Name: Registro del comportamiento multicelular en Myxococcus xanthus Las biopelículas con Time-lapse Microcinematography (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-06T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Aprende a registrar el comportamiento multicelular en biopelículas de Myxococcus xanthus mediante microcinematografía time-lapse. Este protocolo utiliza juntas de silicona reutilizables para obtener resultados reproducibles y cuantificables durante más de una semana.

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Esta investigación fue posible gracias a un premio de la Fundación Nacional de Ciencias de Carrera (MCB-0746066, Caracterización de los activadores transcripcionales que regulan el comportamiento emergente) de RDW Estamos muy agradecidos a LJ Shimkus, Goldman BS, Suen G., Singer M. Welch LG, Murphy KA, y HG Taylor útil para los debates y comentarios sobre el manuscrito.

Material necesario: <ul><li> Klett metros </li><li> Pipeta y puntas </li><li> 2,5 ml tubos de microcentrífuga </li><li> Microcentrífuga </li><li> CTTYE los medios de comunicación: <ul><li> 1,0% casitona (Difco Laboratories), el 0,5% de extracto de levadura (Difco Laboratories), </li><li> 10,0 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,0 mM KH 2 PO 4, 8,0 mM MgSO 4 </li></ul></li><li> TPM medios de comunicación: <ul><li> 10,0 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,0 mM KH 2 PO 4, 8,0 mM MgSO 4 </li></ul></li><li> Agarosa </li><li> Baño de agua a 55 ° C </li><li> Portaobjetos de vidrio </li><li> Cubreobjetos de vidrio de gran </li><li> 2 x 2 cm, 0,5 mm de espesor de caucho de silicona junta (Grace Bio-Lab Inc.) </li><li> Parafilm (o cinta de etiquetado) </li><li> Fórceps </li><li> Pequeños clips de encuadernación </li><li> Micro-pipeta de muestreo (Fisher) </li><li> 100 l punta de vidrio desechable (Fisher) </li><li> Kimwipes </li></ul> Parte 1: Preparación de la célula Comience por crear un ambiente estéril. <ul><li> Limpie espacio de trabajo, guantes de Don, y encender la hornilla. </li></ul><ol><li> Iniciar un cultivo de una noche de las células mediante la inoculación en un matraz que contenía caldo CTTYE y se incubaron en la oscuridad a 32 ° C con agitación vigorosa. </li><li> Una vez que el cultivo alcanzó una densidad de 5 x 10 8 células / ml, pipeta de 1 ml de células en un tubo de microcentrífuga de 2,5 ml. </li><li> Pellet células por centrifugación durante 2 min a 16.000 xg (o velocidad máxima). </li><li> Se decanta y se desecha el sobrenadante. </li><li> Lavar el sedimento celular con 1 ml TPM (sal balanceada en nutrientes, sin los medios de comunicación). <ul><li> una nueva suspensión y agitar </li></ul></li><li> Re-pellet células girando durante 2 min a 16.000 xg (o velocidad máxima). </li><li> Se decanta y se desecha el sobrenadante. Paso crítico </li><li> Completamente re-suspender el precipitado en 100 medios de comunicación TPM l utilizando una combinación de pipeteo y agitación. IMPORTANTE: Este paso asegura que no hay grupos de células en el tubo de la izquierda. Esto puede tomar un tiempo. </li><li> Establecer las células a un lado a temperatura ambiente mientras se prepara las placas de ensayo de seguimiento. </li></ol> Parte 2: Preparación de Agar <ol><li> Prepare 50 ml de ambos TPM (ensayo de los medios de comunicación) y CTTYE (disco nutritivo) los medios de comunicación. </li><li> Añadir 0,5 g de agarosa a cada uno (de agarosa es menor de difracción de agar). </li><li> Autoclave para esterilizar. </li><li> Después de la esterilización, mantener los medios de