Name: Cultura de embriones de ratón de pulmón, un sistema para evaluar los mecanismos moleculares de la ramificación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Aprende a cultivar pulmones embrionarios de ratón para estudiar la morfogénesis pulmonar y las interacciones epitelio-mesenquimales. Este método permite observar el crecimiento y la ramificación en respuesta a tratamientos específicos.

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Este trabajo fue apoyado por el Saban Research Institute Pre-doctoral Premio (PMDM), y por el NIH RO1 HL75773 (DW).

El cultivo de órganos es una técnica muy útil y versátil para el estudio de genes y expresión de la proteína. Estos métodos ex vivo la cultura puede ser utilizado como preliminar o como complemento de los estudios in vivo. 1. Aislamiento de pulmón embrionario <ol><li> Cronometrada embarazadas ratones son sacrificados en el día postcoitum 11,5 o 12,5 (E11.5-12.5) de CO 2 narcosis de acuerdo con las directrices del NIH y OLAW. El animal se coloca en una cámara y un 100% de CO 2 se introduce. Después de que el animal está inconsciente el flujo de CO2 es mayor. La muerte clínica del animal debe estar garantizada. </li><li> Todos los pasos siguientes deben ser cumplidos bajo condiciones estériles en una campana de flujo laminar. Se extirpa el útero de las hembras preñadas. Para extirpar el útero del animal, las mujeres embarazadas se colocan en la espalda y se rocían con etanol al 70%. Se hace una incisión en el abdomen y la piel se quita tirando de la piel hacia arriba, manteniendo las patas traseras del animal. La cavidad peritoneal se abre y se extirpa el útero del animal. </li><li> La sangre se aclara mediante la colocación de la matriz en un tubo cónico de 50 ml llena de solución salina fría Hanks equilibrada (HBSS), y el tubo se mecía suavemente durante 2 minutos. </li><li> El útero se coloca en una placa de Petri bajo el microscopio estereoscópico de disección, y los embriones dado de alta del útero mediante una incisión en la pared del útero con unas tijeras de primavera. Los embriones se recogen con una cuchara perforada y se coloca en hielo en una nueva placa de Petri que contiene HBSS. </li><li> Bajo el microscopio estereoscópico de disección, pulmones embrionarias se disecan uno por uno en una placa de Petri que contiene HBSS frío (Figura 1). </li><li> El pulmón de embriones aislados se coloca en el hielo en un plato de Petri que contiene HBSS con una pipeta de transferencia estéril. </li></ol> 2. Cultura de pulmón embrionario <ol><li> 500 microlitros de 1 mililitro por pocillo de D-MEM/F-12 suplementado con 50 unidades / ml de penicilina-estreptomicina, se añade en una placa de poliestireno Nunclon. </li><li> A Nuclepore policarbonato pista Etch membrana se coloca en la parte superior de los medios de comunicación. Cuando el Nuclepore policarbonato pista Etch membrana se coloca en la parte superior de los medios de comunicación, asegúrese de que el lado brillante contra los medios de comunicación, y cara rugosa está hacia arriba. </li><li> Un pulmón disecados embrionarias se coloca en la parte superior de la pista Nuclepore policarbonato-Etch membrana con una pipeta de transferencia estéril. </li><li> La posición de pulmón embrionario se ajusta con las pinzas. Pulmón embrionario colocado en el filtro debe tener una traquea intactos y se coloca con su tráquea con una posición recta, permitiendo así que todos los pulmones que tiene la misma presión interna. </li><li> El plato de poliestireno Nunclon se transfiere por el momento la cultura deseada en una incubadora de células (Figura 2). </li></ol> 3. Materiales 1. Aislamiento embrionarias todo el pulmón <ol><li> Tiempo de espera del embarazo (C57BL6 tipo salvaje o transgénicos) en ratones que se sacrificaron el día postcoitum 11,5 a 13,5 (E11.5-13.5). </li><li> Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) (1X), líquido, sin cloruro de calcio, cloruro de magnesio o sulfato de magnesio. (Invitrogen, Carlsbad, CA), complementado con 50 unidades / ml de penicilina-estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Guarde el HBSS a temperatura ambiente ya 4 ° C después de la apertura. Alícuota y almacenar la penicilina-estreptomicina a -20 ° C. </li><li> Microscopio estereoscópico de disección (Leica, Wetzlar, Alemania). </li><li> Herramientas de disección incluyendo Dumont pinzas, tijeras iris Artes (recto), tijeras Noyes primavera y Moria cuchara ® (perforada) (Herramientas de Bellas Ciencia, Foster City, CA). </li></ol> 2. Cultura embrionarias todo el pulmón <ol><li> Dulbecco modificado del medio Eagle: mezcla de nutrientes F-12 (D-MEM/F-12) (1X), líquido, 01:01 Contiene L-glutamina, pero no tampón HEPES. (Invitrogen, Carlsbad, CA), complementado con 50 unidades / ml de penicilina-estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Mantenga la botella DMEM/F-12 lejos de la luz (por ejemplo, cubiertas con papel de aluminio) y se almacenan a 4 ° C. Alícuota y almacenar la penicilina-estreptomicina a -20 ° C. </li><li> Nuclepore policarbonato pista Etch de membrana, de 8,0 m, 13 mm (Whatman Nuclepore pista Etch membrana (Whatman, Florham Park, NJ). </li><li> Nunclon plato de poliestireno con tapas, 4 pozos (Rochester, NY). </li><li> Pipetas desechables de transferencia, estéril (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2035/2035fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. La disección de los pulmones E12 embrionarias. (A) E12.5 embrión todo visto desde el lado derecho (B). Extremidad anterior derecha ha sido removido del embrión. (C) Pinzas en poder de la mano izquierda sostiene el embrión constante en el plato. Las flechas indican el plan de la disección (D) de pulmón embrionario se encuentra por detrás del corazón (eliminado) Y por delante de la columna vertebral. Esta figura muestra los pulmones después de la piel y eliminación de corazón. (E) eliminación de la faringe permite la separación del pulmón intacto desde el embrión. (F) los tejidos extraños faringe y el esófago se recorta. Disecados E12.5 pulmón embrionario con la tráquea y la laringe intacta se muestra. (Cr) del lóbulo craneal, (Med) lóbulo (Ca) del lóbulo caudal, (Acc) lóbulo accesorio, (Le) del lóbulo izquierdo. <img src="/files/ftp_upload/2035/2035fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. FGF9 induce la expansión del mesénquima y la dilatación del epitelio en el pulmón cultivadas in vitro. (AC) E12.5 pulmón se cultiva durante 48 horas en ausencia de FGF9. Tenga en cuenta el aumento de la ramificación. (DF) E12.5 pulmón crecido durante 48 horas en presencia de FGF9. Tenga en cuenta la dilatación del epitelio y el mesénquima tan temprano como a las 24 horas de cultivo (E). Después de 48 horas (F), el efecto sobre el epitelio es aún más pronunciada. Barra de escala: AF 400 m 4. El protocolo de texto completo de este enfoque experimental está disponible en <a href="http://springerprotocols.com/Abstract/doi/10.1007/978-1-59745-019-5_5">los Protocolos Springer</a> .

