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- Los modelos organotípicos 3D de cáncer colorrectal son cultivos in vitro diseñados para imitar microambientes tumorales in vivo. El cultivo a menudo contiene células estromalas, como fibroblastos, cocultivadas con células epiteliales de cáncer colorrectal, en un microambiente de matriz extracelular adecuado.
En cultivos establecidos, las células tumorales con potencial metastásico invaden la matriz extracelular. Para aislar estas células invasoras, primero se trata el modelo organotípico con formaldehído para fijar las células y la matriz extracelular. Incubar con alcohol para deshidratar la muestra.
A continuación, incruste en cera de parafina líquida para generar un bloque de tejido. Utilice un ultramicrótomo para obtener secciones en rodajas finas. Monte las secciones en un portaobjetos de vidrio apropiado.
Agregue xileno para desparafinar las secciones. Secuencialmente, incubar las secciones en concentraciones decrecientes de etanol para rehidratar las muestras.
Tratar con Cresyl Violet para teñir y diferenciar las células de cáncer colorrectal del microambiente. Coloque el portaobjetos de vidriera boca abajo sobre la platina del microscopio. Utilizando el software adecuado, identifique las células que se van a microdiseccionar y delinee los bordes. Dispare el láser para cortar la sección resaltada y recoger la parte microdiseccionada.
En el siguiente protocolo, mostraremos el aislamiento de células de cáncer colorrectal a partir de un modelo de cocultivo organotípico en 3D mediante microdisección láser.
- Retire todo el organotípico, incluida la lámina de nylon, del pocillo y colóquelo sobre una película adhesiva. Divida en dos la lámina organotípica y de nailon con un bisturí desechable limpio y fije ambas mitades en formaldehído durante 24 horas a temperatura ambiente. Reemplace el formaldehído con etanol al 70% después de 24 horas y déjelo toda la noche antes de incrustarlo en parafina, seccionarlo y teñirlo.
Para realizar la microdisección láser, primero, seccione el organotípico a un grosor de 10 micras en portaobjetos montados en membrana. Después de tratar las secciones como se describe en el protocolo de texto, prepárese para realizar la microdisección láser utilizando la plataforma elegida.
Coloque el portaobjetos de vidrio con la sección teñida a microdiseccionar boca abajo en la platina del microscopio. Monte un tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitros en el casete de recolección y agregue 50 microlitros de tampón de lisis celular a la tapa en la que se recolectará el tejido microdisecado. Bajo visión directa, use el joystick para identificar el tejido de interés y, usando la interfaz del software, anote la sección orgánica teñida, resaltando las células que se van a microdiseccionar en el frente de invasión tumoral.
Indique al láser que dispare, lo que debe cortar la sección resaltada e impulsar el tejido microdisecado hacia la tapa del tubo de microcentrífuga. Proceda a procesar las muestras mediante un método adecuado para extraer el analito de interés.