comunicación a 55 ° C en una incubadora (o baño de agua), mientras que la construcción de los complejos análisis de seguimiento de la placa. </li></ol> Parte 3: Construcción de disco nutritivo <ol><li> Coloque una junta de silicona estéril de goma de 0,5 mm de espesor en la parte superior de una llama-esterilizados portaobjetos de vidrio, formando un pequeño pozo. </li><li> Pipeta ~ 300 l de los 55 ° C CTTYE media / agarosa en el pozo creado por la junta en la diapositiva que contiene el disco y nutritivo. Los medios de comunicación CTTYE / agarosa debe montículo. </li><li> Coloque una diapositiva llama esterilizada (sin juntas) en la parte superior de los medios de comunicación CTTYE / agarosa. IMPORTANTE: Esta diapositiva se debe establecer en un ángulo para evitar que se formen burbujas. </li><li> Una vez que la tapa está en su lugar, la abrazadera del complejo, junto con clips de la carpeta mini - una a cada lado. </li><li> Lugar del complejo recortado a 4 ° C y permitir que los medios CTTYE / agarosa al conjunto. Esto generalmente toma alrededor de 5 min. </li></ol> Parte 4: Preparación de seguimiento del ensayo - Configurar Complejos Plate Ensamblar los componentes, preparar los complejos de diapositivas, coloque el disco nutritivo, vierta los medios de comunicación TPM / agarosa, complejos placa separada y seco, las células de la placa, y montamos el seguimiento de los complejos de ensayo de placa. Ensamblar los componentes de la placa de complejo <ol><li> Para cada complejo, llama esterilizados un portaobjetos de vidrio </li><li> Coloque una junta de autoclave en la parte superior de la diapositiva y dejar de lado (esterilizada hacia arriba). Esta será la parte inferior de la prueba. </li><li> Llama esterilizar una cubierta de vidrio antideslizante y colocarlo en la parte superior de una placa de vidrio segundo microscopio envueltos con cinta de etiquetado (o Parafilm) y dejar de lado (esterilizada hacia arriba). Esto se utiliza como una diapositiva de apoyo para mantener el cubreobjetos de las grietas. Esta será la parte superior de la prueba. </li><li> Llama esterilizar a un portaobjetos de vidrio microscopio tercero y dejar de lado (esterilizada hacia arriba). Esto será utilizado para aplanar la agarosa. IMPORTANTE: Asegúrese de que las juntas forman un sello con el vidrio presionando hacia abajo con las pinzas, de lo contrario los medios de comunicación / agarosa podría secarse. </li></ol> P encaje disco nutritivo IMPORTANTE: Los pasos del 5 al 10 se debe hacer a lo complejo de diapositivas de una en una, de lo contrario los medios de comunicación / agarosa podría comenzar a solidificarse como resultado una calidad de cine pobre. <ol start="5"><li> Retire el disco de forma complejo nutritivo 4 ° C (paso 5 de la parte 3) y separarlas de las diapositivas de la exposición de ahora solidificado CTTYE / agarosa. </li><li> Eliminar un 'disco nutritivo "1 mm de diámetro de los medios de comunicación CTTYE / agarosa y se ha descrito anteriormente con una pipeta de muestreo de micro-con una punta de vidrio de 100 l desechable y colóquela en el pozo creado por la junta en la hoja de la cubierta (paso 3) . </li></ol> En placas Paso crítico <ol start="7"><li> Pipeta ~ 300 l de los 55 ° C TPM media / agarosa en el pozo creado por la junta en la hoja de la cubierta y que contiene el disco nutritivo. Los medios de comunicación TPM / agarosa debe montículo. Paso crítico </li><li> Colocar la placa de la llama esterilizadas sin junta (del paso 3) en la parte superior de los medios de TPM / agarosa. IMPORTANTE: Esta diapositiva