Ensayo de organización de citoesqueleto y adhesión focal: un método basado en inmunofluorescencia para estudiar la adhesión celular y la diseminación en sustratos

- La morfología del sustrato influye en gran medida en el comportamiento y las respuestas metastásicas de las células cancerosas. Una red dinámica de citoesqueleto de actina proporciona soporte estructural a las células y media el movimiento celular. Grandes complejos de proteínas asociados a la membrana, llamados adherencias focales, conectan el citoesqueleto con la matriz extracelular, lo que facilita la propagación celular.

Para comenzar la tinción, tome un cultivo de células cancerosas y trátelas con paraformaldehído para fijar y permeabilizar las células. Ahora, incube las células con un reactivo potenciador de señales que contenga proteínas para preparar las células para reducir la tinción de fondo. Agregue anticuerpos primarios anti-vinculina que se unen a la vinculina, una de las proteínas dentro del complejo de adhesión focal.

A continuación, incube la muestra con un anticuerpo secundario conjugado con colorante fluorescente dirigido al anticuerpo primario. Por último, tratar las células con conjugados de faloidina marcados con fluorescencia que se unen selectivamente a los filamentos de actina del citoesqueleto. Observe las células bajo un microscopio de barrido láser confocal para estudiar sus señales fluorescentes.

Las células con morfología bien distribuida exhiben fibras de actina definidas y presentan adherencias focales distintas y alargadas que contienen vinculina. Por el contrario, las células mal distribuidas no poseen filamentos de actina definidos, sino que muestran adherencias focales punteadas que contienen vinculina. En el siguiente protocolo, demostraremos un ensayo de inmunofluorescencia para estudiar el citoesqueleto y la organización de la adhesión focal en células de cáncer de colon primario.

- Llevar los sustratos a inmunoteñir a la campana laminar y retirar los medios de cultivo. A continuación, enjuague los sustratos con solución salina tamponada con fosfato, o PBS, y fije las células con paraformaldehído al 4% en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Lave los sustratos con PBS durante cinco minutos, un total de tres veces. A continuación, incubar los sustratos con 500 microlitros de potenciador de señal durante 30 minutos antes de enjuagar con PBS.

A continuación, incubar las células con el anticuerpo monoclonal anti-vinculina en una dilución de 1 a 250 en PBS durante 45 minutos a temperatura ambiente. A continuación, lave los sustratos con PBS durante cinco minutos, un total de tres veces. Incubar las muestras con un anticuerpo secundario Alexa Fluor 488 goatat anti-mouse IgG a una dilución de 1 a 200 en PBS a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, vuelve a lavar los sustratos con PBS durante cinco minutos, un total de tres veces.

Para visualizar la estructura de la F-actina, incubar las células con conjugados de tetrametilrodamina-faloidina a una concentración de 50 microlitros por mililitro durante 45 minutos a temperatura ambiente. A continuación, vuelve a lavar los sustratos como antes. Finalmente, proceda a obtener imágenes de las muestras utilizando un microscopio láser de barrido confocal.

• Focal Adhesion - Protein complex facilitating cell-cytoskeleton and extracellular matrix connection.
• Vinculin - An integral protein within the focal adhesion complex.
• Actin Cytoskeleton - Provides structural support to cells and mediates cellular movement.
• Immunofluorescence - A staining method used to visualize components within a cell.
• Cell Spreading - The process related to cell movement and attachment involving focal adhesions and actin filaments.

• Introduce Focal Adhesion - Protein complex connecting actin cytoskeleton and extracellular matrix (e.g., vinculin).
• Key Concepts - Supporting cell's structural integrity, movement, and interactions (e.g., actin network).
• Underlying Mechanisms - Fundamental processes facilitating cell adhesion, spreading, and movement.
• Connect to Experiment - Using immunofluorescence to visualize actin and vinculin in cancer cells.

• What is focal adhesion and how does it facilitate cellular movement and interaction?
• How does vinculin function within the focal adhesion complex?
• How is immunofluorescence used to study the organization of actin cytoskeleton and focal adhesion?

• Practical Applications – Understanding cellular behavior and responses through immunofluorescence (e.g., cancer research).
• Industry Impact – Enhancing the understanding of cell morphology in biomedical sector (e.g., drug development).
• Societal Importance – Broadening comprehension of diseases trajectory and treatment options (e.g., cancer).
• Link to Scientific Advancements - Immunofluorescence marks a significant advancement in cell biology studies.