Ensayo de unión a microtúbulos en células de CCR: un método para examinar la proteína tau de unión a microtúbulos en células de cáncer colorrectal

- Tau es una proteína asociada a los microtúbulos que participa en la estabilización y el ensamblaje de los microtúbulos. Muchas células cancerosas expresan la proteína tau hiperfosforilada, que no logra mantener una unión de microtúbulos bien organizada. Para estudiar la interacción entre la proteína tau y los microtúbulos, agregue lisado de células cancerosas que contenga proteína tau y una solución de trabajo de microtúbulos en un tubo de microfuga.

Las proteínas tau no fosforiladas presentes en el lisado celular se unen a los microtúbulos. Ahora, agregue la cantidad deseada de tampón PEM en el tubo para estabilizar la actividad de la tubulina, una proteína que se polimeriza en filamentos para formar microtúbulos. Incuba la mezcla durante el tiempo deseado.

Centrifugar la mezcla para granular la proteína unida a los microtúbulos. La proteína no unida permanece en el sobrenadante. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y vuelva a suspender el pellet en un tampón adecuado. Añada un tampón de carga de gel a la suspensión de pellets resuspendida y ejecute las muestras en un gel de poliacrilamida para separar la proteína unida a los microtúbulos y la electrotransferencia en una membrana adecuada.

Agregue los anticuerpos adecuados y desarrolle la transferencia utilizando un sustrato de quimioluminiscencia para identificar las proteínas tau unidas. En el siguiente protocolo, realizaremos el ensayo de unión a microtúbulos para identificar las proteínas unidas a microtúbulos.

- Después de preparar muestras frescas, incubarlas a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Ultracentrifugar las muestras a 100.000 x g y 25 grados centígrados durante 60 minutos. A continuación, transfiera 120 microlitros de cada sobrenadante que contenga tau no unido para separar los tubos limpios y etiquetados. Agregue 120 microlitros de tampón de muestra 5X al gránulo que contiene tau unido.

Después de mezclar bien mediante vórtice y pipeteo, transfiera la mezcla a tubos limpios etiquetados. Después de preparar muestras de concentración de proteína equivalente, agregue tampón de carga de gel 4X SDS fresco que contenga 400 milimolares de DTT. Utilice un bloque de calor para incubar las muestras a 100 grados centígrados durante cinco minutos.

Agite las muestras y luego déjelas enfriar a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos. Cargue 13 microlitros de muestra por pocillo y la escala de peso molecular en un gel de poliacrilamida al 10%. Conecte los electrodos positivo y negativo del sistema de electroforesis a una fuente de alimentación y luego ajuste el voltaje a 70 voltios durante 20 minutos.

Después de esto, aumente a 125 voltios y haga funcionar el gel durante aproximadamente 70 a 120 minutos hasta que las muestras y la escalera de proteínas lleguen al final del gel. Use el sistema de electrotransferencia húmeda para transferir el gel a una membrana de fluoruro de polivinilideno a 100 voltios durante aproximadamente 100 minutos. Incubar la membrana para secar en albúmina sérica bovina al 4% durante 90 minutos a temperatura ambiente. Luego, incubar durante la noche en una solución primaria de anticuerpos a 4 grados centígrados.

Al día siguiente, lave la mancha cuatro veces con PBST y cada lavado dura siete minutos. Incubar la transferencia lavada en una solución de anticuerpos secundaria pertinente durante 90 minutos a temperatura ambiente. Luego, lave con PBST durante siete minutos repitiendo el lavado un total de cuatro veces. Revele la mancha con un kit de quimioluminiscencia. Cubra con una envoltura de plástico transparente y adquiera imágenes utilizando un sistema de imágenes de quimioluminiscencia.