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Investigación sobre el cáncer
0 vistas • 4:23 min • April 30th, 2023
- Las células madre de los melanocitos quiescentes, en respuesta a la radiación UV o a la depilación del cabello, se activan. Las células madre del melanoma activado pueden provocar melanoma cutáneo, una forma de cáncer de piel. Para estudiar el melanoma, preparamos bloques de tejido cutáneo congelado para retener las estructuras nativas de ADN y proteínas durante el procedimiento de fijación.
Comience colocando un ratón con melanoma eutanasiado en una cama quirúrgica y retire el vello de la región dorsal de la piel por encima de la cola. Extirpa la piel y cúbrela con un papel de filtro. A continuación, sumerja el papel de filtro que contiene el tejido de la piel en formol neutro tamponado durante el tiempo deseado. La formalina penetra en el tejido de la piel y se une a los aminoácidos, lo que provoca la reticulación de las proteínas, lo que conduce a la fijación de los tejidos.
Retira el tejido de la piel del papel y corta el tejido para obtener trozos del tamaño deseado. Ahora, incruste las piezas de tejido verticalmente en un molde criomático lleno de medio OCT y coloque los criomoldes sobre hielo seco. La OCT es una matriz de muestra que se solidifica al congelarse y forma una capa gelatinosa alrededor de la muestra de tejido que la mantiene en su lugar. Utilice los bloques congelados para realizar más ensayos histológicos. En el siguiente protocolo, prepararemos bloques de tejido cutáneo congelado de la piel dorsal murina para estudiar el melanoma cutáneo.
- Para aislar las muestras de piel, use una recortadora eléctrica para eliminar cualquier vello del área dorsal de la piel de los ratones irradiados con eutanasia y cepille ligeramente la piel expuesta con un pañuelo sin pelusa para despejar el área. Haga una pequeña incisión con unas tijeras afiladas justo por encima de la base de la cola e inserte unas tijeras grandes y romas en la incisión para separar los tejidos conectivos subdérmicos. Con unas tijeras afiladas, corte con cuidado a lo largo del borde de la región de la piel de interés para aislar la muestra de tejido y coloque el tejido de piel extirpado sobre una toalla de papel limpia.
Luego, use pinzas sin filo para estirar la piel de modo que se adhiera a la toalla y esté tensa. Cuando se hayan recolectado todas las muestras, coloque la muestra de piel y el respaldo de la toalla de papel en un trozo de papel de filtro doblado inmediatamente adyacente al pliegue, teniendo cuidado de que la muestra esté lisa y no doblada o arrugada. Cierre los lados del papel de filtro con grapas y recorte el papel. A continuación, sumerja completamente las muestras en formol tampón neutro al 10% durante 3 a 5 horas a temperatura ambiente antes de lavar los tejidos con dos lavados de 5 minutos en agua desionizada.
Después del segundo lavado, retire con cuidado cualquier material residual de los tejidos de la piel y recorte los bordes de la muestra para que no queden irregulares. A continuación, haga tres cortes sagitales en cada muestra de modo que el ancho de las tiras no sea superior a 5 milímetros y haga cortes transversales de modo que las muestras no tengan más de 20 milímetros de ancho. Coloque un crimolde que contenga una temperatura de corte óptima o un medio OCT en orientación vertical y coloque de cuatro a cinco piezas de piel encima del OCT.
Cuando todas las piezas estén en su lugar, use dos pares de pinzas finas para llevar el borde largo de cada pieza de piel a la parte inferior del crimolde para que las muestras estén verticales dentro de la OCT y perpendiculares a la base del molde. Luego, llene el molde con OCT adicional al segundo labio y coloque el molde sobre una superficie plana de un trozo de hielo seco, usando pinzas para ajustar cualquier pieza de piel que pueda haberse movido durante la transferencia a medida que el bloque comienza a congelarse según sea necesario.