos. Agite las muestras y luego déjelas enfriar a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos.
A continuación, cargue 13 microlitros de muestra por pocillo, así como la escala de peso molecular en un gel de poliacrilamida al 10%. Conecte el sistema de electroforesis a una fuente de alimentación y ajuste el voltaje a 70 voltios durante 20 minutos para mover las muestras de proteínas del gel de apilamiento al gel de resolución.
Después de esto, aumente a 125 voltios y haga funcionar el gel durante aproximadamente 70 a 120 minutos, hasta que las muestras y la escalera de proteínas lleguen al final del gel. Usando un sistema de electrotransferencia húmeda, transfiera el gel a una membrana de fluoruro de polivinilideno a 100 voltios durante aproximadamente 100 minutos.
A continuación, incubar la membrana para secar en albúmina sérica bovina al 4% durante 90 minutos a temperatura ambiente. Incubar la transferencia durante la noche en una solución primaria de anticuerpos a 4 grados centígrados. Al día siguiente, lave la mancha tres veces en PBST, lavándola durante siete minutos cada vez.
Incubar en la solución de anticuerpos secundarios correspondiente durante 90 minutos a temperatura ambiente. Luego, lave con PBST cuatro veces, y cada lavado dura siete minutos. Revele la mancha con un kit de quimioluminiscencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Cubra la mancha revelada con una envoltura de plástico transparente y luego adquiera imágenes de quimioluminiscencia de la mancha con un sistema de imágenes de quimioluminiscencia disponible en el mercado.