se debe establecer en un ángulo para evitar que se formen burbujas. </li><li> Una vez que el carro (desde el paso 5) está en su lugar, la abrazadera del complejo, junto con clips de la carpeta mini - una a cada lado. </li><li> Lugar del complejo recortado a 4 ° C y permitir que los medios / de agarosa al conjunto. Esto generalmente toma alrededor de 5 min. </li></ol> Platos separados y seco IMPORTANTE: Para evitar que los medios de comunicación / agarosa de la desecación, los pasos 11 a 20 sólo se debe realizar en un complejo de diapositivas a la vez. IMPORTANTE: Para obtener mejores resultados, los pasos 11 a 13 se realizaron a 4 ° C. <ol start="11"><li> Una vez que los medios de comunicación / agarosa, quite el clips de la carpeta y apretar al final del complejo para aflojar la diapositiva cinta envuelta. </li><li> Elimina la diapositiva cinta envuelta y el lugar en el banco para su uso posterior. Paso crítico </li><li> El uso de pinzas a modo de cuña, separar la hoja de la cubierta / recinto junta / media / agarosa de la diapositiva de apoyo (sin empaque) y descartar el apoyo de diapositivas. IMPORTANTE: No usar un movimiento de palanca para separar la hoja de la cubierta / recinto de la junta. Esto podría resultar en la ruptura cubreobjetos y / o la adherencia media / agarosa a la diapositiva de apoyo. </li><li> Coloque la hoja de la cubierta / recinto junta / media / agarosa en la diapositiva en cinta envuelta (lado junta hacia arriba) y eliminar de 4 ° C. Lugar este próximo complejos a un quemador para permitir que toda la humedad se evapore visible de la nueva exposición media / agarosa superficie - no más de 1 min. IMPORTANTE: No deje que la seca media / agarosa durante demasiado tiempo ya que esto podría afectar la M. xanthus enjambre comportamiento. </li></ol> Células de la placa Paso crítico <ol><li> Una vez que el exceso de humedad se haya evaporado, pipeta de 0,5 l de las células concentradas (el paso 8 de la parte 1) en los medios de comunicación / agarosa de aproximadamente 1 mm de distancia desde el disco de nutrientes. IMPORTANTE: Es muy importante asegurarse de que las células se depositan moviendo la pipeta hacia abajo y luego hacia arriba. Esto asegura que el enjambre será circular. IMPORTANTE: Es muy importante no tocar la punta de la pipeta para los medios de comunicación / agarosa. Esto hará que una depresión en la superficie y cambiar el comportamiento de la M. xanthus enjambre. CONSEJO: Presione el punta de la pipeta antes de acercarse a los medios de comunicación / agarosa. Esto permitirá una disminución de las células que aparecen en la parte inferior de la punta de la pipeta y que sea más fácil para depositar las células. </li><li> Una vez que las células se depositan, el lugar de la próxima complejo a un segundo plano para permitir que el lugar de células para secar - no más de 20 segundos. </li></ol> Ensamble ensayo <ol><li> Una vez que el lugar de células se ha secado, alinear el conjunto de diapositivas / junta (del paso 1) con la junta en la hoja de la cubierta / junta / media / agarosa / celular compleja (del paso 13) y presione suavemente para formar un sello. Paso crítico </li><li> Limpie las superficies de las diapositivas y hoja de cubierta con un Kimwipe para eliminar los residuos dejados por el Parafilm. El ensayo terminado debe ser similar a la Figura 1. </li><li> Coloque el complejo de diapositivas completa en la etapa de calefacción mantiene a 32 ° C (deslizarse, hoja de cubierta para arriba) inmediatamente después de limpiar (paso 15) para evitar que el la formación de