Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Investigación sobre el cáncer
0 visualizaciones • 4:05 min. • April 30th, 2023
- Durante el ensayo de trasplante de melanoma, las células cancerosas del pez cebra portador de tumores se trasplantan a un modelo de receptor inmunocomprometido para estudiar el desarrollo del tumor. Comience por tomar un pez cebra donante con tumor eutanasiado y resecar quirúrgicamente el tumor de su cuerpo. Transfiera el tumor a una placa de Petri que contenga un tampón adecuado y píquelo en trozos pequeños.
A continuación, triture los fragmentos tumorales con una pipeta. Esto disocia las piezas tumorales en células individuales. Ahora, cargue la suspensión de células tumorales en una jeringa. Posteriormente, prepare un pez cebra Casper receptor inmunodeprimido en un papel de filtro. Esta variante mutante del pez cebra con deficiente pigmentación carece de melanocitos e iridóforos, lo que la hace transparente y versátil para experimentos de imagen y trasplante.
A continuación, inyecte la suspensión de células de melanoma precargada por vía subcutánea en la región por encima de la cavidad peritoneal, a medio camino entre el cerebro posterior y la aleta dorsal del pez cebra Casper. Ahora, transfiera el pez receptor al agua y vigílelo para observar el desarrollo del tumor. El cuerpo transparente del pez cebra ayuda a la fácil visualización de los tumores desarrollados.
En el siguiente protocolo, mostraremos el trasplante de células de melanoma de un donante de pez cebra transgénico portador de tumor a un modelo de pez Casper receptor inmunocomprometido.
- Después de irradiar al pez Casper receptor de 2 a 3 meses de edad con 25 Gy de irradiación gamma un día antes del trasplante, permita que el pez se recupere en el agua de los peces. Use tricaína para sacrificar a un pez portador de tumores. Corte el tumor y colóquelo en una placa de Petri con aproximadamente 5 mililitros de filtro esterilizado 0.9x PBS con 5% de FPS. Con una navaja, corte el tumor en dados mientras está en solución.
Trabajando a temperatura ambiente y con una pipeta P1000, triture para producir células individuales. Sube el volumen a 25 mililitros. Filtre la solución a través de un filtro de malla de 40 micrómetros y centrifuga en una centrífuga de mesa a 453 rcf durante 10 minutos. Vuelva a suspender el pellet en 0,9% PBS, 5% FBS hasta la concentración deseada.
Con un hemocitómetro, calcule el número exacto de células y diluya la suspensión celular para que el volumen final de inyección sea de aproximadamente 5 microlitros. Por ejemplo, si se van a inyectar 50.000 células, la suspensión celular debe diluirse hasta una concentración final de 10.000 células por microlitro. Agite el tubo que contiene la suspensión celular cada pocos minutos para evitar la aglomeración de las células.
Con 100% de etanol y 0,9x PBS, lave una jeringa Hamilton 701 N de 10 microlitros de calibre 26s (punta biselada) de 2 a 3 veces antes de cargar la jeringa con 5 microlitros de la suspensión de celdas. Después de anestesiar el pez receptor irradiado en tricaína, colóquelo de lado sobre una toallita Kimwipe húmeda.
Estabilice el pez con una mano e inserte la aguja con el bisel hacia arriba en un ángulo de 45 grados en el flanco del pez por encima de la cavidad peritoneal, aproximadamente a mitad de camino entre el límite posterior del cerebro posterior y el borde interior de la aleta dorsal. Permita que los peces se recuperen en agua dulce y observe a los peces diariamente para detectar el injerto tumoral. Si se ha producido un injerto, también se puede observar un crecimiento continuo y el desarrollo de la enfermedad.