Transgénesis basada en vectores miniCoopR: una técnica para detectar genes inductores de melanoma en un modelo de tumor de pez cebra

- En el pez cebra, el melanoma surge de la transformación maligna de los melanocitos, las células productoras de melanina. Para estudiar la aparición del melanoma, utilice un modelo de pez cebra transgénico propenso al melanoma y con deficiencia de melanocitos. Este modelo carece de melanocitos debido a una mutación de pérdida de función en su promotor mitfa específico de melanocitos.

Comience tomando un embrión unicelular de este modelo transgénico en una placa de agar. Coinyectar en el embrión una mezcla que contenga un vector miniCoopR basado en transposones y ARNm de la enzima transposasa. El vector contiene un casete de genes, que comprende un minigen mitfa portador de promotor acoplado a un gen candidato intercalado entre dos elementos de transposón.

Los ARNm coinyectados codifican proteínas transposasas. Estas proteínas actúan sobre los elementos del transposón y catalizan la escisión del casete del vector miniCoopR, seguida de su integración en el ADN genómico del embrión. Posteriormente, el promotor del casete impulsa la expresión tanto del gen mitfa como del gen candidato de interés.

El gen mitfa favorece el rescate y el desarrollo de los melanocitos, mientras que el gen candidato, si es oncogénico, induce la aparición del melanoma. Examina el pez cebra desarrollado. Los peces transgénicos con melanocitos rescatados desarrollan pigmentación de melanina, mientras que los que tienen melanomas portan lesiones pigmentadas elevadas.

En el siguiente protocolo, mostraremos el cribado de modificadores de inicio de melanoma utilizando vectores miniCoopR en modelos tumorales de pez cebra transgénicos.

- Para generar constructos para inyectar, comience por crear clones de entrada intermedia de Gateway mediante PCR que amplifiquen el marco de lectura abierto de longitud completa de los genes de interés y lo recombinen en pDONR221. A continuación, utilice la tecnología de puerta de enlace multisitio para recombinar el promotor de mitfa específico del melanocito, el gen de interés y la señal de poliadenilación en el vector miniCoopR para colocar los genes de interés bajo el control del promotor de mitfa.

Inyecte 25 picogramos de cada clon junto con 25 picogramos de ARNm de la transposasa Tol2 en embriones de pez cebra trihomocigotos, transgénicos y unicelulares. Los animales mutantes mitfa-BRAF-p53 son deficientes en melanocitos y propensos a la transformación y formación de melanoma. Junto con el gen de interés, el vector miniCoopR contiene un minigen mitfa de rescate. Por lo tanto, los animales inyectados con éxito desarrollarán melanocitos rescatados, que expresan el gen de interés.

Incubar los embriones inyectados a 28,5 grados centígrados. A las 24 horas después de la fertilización, o hpf, retire los embriones muertos. A las 72 horas después de la fertilización, utilizando un microscopio de disección bajo luz incidente sobre un fondo blanco, se seleccionaron animales transgénicos con melanocitos rescatados.

Cuando los animales alcancen los 4 días después de la fertilización, transfiéralos a tanques de 3 litros en el vivero de la instalación de pez cebra. A los 2 meses de edad, seleccione los animales con al menos un área de rescate de melanocitos mayor de 4 milímetros cuadrados. Examinar semanalmente a los animales seleccionados para detectar la presencia de tumores. Aísle animales portadores de tumores para su estudio.

Traza curvas de supervivencia libre de melanoma con la edad y las semanas en la abscisa y el porcentaje de supervivencia libre de melanoma en la ordenada. Comparar animales con melanocitos que expresan un gen de interés para controlar animales que expresan EGFP en melanocitos. Utilice una prueba de rango logarítmico para determinar si las dos curvas son estadísticamente diferentes.