condensación. Si se ha formado condensación, deje reposar de diapositivas complejas en el escenario calentado por varios segundos antes de iniciar el software de adquisición de imágenes. </li><li> Elegir el objetivo adecuado (2X, 4X o 10X). </li></ol> Parte 5: Preparación de la película t "&gt; paso crítico <ol><li> Encienda la cámara y el microscopio, y comprobar los niveles de luz (asegúrese de que la luz no sea demasiado intensa). Arranca el ordenador y abrir el programa de adquisición de imágenes. </li><li> Haga clic en la ventana de la imagen en vivo y enfocar el microscopio. La imagen debe ser similar a la que se ve en la Figura 3. Aviso de la superficie del agar uniforme. </li><li> Comenzar a adquirir las imágenes. Paso crítico </li><li> Comprobar el enfoque con regularidad durante la primera hora, como los medios de comunicación / agar tiende a acumularse causando el foco a la deriva. </li><li> Limpie el área de trabajo. </li><li> Una vez que la adquisición de imágenes, transmite las imágenes adquiridas para el almacenamiento y romper el complejo de diapositivas por inmersión en etanol al 90% durante la noche. </li><li> Juntas de autoclave para su reutilización. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Ilustración de dibujos animados de la compleja placa TM. (A) muestra el complejo básico TM placa de despiece y sección transversal. (B) muestra el uso de grandes juntas. <img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Cluster microscopio. Cada nodo microscopio (recuadro) consiste en un microscopio Nikon E400, los objetivos, una etapa de calefacción, una cámara de Insight, y un ordenador portátil. Cada nodo está conectado en red entre sí y vinculados a un equipo controlador maestro. Dos de los nodos se configuran con las capacidades de fluorescencia que consisten en la fuente de luz y dos persianas EXFO Uniblitz. <img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Una imagen de 20X de los aparatos de ensayo de seguimiento en el tiempo = 0. Barra de escala, de 1 mm. <img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Capacidad de adaptación del complejo de la placa de TM. (A) una imagen de 100X de M. xanthus deslizamiento en la motilidad CTTYE en 1,0% de agar. (B) una imagen de 20x de P. aeruginosa crispar la motilidad. (C) una imagen de 20X S. marcescens enjambre motilidad. Tanto (B) y (C) se analizaron en LB en 1,0% de agar. (D) una imagen de 40x de M. smegmatis deslizamiento en la motilidad de LB en el 0,5% de agar. Esta imagen fue tomada utilizando la configuración de ensayo alternativo se ve en la figura 1B. Video 1. Un video de lapso de tiempo de un enjambre sometido a la prueba de seguimiento. Video 2. Un video de lapso de tiempo de una M. xanthus enjambre donde el 1% de las células están marcados con fluorescencia. Alternando imágenes de contraste de fase y fluorescentes fueron capturados y superpuestos para dilucidar la posición de las células fluorescentes en el enjambre. Este video fue grabado en CTTYE en 1,0% de agar. Video 3. Un video de lapso de tiempo de M. xanthus deslizamiento motilidad. Este video fue grabado en CTTYE en 1,0% de agar. Video 4. Un video de lapso de tiempo de P. aeruginosa crispar la motilidad. Este video fue grabado en LB en el 1,0% de agar. Video 5. Un video de lapso de tiempo de S. marcescens enjambre motilidad. Este video fue grabado en LB en el 1,0% de agar. Video 6. Un video de lapso de tiempo de M. smegmatis deslizamiento motilidad. Este video fue grabado en LB en el 0,5% de agar con la configuración de ensayo alternativo se ve en la figura 1B.

