Preparación del virión del poliomavirus recombinante de células de Merkel (MCPyV): una técnica para producir un virión MCPyV recombinante de alto título

- El poliomavirus de células de Merkel, o MCPyV, es un oncovirus de ADN bicatenario con un genoma circular que causa carcinoma de células de Merkel, un tipo de cáncer de piel. Para preparar los viriones de MCPyV, primero se debe tratar un cultivo adherente de células de empaquetamiento con un cóctel que contiene un agente de transfección, el genoma viral, y dos plásmidos de expresión que codifican proteínas necesarias para promover la replicación viral.

Durante la incubación, el reactivo de transfección forma lypoplexes con los plásmidos, lo que facilita su entrega a las celdas de empaquetamiento. Una vez dentro del núcleo, la maquinaria celular permite la expresión de los genomas viral y plásmido. Los plásmidos de expresión codifican proteínas de antígeno de tumor grande y antígeno de tumor pequeño. Estas proteínas se translocan al núcleo e impulsan la replicación del ADN viral. Posteriormente, el genoma viral codifica proteínas estructurales de la cápside. Estas proteínas se mueven hacia el núcleo y ayudan en el ensamblaje de viriones recombinantes.

A continuación, coseche las células cultivadas. Trátelos con una solución que contenga detergente y DNasa. El detergente lisa las células para liberar los virus. La DNasa degrada cualquier ADN plasmídico libre de la suspensión. Centrífuga para separar los residuos celulares en el pellet. Cargue el sobrenadante que contiene el virus en un tubo que lleve un medio de gradiente de densidad adecuado. Centrífuga para obtener fracciones concentradas ricas en viriones dentro del medio de gradiente.

En el siguiente protocolo, mostraremos la preparación de viriones MCPyV recombinantes de alto título utilizando células 293TT.

- Al final de la tarde o por la noche, siembre 6 millones de células 293TT-28 en un plato de 10 centímetros que contenga medio DMEM suplementado. Incubar a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. A la mañana siguiente, asegúrese de que las células tengan aproximadamente un 50% de confluente. A continuación, transfecte las células con 66 microlitros de reactivo de transfección, 12 microgramos de ADN R17b aislado de MCPyV religado, 8,4 microgramos de plásmido de expresión ST pMtB y 9,6 microgramos de plásmido de expresión LT pADL. Incubar las células durante la noche a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono.

Al día siguiente, cuando las células transfectadas estén casi confluentes, tripsinícelas y transfiéralas a una placa de 15 centímetros para una expansión continua. Cuando esa placa esté casi confluente, transfiera las células a tres nuevas placas de 15 centímetros. Cuando esos nuevos platos se vuelvan casi confluentes, recoja las células como se describe en el protocolo de texto. Centrifugar a 180 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos. A continuación, retire el sobrenadante y añada 1 volumen de célula de DPBS-Mg.

Agregue 25 micromolares de sulfato de amonio, seguido de Triton X-100 al 0,5%, Benzonase al 0,1% y DNasa dependiente de ATP al 0,1%. Mezclar bien e incubar a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, enfríe la mezcla en hielo durante 15 minutos. A continuación, agregue 0,17 volumen de cloruro de sodio. Mezclar e incubar en hielo durante otros 15 minutos. Centrifugar a 12000 x g a 4 grados centígrados durante 10 minutos. Si el sobrenadante no es transparente, invierta suavemente el tubo y repita la centrifugación.

Después de esto, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo. Vuelva a suspender el pellet en un volumen de DBPS suplementado con 0,8 moles de cloruro de sodio. Centrifugar a 12000 x g a 4 grados centígrados durante 10 minutos. Si el sobrenadante no es transparente, invierta suavemente el tubo y repita la centrifugación. Combine los dos sobrenadantes y vuelva a centrifugar a 12000 x g a 4 grados centígrados durante 10 minutos.

A continuación, utilice una pipeta para depositar gradientes de yodixonal en tubos de polialómero de 5 mililitros de paredes delgadas, tal y como se indica en el protocolo de texto. Cargue 3 mililitros del sobrenadante clarificado que contiene virus sobre el gradiente yodiconal preparado. Centrífuga con un rotor SW55ti a 234.000 x g y a 16 grados centígrados durante 3,5 horas, asegurándose de ajustar la aceleración y la desaceleración a la velocidad. Una vez completada la ultracentrifugación, recoja 12 fracciones en tubos siliconados.