HCR-DNA FISH: Una técnica de hibridación fluorescente in situ para detectar ADN viral en células infectadas

- HCR-FISH, o reacción en cadena de hibridación-hibridación fluorescente in situ, detecta secuencias de ácidos nucleicos virales dentro del genoma de células infectadas por virus. Para empezar, fije un cultivo adherente de células infectadas por virus y permeable su membrana celular. Incubar las células con un tampón de hibridación para reducir cualquier señal de fondo. Trate las células con sondas iniciadoras que lleven una secuencia iniciadora HCR y una secuencia complementaria dirigida al ADN viral. Calentar la muestra para desnaturalizar el ADN bicatenario del huésped a ADN monocatenario. Incubar la muestra para permitir que la sonda se una a su secuencia de ADN viral objetivo complementaria.

A continuación, trate con un tampón de amplificación que contenga dos juegos de sondas de horquilla de oligonucleótidos marcadas con fluorescencia, H1 y H2. Incubar para facilitar la reacción en cadena de hibridación. La secuencia iniciadora desapareada se une a su cola H1 complementaria, linealizando la estructura de horquilla. La secuencia H1 expuesta se une de manera similar a su cola H2 complementaria. El H2 que se arrastra continúa uniéndose a una cola H1. De esta manera, las sondas m