Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Investigación sobre el cáncer
0 visualizaciones • 4:07 min. • April 30th, 2023
- Los queratinocitos son el tipo de célula prominente presente en la epidermis o la capa más externa de la piel. Para modificar genéticamente los queratinocitos, se debe comenzar con un cultivo de células fénix de empaquetamiento retroviral. Posteriormente, se añade una mezcla que contenga vectores retrovirales portadores del gen de interés y un reactivo de transfección. Incube la placa durante el tiempo deseado.
El reactivo de transfección facilita la entrega de material genético viral a las células de empaquetamiento. Estas células específicamente diseñadas codifican proteínas necesarias para la producción de cápside retroviral y promueven el empaquetamiento del ARN del vector retroviral que lleva el gen de interés. Al empaquetarse, los virus maduros salen de las células hacia el medio. Ahora, transfiera los medios suspendidos por el virus a una placa de cultivo fresca que contenga queratinocitos primarios. Aumente el cultivo con una solución de polímero catiónico deseada.
El polímero catiónico neutraliza las cargas negativas en las membranas virales y de queratinocitos, aumentando la eficiencia de la fusión viral con la superficie celular. Tras la fusión, el virus libera su ARN en el citoplasma de la célula, que se transcribe a su inversa en ADN bicatenario. Este ADN viral entra en el núcleo y se integra con el genoma de los queratinocitos, lo que provoca alteraciones genéticas. En el siguiente protocolo, mostraremos la modificación genética de queratinocitos humanos primarios mediante transfección retroviral.
- El día antes de la transfección, siembre las células fénix en medios completos en una placa de 6 pocillos a una densidad de 800.000 células por pocillo. El día de la transfección, mezcle 6 microlitros de reactivo de transfección con 100 microlitros de DMEM para cada pocillo a transfectar e incube a temperatura ambiente durante 5 minutos. Agregue la mezcla a un tubo que contenga 3 microgramos de vector retroviral por cada pocillo a transfectar e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. Agregue toda esta mezcla gota a gota a cada pocillo de las células fénix e incube las celdas durante la noche.
Al día siguiente de la transfección, retire los medios de las células fénix y agregue 2 mililitros de medios completos frescos. El mismo día, resuspenda los queratinocitos humanos primarios en medio libre de suero de queratinocitos con antibióticos y siembra en placas de 6 pocillos a una densidad de 75.000 células por pocillo.
Al día siguiente, cosecha el medio, que ahora contiene partículas virales de las células de fénix transfectadas. Pase el medio a través de un filtro de 0,45 micras con una jeringa para eliminar cualquier célula contaminante. Agregue 5 microgramos por mililitro de bromuro de hexadimetrina al medio filtrado que contiene virus para ayudar a mediar el proceso de infección.
A continuación, pipetear 2 mililitros del virus sobre los queratinocitos sembrados el día anterior. A continuación, gire las placas de 6 pocillos en una centrífuga a 200 x g durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del centrifugado, retire y deseche los medios que contienen virus. Lave las celdas una vez con 1x PBS y luego agregue KCSFM fresco. Al día siguiente, infecte el mismo lote de queratinocitos con el virus utilizando el procedimiento que se acaba de mostrar.