<ol><li>Taylor, R. G., Welch, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+as+an+emergent+property+of+a+swarm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis as an emergent property of a swarm.</a> J Bacteriol. 190, 6811-6816 (2008).</li>
<li>Curtis, P. D., Taylor, R. G., Welch, R. D., Shimkets, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Organization+of+Myxococcus+xanthus+During+Fruiting+Body+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Spatial Organization of Myxococcus xanthus During Fruiting Body Formation.</a> J Bacteriol. 189, 9126-9130 (2007).</li>
<li>Mignot, T., Merlie, J. P., Zusman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+pole-to-pole+oscillations+of+a+bacterial+gliding+motility+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulated pole-to-pole oscillations of a bacterial gliding motility protein.</a> Science. 310, 855-857 (2005).</li>
<li>Stoodley, P., Hall-Stoodley, L., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detachment+surface+migration%2C+and+other+dynamic+behavior+in+bacterial+biofilms+revealed+by+digital+time-lapse+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detachment surface migration, and other dynamic behavior in bacterial biofilms revealed by digital time-lapse imaging.</a> Methods Enzymol. 337, 306-319 (2001).</li>
<li>O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+as+microbial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation as microbial development.</a> Annu Rev Microbiol. 54, 49-79 (2000).</li>
<li>O'Toole, G. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flagellar+and+twitching+motility+are+necessary+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Mol Microbiol. 30, 295-304 (1998).</li>
<li>Dalton, H. M., Poulsen, L. K., Halasz, P., Angles, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substratum-induced+morphological+changes+in+a+marine+bacterium+and+their+relevance+to+biofilm+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Substratum-induced morphological changes in a marine bacterium and their relevance to biofilm structure.</a> J Bacteriol. 176, 6900-6906 (1994).</li>
<li>Dworkin, M., Eide, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myxococcus+xanthus+does+not+respond+chemotactically+to+moderate+concentration+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Myxococcus xanthus does not respond chemotactically to moderate concentration gradients.</a> J Bacteriol. 154, 437-442 (1983).</li>
<li>Dworkin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tactic+behavior+of+Myxococcus+xanthus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Tactic behavior of Myxococcus xanthus.</a> J Bacteriol. 154, 452-459 (1983).</li>
<li>Wu, S. S., Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+expression+of+the+pilA+gene+in+Myxococcus+xanthus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Regulation of expression of the pilA gene in Myxococcus xanthus.</a> J Bacteriol. 179, 7748-7758 (1997).</li>
<li>Bustamante, V. H., Martínez-Flores, I., Vlamakis, H. C., Zusman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Frz+signal+transduction+system+of+Myxococcus+xanthus+shows+the+importance+of+the+conserved+C-terminal+region+of+the+cytoplasmic+chemoreceptor+FrzCD+in+sensing+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Frz signal transduction system of Myxococcus xanthus shows the importance of the conserved C-terminal region of the cytoplasmic chemoreceptor FrzCD in sensing signals.</a> Mol Microbiol. 53, 1501-1513 (2004).</li>
</ol>

Time-lapse microcinematography (TM) se ha convertido en un método estándar para el estudio de la motilidad procariotas 2-7. Tradicionalmente, la TM se lleva a cabo mediante el uso de mechas de papel de filtro, pastillas de finas agar, o agar losas como sustratos 08.11. Estos métodos son los adecuados y el coste efectivo cuando se usa para generar secuencias de imágenes de las ilustraciones general del movimiento de bacterias. Sin embargo, si las secuencias de imagen debe dar lugar a la generación d...

<table><tbody><tr><td>1.0% Casitone</td><td>Difco Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5% extracto de levadura</td><td>Difco Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>micropipeta de muestreo</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>punta de vidrio desechable de 100 &amp;mu;l</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>junta de goma de silicona de 2 x 2 cm y 0,5 mm de grosor</td><td>Grace Bio-Lab Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

registro del comportamiento multicelular en myxococcus xanthus las biopelículas con time-lapse microcinematography

Recording Multicellular Behavior in Myxococcus xanthus Biofilms using Time-lapse Microcinematography

Un enjambre de la δ-proteobacteria xanthus Myxococcus contiene millones de células que actúan como un movimiento colectivo, coordinando a través de una serie de señales para crear patrones complejos, dinámicos, como respuesta a señales ambientales. Estos patrones son de auto-organización y emergentes, ya que no se puede predecir mediante la observación del comportamiento de las células individuales. Mediante un ensayo de microcinematography lapso de tiempo de seguimiento, se identificaron un patrón distinto emergente en M. xanthus llamado quimiotaxis, que se define como el movimiento dirigido de un enjambre de hasta un gradiente de nutrientes hacia su fuente 1. A fin de caracterizar de manera eficiente a través de la quimiotaxis microcinematography lapso de tiempo, hemos desarrollado un complejo altamente modificable placa (Figura 1) y construyó un grupo de 8 microscopios (Figura 2), cada uno capaz de capturar vídeos con lapso de tiempo. El ensayo es lo suficientemente riguroso como para permitir la replicación constante de datos cuantificables, y los videos resultantes nos permiten observar y rastrear cambios sutiles en el comportamiento de enjambre. Una vez capturados, los videos son trasladados a un equipo de análisis / almacenamiento con memoria suficiente para procesar y almacenar miles de videos. La flexibilidad de esta instalación ha demostrado ser útil para varios miembros de la M. xanthus comunidad.

