Registro del comportamiento multicelular en Myxococcus xanthus Las biopelículas con Time-lapse Microcinematography
6 de agosto de 2010
Para el estudio de Myxococcus xanthus Comportamiento de enjambre, hemos diseñado un protocolo microcinematography lapso de tiempo que puede ser modificado para diferentes ensayos. Emplea a las condiciones normales de crecimiento adaptado para la microscopía, y con resultados reproducibles mediante el uso de empaques de bajo costo, de silicona reutilizables. Hemos utilizado este método para cuantificar la quimiotaxis multicelulares.
El objetivo general del siguiente experimento es desarrollar un ensayo de cinematografía micros de lapso de tiempo barato con suficiente rigor para generar resultados reproducibles y cuantificables. Esto se logra empleando el uso de juntas de silicona reutilizables de bajo costo para construir placas de medios agrícolas o portaobjetos de microscopio. Se obtienen resultados que muestran que estos complejos de placas permanecen hidratados y suficientemente oxigenados durante más de una semana en una variedad de tipos de medios y concentraciones de agar.
Además, debido a que la microcinematografía de lapso de tiempo es un proceso lento, el uso de ocho microscopios económicos ayuda a acelerar la adquisición de datos. Hola, soy Ryan Taylor del laboratorio del Dr. Roy Welch del Departamento de Biología de la Universidad de Syracuse. Hoy le mostraremos un procedimiento para hacer películas de lapso de tiempo de biopelículas bacterianas en nuestro laboratorio, usaremos este procedimiento para estudiar el comportamiento multicelular de las biopelículas de MTI.
Así que comencemos. Para comenzar este procedimiento, mida la densidad celular de un cultivo de Occus sanus mezclado durante la noche con un medidor clut, transfiera un mililitro del cultivo a un tubo de centrifugación de 2,5 mililitros de pellet y resuspenda las bacterias en medios TPM como se describe en el protocolo escrito adjunto, pipeta y vórtice para resuspender completamente el pellet, lo que puede llevar un tiempo. A continuación, agregue 0,5 gramos de aros a 50 mililitros de TPM, que es el medio de ensayo.
También agregue 0,5 gramos de aros a 50 mililitros de C-T-T-Y-E, que es el autoclave de medios de disco nutritivo para esterilizar. A continuación, mantenga el medio a 55 grados centígrados en una incubadora o baño de agua. Durante la construcción del ensayo de seguimiento.
Los complejos de placas proceden a construir el microscopio de vidrio esterilizador de primera llama de disco nutritivo. Deslice y coloque una junta estéril de caucho de silicona de 0,5 milímetros de grosor en la parte superior del portaobjetos. Las pipetas de alrededor de 300 microlitros de medios C TT YE se introducen en el pozo creado por la junta en la corredera.
El C-T-T-Y-E media agro debe amontonar llamas, esterilizar otro portaobjetos y colocarlo en ángulo sobre los medios C-T-T-Y-E. Colocar la corredera en ángulo evita la formación de burbujas. Una vez que la diapositiva esté en su lugar, rellene el complejo con mini clips de carpeta uno a cada lado.
Coloque el complejo recortado a cuatro grados centígrados y deje que el C-T-T-Y-E media agro se asiente. Esto suele tardar unos cinco minutos. Una vez que se establece el agro, se pueden preparar los complejos de placas utilizados en el ensayo de seguimiento.
Comience por preparar las láminas para construir los complejos de ensayo. Para cada llama compleja se esterilizaron dos portaobjetos de microscopio de vidrio. Coloque una junta de autoclave en la parte superior de uno de los portaobjetos para formar la parte inferior del ensayo.
El otro tobogán se utiliza para aplanar los agros y como tobogán de soporte. La parte superior del ensayo es un cubreobjetos. Primero envuelva un portaobjetos de microscopio con cinta adhesiva, luego cubra el portaobjetos de vidrio del esterilizador de llama y colóquelo encima del portaobjetos envuelto esterilizado.