<ol><li>Alescio, T., Cassini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+in+vitro+of+tracheal+buds+by+pulmonary+mesenchyme+grafted+on+tracheal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Induction in vitro of tracheal buds by pulmonary mesenchyme grafted on tracheal epithelium.</a> J Exp Zool. 150, 83-94 (1962).</li>
<li>Warburton, D., Schwarz, M., Tefft, D., Flores-Delgado, G., Anderson, K. D., Cardoso, W. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+lung+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of lung morphogenesis.</a> Mech Dev. 92, 55-81 (2000).</li>
<li>Spooner, B. S., Hardman, P., Paulsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gravity+in+mammalian+organ+development%3A+differentiation+of+cultured+lung+and+pancreas+rudiments+during+spaceflight%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Gravity in mammalian organ development: differentiation of cultured lung and pancreas rudiments during spaceflight.</a> J Exp Zool. 269, 212-222 (1994).</li>
<li>Moral, del, M, P., De Langhe, S. P., Sala, F. G., Veltmaat, J. M., Tefft, D., Wang, K., Warburton, D., Bellusci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+role+of+FGF9+on+epithelium+and+mesenchyme+in+mouse+embryonic+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential role of FGF9 on epithelium and mesenchyme in mouse embryonic lung.</a> Dev Biol. 293, 77-89 (2006).</li>
<li>Moral, D. el, M, P., Sala, F. G., Tefft, D., Shi, W., Keshet, E., Bellusci, S., Warburton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-A+signaling+through+Flk-1+is+a+critical+facilitator+of+early+embryonic+lung+epithelial+to+endothelial+crosstalk+and+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis.</a> Dev Biol. 290, 177-188 (2006).</li>
<li>Jaskoll, T. F., Don-Wheeler, G., Johnson, R., Slavkin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+mouse+lung+morphogenesis+and+type+II+cytodifferentiation+in+serumless%2C+chemically+defined+medium+using+prolonged+in+vitro+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Differ%22%5BJournal%5D)">Embryonic mouse lung morphogenesis and type II cytodifferentiation in serumless, chemically defined medium using prolonged in vitro cultures.</a> Cell Differ. 24, 105-117 (1988).</li>
<li>Seth, R., Shum, L., Wu, F., Wuenschell, C., Hall, F. L., Slavkin, H. C., Warburton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+epidermal+growth+factor+expression+in+early+mouse+embryo+lung+branching+morphogenesis+in+culture%3A+antisense+oligodeoxynucleotide+inhibitory+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of epidermal growth factor expression in early mouse embryo lung branching morphogenesis in culture: antisense oligodeoxynucleotide inhibitory strategy.</a> Dev Biol. 158, 555-559 (1993).</li>
</ol>