Para el estudio de<em&gt; Myxococcus xanthus</em&gt; Comportamiento de enjambre, hemos diseñado un protocolo microcinematography lapso de tiempo que puede ser modificado para diferentes ensayos. Emplea a las condiciones normales de crecimiento adaptado para la microscopía, y con resultados reproducibles mediante el uso de empaques de bajo costo, de silicona reutilizables. Hemos utilizado este método para cuantificar la quimiotaxis multicelulares.

Registro del comportamiento multicelular en Myxococcus xanthus Las biopelículas con Time-lapse Microcinematography

Un enjambre de la $\delta$-proteobacteria Myxococcus xanthus contiene millones de células que actúan como un colectivo, coordinando el movimiento a través de una serie de ...

El objetivo general del siguiente experimento es desarrollar un ensayo económico de microcinematografía con lapso de tiempo que tenga rigor suficiente para generar resultados reproducibles y cuantificables. Esto se logra empleando juntas de silicona reutilizables y económicas para construir placas de medio con agar o portaobjetos para microscopio. Los resultados obtenidos muestran que estos complejos de placas permanecen hidratados y suficientemente oxigenados durante más de una semana, en una variedad de tipos de medio y concentraciones de agar.Además, dado que la microcinefotografía con intervalos es un proceso lento, el uso de ocho microscopios económicos ayuda a acelerar la adquisición de datos. Hola, soy Ryan Taylor del laboratorio del Dr. Roy Welch del Departamento de Biología de la Universidad de Syracuse. Hoy les mostraremos un procedimiento para realizar películas con intervalos de biofilms bacterianos en nuestro laboratorio; utilizaremos este procedimiento para estudiar el comportamiento multicelular de los biofilms MTIs.Así que comencemos. Para iniciar este procedimiento, mida la densidad celular de una cultura nocturna de Occus sanus con un medidor de turbidez, transfiera un mililitro de la cultura a un tubo de centrífuga de 2,5 mililitros, centrifugue, lave y resuspenda las bacterias en medio TPM como se describe en el protocolo escrito adjunto; pipetee y vortexee para resuspender completamente el botón celular, lo cual puede llevar un tiempo. A continuación, añada 0,5 gramos de aros a 50 mililitros de TPM, que es el medio de ensayo.Además, añada 0,5 gramos de aros a 50 mililitros de C-T-T-Y-E, que es el medio de disco nutritivo, y autoclave para esterilizar. Luego mantenga el medio a 55 grados Celsius en un incubador o baño de agua. Mientras construye el ensayo de rastreo.Los complejos de placas proceden a construir el disco nutritivo con el primer microscopio de vidrio esterilizado con llama. Deslice y coloque una junta de caucho de silicona estéril de 0,5 milímetros de espesor encima del portaobjetos. Pipete aproximadamente 300 microlitros de medio C TT YE aros en el pocillo formado por la junta sobre el portaobjetos.El medio de cultivo C-T-T-Y-E agro debe acumularse en forma de montículo; esterilice otra portaobjetos y colóquela en un ángulo sobre los aros del medio de cultivo C-T-T-Y-E. Colocar la portaobjetos en ángulo evita la formación de burbujas. Una vez colocada la portaobjetos, sujete el conjunto firmemente con abrazaderas pequeñas, una en cada lado.Coloque el complejo recortado a cuatro grados Celsius y deje que el agro de medio C-T-T-Y-E se solidifique. Esto generalmente tarda unos cinco minutos. Una vez que el agro se ha solidificado, se pueden preparar los complejos de placa utilizados en el ensayo de seguimiento.Comience preparando los portaobjetos para la construcción de los complejos del ensayo. Para cada complejo, flamee dos portaobjetos de vidrio. Coloque una junta de autoclave sobre uno de los portaobjetos para formar la base del ensayo.El otro portaobjetos se utiliza para aplanar los agros y como portaobjetos de soporte. La parte superior del ensayo es un cubreobjetos. Primero envuelva un portaobjetos con cinta adhesiva para etiquetar, luego esterilice