Deslice hacia arriba la corredera envuelta que soporta el deslizamiento de la cubierta, evitando que se agriete. Coloque una junta de autoclave encima del cubreobjetos esterilizado con llama con pinzas. Presione hacia abajo las juntas en la corredera inferior y el deslizamiento de la cubierta para asegurarse de que formen un sello con el vidrio.
De lo contrario, los medios de una matriz pueden secarse. Coloque la junta de corredera y los conjuntos de juntas de deslizamiento de la cubierta a un lado con los lados esterilizados hacia arriba, a partir de ahora trabaje solo en un complejo a la vez para evitar que los medios agrícolas se solidifiquen, lo que resultaría en una mala calidad de la película. Comience colocando el disco nutritivo.
Retire el complejo de disco nutritivo a cuatro grados centígrados. Retire el eclipse de unión y la parte anterior de las diapositivas que exponen los aros C-T-T-Y-E ahora solidificados utilizando una pipeta de micromuestreo con una punta desechable de vidrio de 100 microlitros. Retire también un disco nutritivo de un milímetro de diámetro del C-T-T-Y-E media agro y colóquelo en el hueco creado por la junta en el cubreobjetos.
A continuación, saque el TPM media agros de la incubadora y pipetee 300 microlitros en el pocillo creado por la junta en el cubreobjetos y que contiene el disco nutritivo. Los medios TPM Agros deben amontonarse para aplanar los aros medios T-P-M-S-A Coloque uno de los portaobjetos esterilizados con llama sin junta en ángulo sobre los aros de los medios TPM. Colocar la corredera en ángulo ayuda a evitar la formación de burbujas.
Sujete el complejo con mini clips de encuadernación uno a cada lado. Coloque el complejo recortado a cuatro grados centígrados y deje que se asiente el medio levantado. Esto suele tardar unos cinco minutos.
Una vez que el medio se haya endurecido, retire el complejo de cuatro grados centígrados. Retire los clips de encuadernación y exprima el extremo del complejo. Para aflojar el portaobjetos envuelto en cinta, retírelo y colóquelo en el banco para su uso posterior.
Luego, usando un par de pinzas como cuña. Separe la junta de deslizamiento de la cubierta media agros complex de la corredera de soporte y deseche la corredera de soporte. No utilice un movimiento de palanca para separar el complejo de la junta de deslizamiento de la cubierta, ya que esto podría resultar en el frenado del deslizamiento de la cubierta o en que el medio se pegue a la corredera de soporte.
Después de quitar la corredera de soporte, coloque el medio de la junta de deslizamiento de la cubierta en el carro envuelto en cinta con la junta hacia arriba. Coloque este complejo junto a un quemador para permitir que toda la humedad visible se evapore de la superficie recién expuesta. No deje que los medios agros se sequen por más de un minuto.
Como esto podría afectar el comportamiento del enjambre de M Zant, proceda a colocar las células en el complejo de ensayo recién preparado. Una vez que el exceso de humedad se ha evaporado de la junta de deslizamiento de la cubierta, los medios agros complex aspiran 0,5 microlitros de las celdas concentradas para depositarlas en el medio. Los aeros presionan la punta de la pipeta antes de acercarse a los medios agros.
En la parte inferior de la punta de la pipeta aparece una gota de células, lo que facilita el depósito de las células sin que la punta toque los medios agros. Una depresión en la superficie del enjambre puede cambiar el comportamiento del enjambre. Mueva la pipeta hacia abajo para dispensar las células aproximadamente a un milímetro de distancia del disco nutritivo incrustado.
A continuación, tire de la pipeta hacia arriba. De esta manera, se asegura de que el enjambre sea circular. Una vez que se hayan depositado las células, coloque el complejo junto al quemador para permitir que la mancha de células se seque durante no más de 20 segundos.