cultura de embriones de ratón de pulmón, un sistema para evaluar los mecanismos moleculares de la ramificación

Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching

Especificación de pulmón primordial, así como la morfogénesis de ramificación, y la formación de varios linajes de células pulmonares requiere una interacción específica del endodermo de pulmón con su mesénquima circundante y mesotelio. Mesénquima pulmonar ha demostrado ser la fuente de señales inductivas para la morfogénesis de pulmón ramificación. Epitelio-mesénquima-mesoteliales interacciones también son esenciales para la morfogénesis de pulmón embrionario. Principios de la cultura de órganos embrionarios de pulmón es un sistema muy útil para estudiar las interacciones epitelio-mesenquimal. Epiteliales y mesenquimales procede morfogénesis en condiciones específicas que pueden ser fácilmente manipulados en este sistema (en ausencia de la influencia de la madre y el flujo de sangre). Más importante que esta técnica puede ser fácilmente hecho en un medio de comunicación serumless, la cultura de constitución química definida. Ganancia y pérdida de la función se puede lograr utilizando las proteínas expresadas, vectores virales recombinantes y / o análisis de las cepas de ratones transgénicos, el ARN antisentido, así como la caída en la interferencia del ARN del gen.

Principios de la cultura de órganos embrionarios de pulmón es un sistema muy útil para estudiar las interacciones epitelio-mesenquimal. Epiteliales y mesenquimales procede morfogénesis en condiciones específicas que pueden ser fácilmente manipulados en este sistema.

Cultura de embriones de ratón de pulmón, un sistema para evaluar los mecanismos moleculares de la ramificación

La especificación primordial del pulmón, así como la morfogénesis ramificada y la formación de diversos linajes celulares pulmonares, requieren una interacción específica de...