por flama el cubreobjetos de vidrio y colóquelo encima del portaobjetos envuelto y esterilizado.Deslice hacia arriba los soportes envueltos para sostener el cubreobjetos, evitando que se agriete. Coloque una junta de autoclave sobre el cubreobjetos esterilizado con llama usando pinzas. Presione hacia abajo sobre las juntas del portaobjetos inferior y el cubreobjetos para asegurarse de que formen un sello con el vidrio.De lo contrario, los medios de los arreglos podrían secarse. Coloque las juntas del portaobjetos y las juntas del cubreobjetos aparte, con los lados esterilizados hacia arriba, y a partir de ahora trabaje solo en un complejo a la vez para evitar que los agros de medio se solidifiquen, lo que resultaría en una mala calidad de la película. Comience colocando el disco nutritivo.Retire el complejo de disco nutritivo de cuatro grados Celsius. Retire el bind eclipse y separe previamente las laminillas para exponer los aros C-T-T-Y-E ahora solidificados, utilizando una pipeta de muestreo micro con una punta de vidrio desechable de 100 microlitros. Retire un disco nutritivo de un milímetro de diámetro del agar de medio C-T-T-Y-E también y colóquelo en el pozo creado por la junta en la cubreobjetos.Luego, retire los agros de medio TPM del incubador y pipetee 300 microlitros dentro del pozo creado por la junta en la laminilla y que contiene el disco nutritivo. Los agros de medio TPM deben acumularse hasta aplanar el medio TPM-SA. Coloque uno de los portaobjetos esterilizados con llama, sin junta, en ángulo encima de los agros de medio TPM. Colocar el portaobjetos en ángulo ayuda a prevenir la formación de burbujas.Sujete el complejo con clips pequeños, uno en cada lado. Coloque el complejo sujeto a cuatro grados Celsius y deje que el medio se solidifique. Esto generalmente tarda unos cinco minutos.Una vez que el medio haya solidificado, retire el complejo de cuatro grados Celsius. Retire las pinzas sujetadoras y presione el extremo del complejo. Para aflojar la portaobjetos envuelta en cinta, retire la portaobjetos envuelta en cinta y colóquela sobre la bancada para su uso posterior.Luego, utilizando un par de pinzas como cuña, separe el conjunto de cubreobjetos, junta y medio de agaros complejo del portaobjetos y deseche el portaobjetos. No utilice un movimiento de palanca para separar el conjunto de cubreobjetos y junta, ya que esto podría provocar la rotura del cubreobjetos y/o que el medio de agaros se adhiera al portaobjetos.Tras retirar el portaobjetos de soporte, coloque el conjunto del portaobjetos con junta y medio de agar sobre el portaobjetos envuelto en cinta con la junta hacia arriba. Coloque este conjunto junto a un mechero para permitir que toda la humedad visible se evapore de la superficie recién expuesta del agar del medio. No permita que el agar del medio se seque durante más de un minuto.Dado que esto podría afectar el comportamiento de enjambre de M Zant, proceda a sembrar las células en el complejo de ensayo recién preparado. Una vez que se haya evaporado el exceso de humedad del complejo de agarosa en el portaobjetos con junta, aspire 0,5 microlitros de las células concentradas para depositarlas sobre el medio. Aeros deprima la punta de la pipeta antes de acercarse al medio de agarosa.Una gota de células aparece en la punta de la pipeta, lo que facilita depositar las células sin que la punta toque el agar del medio. Una depresión en la superficie del agar puede alterar el comportamiento del mz del enjambre. Mueva la pipeta directamente hacia abajo para dispensar las células a aproximadamente un milímetro de distancia del disco nutritivo embebido.Luego, retire la pipeta directamente hacia arriba. De este modo, se asegura que el grupo sea circular. Una vez depositadas las células, coloque el complejo junto al mechero para permitir que la muestra de células se seque durante no más de 20 segundos.Tras el secado, alinee el conjunto del empaque del portaobjetos que forma la parte inferior del