Generación de reconstrucciones organotípicas de piel completa: un procedimiento para establecer un modelo de piel en 3D utilizando muestras de piel humana

La piel consta principalmente de una capa epidérmica superior y una capa dérmica inferior. Las células epidérmicas se estratifican en múltiples capas que van desde las células menos diferenciadas presentes en la base hasta las células altamente diferenciadas en la periferia. Para hacer crecer un tejido cutáneo que imite los aspectos morfológicos y bioquímicos de la piel normal, podemos establecer un modelo organotípico de la piel.

Para comenzar, tome una placa de pocillos múltiples con un inserto membranoso. Agregue fibroblastos dérmicos mezclados con colágeno al inserto. Incubar para facilitar la solidificación de la matriz de colágeno para incrustar los fibroblastos e imitar el compartimento dérmico de la piel.

A continuación, agregue una suspensión de células de queratinocitos sobre la capa dérmica. Incubar la placa para permitir que los queratinocitos se adhieran al compartimento dérmico. Complementar el cultivo con un medio de epidermalización para iniciar la proliferación de queratinocitos y la formación de una capa epidérmica.

Finalmente, transfiera los insertos a una placa nueva de pocillos múltiples. Agregue un medio de estratificación tal que cubra solo la base de la construcción, creando así una interfaz aire-líquido. Tras la incubación, la interfaz aire-líquido facilita la diferenciación de los queratinocitos en una epidermis estratificada de varias capas.

En el siguiente protocolo, generaremos reconstrucciones organotípicas de piel en 3D con contrapartes dérmicas y epidérmicas a partir de células de piel humana aisladas.

Para generar la contraparte dérmica de las reconstrucciones de la piel, coloque insertos de membrana de 8 micrómetros del tamaño de los poros en una placa de cultivo celular de 24 pocillos. Para cada inserto, vuelva a suspender 100.000 fibroblastos en una solución de neutralización en gel. A continuación, mezcle rápidamente la suspensión de fibroblastos con colágeno tipo 1 en una proporción de 1:3 en un volumen final de 500 microlitros sin formar burbujas.

A continuación, utilice una pipeta para añadir la suspensión a cada inserto. Dentro de una campana estéril, coloque los insertos a temperatura ambiente sin medio durante 30 minutos para permitir que los geles dérmicos se asienten. A continuación, cubra los geles con DMEM e incube durante la noche a 37 grados centígrados.

Después de la incubación durante la noche, retire el DMEM de los geles dérmicos y equilibre con EGM durante 2 horas a 37 grados centígrados para generar la contraparte epidérmica de las reconstrucciones de la piel. A continuación, utilice una pipeta para eliminar el EGM de los geles.

A continuación, selle cuidadosamente 100.000 queratinocitos resuspendidos en 100 microlitros de EGM encima de cada gel. Incubar las reconstrucciones durante 1,5 horas a 37 grados centígrados para permitir que los queratinocitos se adhieran al gel dérmico. Con la punta de una pipeta, retire con cuidado el gel residual de la pared del inserto.

A continuación, se cubre cada reconstrucción con 800 microlitros de EGM y se cultiva durante 7 días a 37 grados centígrados en dióxido de carbono al 5%.

Retire con cuidado los residuos de gel de la pared del inserto con una pequeña punta de pipeta blanca.

El día 8, coloque los insertos en pocillos separados de una placa de 6 pocillos. A continuación, agregue de 1,2 a 1,4 mililitros de medio para melanoma metastásico a cada pocillo para cubrir solo la base de la reconstrucción de la piel. Luego, incubar durante 10 a 17 días a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono.

• 3D Skin Models - Three-dimensional constructs mimicking natural skin structures
• Human Skin Samples - Biopsy samples of human skin used for scientific study.
• Epidermalization - The process of keratinocyte proliferation and formation of an epidermal layer.
• Organotypic Skin Culture - A method to grow skin tissues that mimic normal skin.
• Reconstructs - 3D skin models created from isolated human skin cells.

• Introduce 3D Skin Models: These are laboratory-grown structures that mimic the natural layers of skin (e.g., human skin samples).
• Key Concepts: They involve processes like epidermalization, that replicate skin cell behaviour (e.g., epidermalization).
• Underlying Mechanisms: The constructs are created by embedding cells in collagen and refining them in different stages.
• Connect to Experiment: The experiment involves creating an organotypic skin culture using a multi-well plate and cell substances.

• What are 3D Skin Models and how are they established (including organotypic skin culture)?
• What does the process of epidermalization entail?
• What are the mechanisms used in creating skin reconstructs?

• Describe Practical Applications: 3D skin models are vital in dermatological research and skincare product testing (e.g., 3D skin models).
• Industry Impact: They greatly influence sectors like healthcare and cosmetology (e.g., human skin samples).
• Societal Importance: Advancements in skin models can benefit personalized medicine and reduce animal testing (e.g., reconstructs).
• Link to Scientific Advancements: They enable understanding of skin diseases and testing of potential treatments.