En este video, se muestra un método para la disección y el cultivo de pulmones embrionarios de ratón. El procedimiento comienza con la obtención de embriones en E 11.5 o E 12.5. A continuación, se abren los embriones y se extraen los pulmones.A continuación, los pulmones se siembran en una interfase líquido-aire y se incuban tras el cultivo. Los cambios en el crecimiento y la ramificación del mesenquima y el epitelio del pulmón embrionario en respuesta a tratamientos específicos pueden observarse utilizando un microscopio estereoscópico. Hola, soy David War Burton.Dirijo el programa de biología del desarrollo y medicina regenerativa en el Instituto de Investigación Ban del Hospital Pediátrico de Los Ángeles. Y soy Jan Carro, posdoctorado sénior en el laboratorio de la Dra. War Burton. Hoy les mostraremos una técnica para aislar pulmón embrionario de ratón y colocarlo en cultivo de órganos.Esta técnica ha evolucionado a partir de la descripción original de Tina Jaco Halkin y Pablo, quienes nos la presentaron en la Escuela de Odontología de la USC hace aproximadamente 20 años. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la morfogénesis de la ramificación del cordero. Así que comencemos.El día 11,5 o 12,5 posterior al apareamiento, coloque una hembra preñada sacrificada con dióxido de carbono bajo una cabina de flujo laminar sobre su espalda. Rocíe con etanol al 70 %. Haga una incisión en el abdomen.Luego, sosteniendo las patas traseras del animal, retire la piel tirando hacia arriba. Abra la cavidad peritoneal y extraiga el útero. Coloque el útero en un tubo cónico de 50 mililitros lleno con solución salina equilibrada de Hanks o HBSS fría y agite suavemente durante dos minutos para eliminar la sangre.A continuación, transfiera el útero a una placa de Petri bajo un microscopio estereoscópico de disección. Con tijeras de resorte, corte la pared uterina para liberar los embriones. Luego, utilizando una cuchara perforada, recoja los embriones y colóquelos en una placa de Petri que contenga HBSS y coloque sobre hielo.Continúe trabajando bajo el microscopio estereoscópico de disección e inicie la disección de los pulmones embrionarios. Comience colocando el embrión sobre su lado izquierdo. Utilizando pinzas, retire la extremidad anterior derecha sosteniendo las pinzas con la mano izquierda.Corte el embrión comenzando desde la abertura de la extremidad y retire la piel. Este paso le permitirá observar los órganos internos y localizar el corazón y los pulmones para el siguiente paso. Retire el corazón.Los pulmones embrionarios se encuentran posteriores al corazón y anteriores a la columna vertebral. A continuación, separe el pulmón intacto del embrión. Luego, retire los tejidos extraños y el esófago.Una vez que los pulmones hayan sido extraídos, utilice una pipeta estéril para transferirlos a una placa de Petri que contenga HBSS frío sobre hielo. Añada a cada pocillo de una placa de poliestireno sin clonación delta entre 0,5 y un mililitro de D-M-E-M-F 12 suplementado con 50 unidades por mililitro de penicilina-estreptomicina. A continuación, coloque una membrana de policarbonato nucleopora con grabado por ataque químico encima del medio, con el lado brillante hacia abajo y el lado rugoso hacia arriba.Utilizando una pipeta estéril de transferencia, coloque un pulmón embrionario diseccionado encima de la membrana de policarbonato nucleopor con poros definidos por ataque químico. Con ayuda del microscopio estereoscópico, ajuste la posición del pulmón embrionario. El pulmón embrionario debe tener una tráquea intacta colocada en posición recta, como se muestra aquí.Esto asegura que todos los pulmones tengan la misma presión interna; transfiera el cultivo a una incubadora celular y cultive durante el tiempo deseado. Aquí, los pulmones de E 12.5 se cultivaron en presencia o ausencia de FGF nueve. FGF nueve es un miembro de la familia de factores de crecimiento de fibroblastos que induce la expansión del mesenquima y la dilatación del epitelio en pulmones cultivados in vitro después de 48 horas.En ausencia de FGF nueve, se observa un aumento en la ramificación. Estas imágenes son fotografías del pulmón embrionario tomadas bajo un microscopio estereoscópico. En contraste, los pulmones cultivados durante 48 horas en presencia de FGF nueve presentan epitelio dilatado y mechy.Después de 24 horas de cultivo. Después de 48 horas, el efecto sobre el epitelio es aún más pronunciado. Así que acaban de ver cómo preparar cultivos de órganos a partir del pulmón embrionario de ratón.Al realizar este procedimiento, es importante recordar retirar el pulmón del embrión lo más pronto posible para reducir la deterioración del tejido. Así que gracias por vernos. Esperamos que encuentre esta técnica útil.Buena suerte con sus experimentos.

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Investigación

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Biología

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