complejo con el empaque de la cubierta. Deslice el medio del empaque acro célula complejo que forma la parte superior del complejo. Presione suavemente para formar un sello.Limpie las superficies del portaobjetos y la cubierta con una toallita kim para eliminar cualquier residuo y así prevenir la condensación. Coloque el conjunto sobre la platina calentada del microscopio inmediatamente después de limpiar los portaobjetos, con el portaobjetos hacia abajo y la cubierta hacia arriba. Si se ha formado condensación, deje el conjunto sobre la platina calentada durante varios segundos antes de iniciar el software de adquisición de imágenes.Para preparar la película, seleccione el objetivo apropiado, de 4x, 10x u otro en el microscopio. Encienda la cámara y el microscopio y verifique los niveles de luz para asegurarse de que no sea demasiado intensa. Encienda el ordenador y abra el programa de adquisición de imágenes.Haga clic en la ventana de la imagen en vivo y enfoque el microscopio. La imagen aparece similar a la que se muestra aquí. Comience a adquirir imágenes.Asegúrese de verificar el enfoque regularmente durante la primera hora, ya que el agar del medio tiende a asentarse, lo que provoca una deriva del enfoque. Una vez finalizada la adquisición de imágenes, transfiera las imágenes adquiridas para su almacenamiento. Desarme el conjunto del portaobjetos sumergiéndolo en etanol al 90 % durante la noche o desmonte las juntas tóricas para su reutilización.Esta película de lapso de tiempo muestra embriones sometidos al ensayo de seguimiento descrito aquí. La tasa de captura es de una imagen por minuto con una ampliación de 20x; la velocidad de reproducción es de 60 imágenes por segundo. Esta película de lapso de tiempo muestra una población de hormigas en las que el 1% de las células expresan GFP.La película se compiló combinando imágenes alternadas de contraste de fase y fluorescencia. El ensayo se realizó en C-T-T-Y-E con una tasa de captura de 1% a una magnificación de 100 x, obteniendo una imagen por minuto. Esta película de lapso de tiempo muestra la motilidad de deslizamiento de M Anthes.Este ensayo se realizó en C-T-T-Y-E con una tasa de captura de 1 %Aros de una imagen por minuto a una magnificación de 100 x. Esta película de lapso de tiempo muestra la motilidad por sacudidas de P OSA. Este ensayo se realizó en LB con una tasa de captura de 1 %Aros de una imagen por minuto.Con un aumento de 20x, la velocidad de reproducción es de 60 imágenes por segundo. Esta película de lapsos de tiempo muestra la movilidad colectiva de Smar. Este ensayo se realizó en LB y agar al 1%, con una tasa de captura de una imagen por minuto.Con un aumento de 20x, la velocidad de reproducción es de 60 imágenes por segundo. Esta película de lapsos de tiempo muestra la motilidad por deslizamiento de EGT. Este ensayo se realizó en LB con 0,5 % de Tag; la velocidad de captura es de una imagen por minuto, mientras que con un aumento de 20x la velocidad de reproducción es de 120 imágenes por segundo debido a la fragilidad del 0,5 % de arose en lv.Este ensayo emplea el uso de las juntas más grandes que se observan en la figura uno B. Acabamos de mostrarle cómo generar películas de lapso de tiempo de biopelículas bacterianas. Al realizar este procedimiento, es importante recordar tomarse el tiempo necesario y ser lo más preciso posible para obtener resultados consistentes.Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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Este método permite la monitorización de las células en tiempo real y las mediciones cuantitativas de los diferentes parámetros de la migración, como la velocidad, el desplazamiento y la velocidad. A diferencia de los métodos tradicionales, este enfoque en tiempo real no se basa en las mediciones cuantitativas de migración de punto final, sino que permite el seguimiento y el cálculo de diferentes parámetros de forma continua.

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