Después del secado, alinee el conjunto de la junta deslizante que forma la parte inferior del complejo con la junta en la tapa. Junta deslizante de medios acro cell complex que forma la parte superior del complejo. Presione suavemente para formar un sello.
Limpie las superficies de la corredera en el cubreobjetos con una toallita kim para eliminar cualquier residuo y evitar la condensación. Coloque el complejo en la platina del microscopio calentado inmediatamente después de limpiar los portaobjetos con el portaobjetos hacia abajo y la cubierta hacia arriba. Si se ha formado condensación, deje que el complejo de diapositivas se asiente en la platina calentada durante varios segundos antes de iniciar el software de adquisición de imágenes.
Para preparar la película, elija el objetivo adecuado, dos x cuatro x o 10 x en el microscopio. Encienda la cámara y el microscopio y verifique los niveles de luz para asegurarse de que la luz no sea demasiado intensa. Encienda la computadora y abra el programa de adquisición de imágenes.
Haga clic en la ventana de imagen en vivo y enfoque el microscopio. La imagen es similar a la que se muestra aquí. Empieza a adquirir imágenes.
Asegúrese de comprobar el enfoque con regularidad durante la primera hora, ya que el agar de los medios tiende a asentarse, lo que hace que el enfoque se desvíe. Una vez completada la adquisición de imágenes, transfiera las imágenes adquiridas para su almacenamiento. Rompa el complejo de deslizamientos sumergiéndolo en etanol al 90% durante la noche o TOLA las juntas para su reutilización.
Esta película de lapso de tiempo los muestra sometidos al ensayo de seguimiento descrito aquí. La velocidad de captura es de una imagen por minuto con un aumento de 20 veces, la velocidad de reproducción es de 60 imágenes por segundo. Esta película de lapso de tiempo muestra una población de células donde el 1% de las células expresan GFP.
La película fue compilada mediante la fusión de contraste de fase alterna e imágenes fluorescentes. El ensayo se realizó en C-T-T-Y-E en 1%Aros La tasa de captura es de una imagen por minuto con un aumento de 100 x. Esta película de lapso de tiempo muestra la motilidad de deslizamiento de M Anthes.
Este ensayo se realizó en C-T-T-Y-E en 1%Aros La tasa de captura es de una imagen por minuto a un aumento de 100x. Esta película de TimeLapse muestra la motilidad de los espasmos de P OSA. Este ensayo se realizó en LB al 1%Aros, la tasa de captura es de una imagen por minuto.
Con un aumento de 20x, la velocidad de reproducción es de 60 imágenes por segundo. Esta película de lapso de tiempo muestra a Smar sintiendo la motilidad del enjambre. Este ensayo se realizó en LB y la tasa de captura de Aris del 1% es de una imagen por minuto.
Con un aumento de 20x, la velocidad de reproducción es de 60 imágenes por segundo. Esta película de lapso de tiempo muestra la motilidad deslizante de EGT. Este ensayo se realizó en LB en 0.5%La tasa de captura de rosa de etiqueta es de una imagen por minuto, ya que un aumento de 20 veces la tasa de reproducción es de 120 imágenes por segundo debido a la fragilidad de 0.5%surgió en lv.
Este ensayo emplea el uso de las juntas más grandes que se ven en la figura uno B. Acabamos de mostrarle cómo generar películas de lapso de tiempo de biopelículas bacterianas. Al realizar este procedimiento. Es importante recordar que debes tomarte tu tiempo y ser lo más preciso posible para lograr resultados consistentes.
Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.
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Visión general
Este estudio presenta un protocolo de microcinematografía de lapso de tiempo diseñado para observar el comportamiento de enjambre de Myxococcus xanthus. El método utiliza juntas de silicona reutilizables y de bajo costo para crear un entorno controlado para la microscopía, permitiendo resultados reproducibles y cuantificables.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Microbiología
- Imágenes de lapso de tiempo
- Análisis del comportamiento de enjambre
Antecedentes
- Myxococcus xanthus es conocido por sus complejos comportamientos multicelulares.
