JoVE Encyclopedia of Experiments
Investigación sobre el cáncer
0 vistas • 3:45 min • April 30th, 2023
- Los factores de transcripción son proteínas que contienen dominios de unión al ADN. Se unen a secuencias específicas de ADN y ayudan a regular la expresión génica en las células. Para detectar la expresión del factor de transcripción en los melanocitos asociados a las escamas, primero se deben recolectar escamas dorsales pigmentadas oscuras de un pez cebra anestesiado. Fije las escamas y trátelas con una solución de permeabilización para que los melanocitos individuales sean permeables.
Tratar con una solución de lejía para eliminar los gránulos de pigmento de melanina oscura de las células. Este proceso de blanqueo elimina las posibilidades de que se produzcan señales de fondo asociadas al pigmento durante los siguientes pasos de tinción. Incubar con una solución de bloqueo que contenga proteínas para bloquear los sitios de unión a proteínas no específicos en la superficie celular.
Ahora, trate la muestra con los anticuerpos primarios deseados. Estos anticuerpos se unen a sus factores de transcripción diana dentro de las células. A continuación, etiquete la muestra con anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia específicos para los anticuerpos primarios. Además, trate la muestra con un tinte fluorescente de unión al ADN adecuado para teñir los núcleos celulares. Utilice un microscopio de fluorescencia para detectar emisiones fluorescentes brillantes de los complejos factor de transcripción-anticuerpo y los núcleos celulares.
En el siguiente protocolo, mostraremos la inmunotinción de melanocitos asociados a escamas dorsales que expresan el factor de transcripción inductor de melanocitos-A, o mitfa, en un pez cebra transgénico.
- Para realizar la inmunotinción, anestesiar al pez en 0,17 miligramos por mililitro de Tricaína. Con luz incidente bajo un microscopio de disección, use pinzas afiladas de punta fina para arrancar las escamas dorsales, teniendo cuidado de no dañar la mitad de la escama que contiene melanocitos. Coloque las escamas directamente de las pinzas en 1 mililitro de fijador e incube a temperatura ambiente, mientras gira, durante más o igual a 2 horas. Transfiera los peces al agua de los peces y monitoree a los peces para confirmar la recuperación exitosa.
Para blanquear los melanocitos pigmentados, primero, lave las escamas fijas en PBST dos veces durante 5 minutos a temperatura ambiente. A continuación, agregue 1 mililitro de solución de lejía recién hecha y cúbrala con parafilm o cierres de tapa para evitar que el gas reviente los tubos. Continúa decolorando hasta que el pigmento desaparezca. Luego, lave en PBST cuatro veces durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Incubar durante al menos 30 minutos en solución de bloques. Luego, incube con aproximadamente 400 microlitros de anticuerpo primario en solución en bloque durante la noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, lave las básculas tres veces durante 30 minutos en PBST a temperatura ambiente. Incubar con anticuerpo secundario durante 2 horas o toda la noche a temperatura ambiente.
Después de teñir con DAPI, aplique una gota de vectashield a un portaobjetos de vidrio y monte las escamas de modo que el lado cóncavo de las escamas quede hacia abajo contra el portaobjetos. Coloque una cubierta de vidrio sobre las muestras. Use esmalte de uñas transparente para sellar los bordes y observe los portaobjetos bajo un microscopio de fluorescencia.