HCR-DNA FISH: Una técnica de hibridación fluorescente in situ para detectar ADN viral en células infectadas

- HCR-FISH, o reacción en cadena de hibridación-hibridación fluorescente in situ, detecta secuencias de ácidos nucleicos virales dentro del genoma de células infectadas por virus. Para empezar, fije un cultivo adherente de células infectadas por virus y permeable su membrana celular. Incubar las células con un tampón de hibridación para reducir cualquier señal de fondo. Trate las células con sondas iniciadoras que lleven una secuencia iniciadora HCR y una secuencia complementaria dirigida al ADN viral. Calentar la muestra para desnaturalizar el ADN bicatenario del huésped a ADN monocatenario. Incubar la muestra para permitir que la sonda se una a su secuencia de ADN viral objetivo complementaria.

A continuación, trate con un tampón de amplificación que contenga dos juegos de sondas de horquilla de oligonucleótidos marcadas con fluorescencia, H1 y H2. Incubar para facilitar la reacción en cadena de hibridación. La secuencia iniciadora desapareada se une a su cola H1 complementaria, linealizando la estructura de horquilla. La secuencia H1 expuesta se une de manera similar a su cola H2 complementaria. El H2 que se arrastra continúa uniéndose a una cola H1. De esta manera, las sondas marcadas con fluorescentes amplifican alrededor del sitio objetivo, emitiendo una señal fuerte. Tratar la muestra con DAPI para teñir los núcleos celulares.

Utilice un microscopio de fluorescencia para detectar la fluorescencia brillante de los focos de replicación dentro de los núcleos de las células infectadas. En el siguiente protocolo, mostraremos in situ HCR-DNA FISH para detectar el genoma del poliomavirus de células de Merkel en células primarias de piel humana infectadas.

- Primero, fije las celdas en cubreobjetos con 4% de PFA en PBS durante 10 minutos. A continuación, lave los cubreobjetos dos veces con PBS y trátelos con etanol al 70% a 4 grados centígrados durante la noche para permeabilizar las células. Al día siguiente, reemplace el etanol con tampón de hidratación de la sonda e incube a temperatura ambiente durante 60 minutos para prehibridar las muestras. 30 minutos antes del final de la incubación previa a la hibridación, diluir las sondas en la solución de hibridación de la sonda a una dilución de 1:500 e incubar a 45 grados centígrados.

Cuando se completen las incubaciones, pipetee aproximadamente 10 microlitros de la mezcla de sonda diluida en un portaobjetos de microscopio para cada cubreobjetos. Coloque cada cubreobjetos, con la célula hacia abajo, sobre su respectiva gota de mezcla de hibridación. Usando una cantidad generosa de cemento de caucho, selle los bordes y la parte posterior de cada cubreobjetos a su corredera. Coloque los portaobjetos en el lado plano de un bloque de calor y caliéntelos a 94 grados centígrados durante 3 minutos. Después de esto, transfiera los portaobjetos a una cámara humidificada e incube a 45 grados centígrados durante la noche.

Al día siguiente, use pinzas para despegar con cuidado el cemento de caucho. Coloque los cubreobjetos, con la celda hacia arriba, en los pocillos de una placa de 24 pocillos y lávelos con tampón de lavado de la sonda tres veces a temperatura ambiente. Agregue 200 microlitros de tampón de amplificación a cada pocillo que contenga un cubreobjetos e incube a temperatura ambiente durante 30 a 60 minutos. Mientras tanto, recociendo cada una de las dos horquillas de oligonucleótidos marcadas reconociendo las sondas en tubos de PCR separados calentándolos a 95 grados Celsius durante 90 segundos y luego enfriándolos a temperatura ambiente durante 30 minutos. Mezcle las horquillas en un tampón de amplificación a una dilución de 1:50.

A continuación, estire la película de parafina sobre la cara abierta de una tapa de placa de 12 pocillos para crear una superficie para la reacción de amplificación. Pipetee de 50 a 100 microlitros gotas de la mezcla de horquilla en la película de parafina para cada cubreobjetos. Con pinzas, retire con cuidado cada cubreobjetos de la solución de preamplificación y toque el borde con una toallita desechable porosa para que se seque. Coloque cada cubreobjetos secos, con la celda hacia abajo, sobre una gota de amplificación. Transfiera la tapa de la placa a una cámara humidificada e incube durante la noche a temperatura ambiente y en la oscuridad.

Al día siguiente, devuelva los cubreobjetos a los pocillos de la placa de 24 pocillos. Agregue 5 veces DAPI que contenga SSCT a una concentración de 0,5 microgramos por mililitro a cada pocillo e incube a temperatura ambiente durante una hora. Después de esto, lave las muestras dos veces con 5x SSCT a temperatura ambiente. Monte los cubreobjetos lavados en portaobjetos de microscopio y utilice un microscopio de fluorescencia invertida para analizar las células y obtener imágenes de las muestras.