- La microcinematografía de lapso de tiempo permite la observación detallada de las interacciones bacterianas.
- Las condiciones de crecimiento estándar son cruciales para la reproducibilidad en los experimentos.
- Las juntas de silicona proporcionan una solución rentable para mantener las condiciones experimentales.
Propósito del estudio
- Desarrollar un método confiable para estudiar el comportamiento de enjambre bacteriano.
- Cuantificar la quimiotaxis multicelular en Myxococcus xanthus.
- Mejorar la eficiencia de adquisición de datos utilizando múltiples microscopios.
Métodos utilizados
- Protocolo de microcinematografía de lapso de tiempo.
- Uso de juntas de silicona reutilizables y de bajo costo.
- Construcción de placas de medio agar para microscopía.
- Implementación de múltiples microscopios para la recopilación acelerada de datos.
Principales resultados
- El método mantiene con éxito la hidratación y oxigenación durante más de una semana.
- Los resultados cuantificables demuestran la quimiotaxis multicelular.
- El uso de ocho microscopios acelera significativamente la adquisición de datos.
- Los resultados son reproducibles en varios tipos de medios y concentraciones de agar.
Conclusiones
- El protocolo desarrollado es efectivo para estudiar el comportamiento de enjambre de Myxococcus xanthus.
- Los materiales de bajo costo pueden producir resultados experimentales de alta calidad.
- Este método puede adaptarse para varios ensayos microbiológicos.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Quantitative time-lapse microcinematography of Myxococcus xanthus biofilms enables direct observation of emergent multicellular behaviors, supporting mechanistic de-risking and predictive confidence in early discovery. The assay's reproducibility and scalability position it as a robust platform for interrogating collective bacterial responses to environmental cues, informing target validation and phenotypic screening strategies. This capability strengthens portfolio triage by providing high-content, quantifiable data on complex biological systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rigorous interrogation of multicellular chemotaxis and emergent pattern formation.
- Supports functional target validation by quantifying collective bacterial responses to nutrient gradients.
- Facilitates mechanistic de-risking through direct visualization of pathway-dependent behaviors.
- Provides predictive confidence for downstream screening and model selection.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible assay conditions using modifiable plate complexes and reusable gaskets.
- Generates quantitative, high-content video outputs suitable for automated analysis and comparison.
- Accelerates data acquisition with parallelized imaging across multiple microscopes.
- Enables reliable evaluation of compound or genetic perturbations on swarm behavior.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant system modeling by capturing emergent, collective behaviors not predictable from single-cell assays.
- Supports translational continuity by providing scalable, modifiable platforms adaptable to diverse microbial systems.
- Informs risk-adjusted advancement decisions through robust, quantifiable phenotypic endpoints.
Pipeline & Workflow Integration
This time-lapse microcinematography workflow integrates at the interface of early discovery and lead identification, providing a bridge from hypothesis-driven target validation to scalable phenotypic screening.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of collective bacterial responses and pathway dependencies.
- Screening: Provides reproducible, quantitative video data for comparative analysis across conditions.
- Analytics: Supports extraction of kinetic and spatial metrics from high-content time-lapse datasets.
- Translational Research: Facilitates adaptation to other microbial or multicellular systems for broader translational insights.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, reusable assay platform for ongoing R&D needs across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in collective behavior studies.
- Operational Value: Standardizes assay setup and data acquisition for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust, quantifiable outputs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery-stage assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiology, microscopy, and quantitative image analysis.
- Needs access to multiple microscopes and sufficient computational storage for high-content video data.
- Demands rigorous cross-team standardization of assay preparation and imaging protocols.
- Adaptable to various microbial systems with consideration for media and environmental requirements.
- Assay throughput and data management must be balanced with available analytical infrastructure.
