Congelación rápida de tejido muscular para seccionamiento: un protocolo para obtener secciones ultrafinas de tejido muscular murino congelado rápidamente

La congelación instantánea es una técnica mediante la cual las muestras de tejido se congelan rápidamente a temperaturas ultrafrías. Ayuda a retener la estructura nativa del ADN, el ARN y las proteínas dentro del tejido.

Para congelar el músculo de la extremidad, comience tomando tejido muscular recién extraído de la extremidad posterior de un ratón.

A continuación, tome nitrógeno líquido en una caja de espuma de poliestireno y sumerja un vaso de precipitados que contenga isopentano, un líquido altamente conductor, en nitrógeno líquido.

Congele el isopentano hasta que la solución se vuelva viscosa. Simultáneamente, aplique una gota de medio líquido de congelación sobre una pieza de corcho.

Coloque el tejido muscular de las extremidades posteriores sosteniendo su tendón e incruste la pieza de tejido verticalmente en el medio de congelación líquido. Esta orientación ayuda en la determinación posterior del área de la sección transversal del músculo.

Sumerja brevemente la pieza de corcho con el tejido muscular adherido en el baño de isopentano preenfriado. Esto ayuda a la congelación rápida y uniforme del tejido muscular.

El medio de congelación se solidifica a baja temperatura y forma una capa gelatinosa alrededor del tejido muscular, manteniéndolo en su lugar. Coloque el bloque muscular en un crio-micrótomo para obtener secciones en rodajas finas.

Coloque las secciones en portaobjetos de vidrio y guárdelas a una temperatura más baja para un análisis histológico posterior.

Cuando se hayan recolectado todos los músculos, sumerja la mitad inferior de un vaso de precipitados de plástico de 50 mililitros que contenga isopentano en nitrógeno líquido. Cuando el isopentano se vuelve ligeramente viscoso con un revestimiento laminado blanco sólido visible dentro del vaso de precipitados, vierta unas gotas de medio de inclusión en un mandril.

Luego, levante un músculo por el tendón y coloque con cuidado el extremo del músculo fresco encima del medio de inclusión, sosteniéndolo verticalmente en relación con el corcho. Luego, manteniendo el músculo vertical, sumerja el mandril y el músculo unido en el baño de isopentano durante 7 a 15 segundos hasta que el tejido esté completamente congelado. Un espécimen bien congelado aparecerá de color blanco calcáreo. Luego, coloque el músculo en un tubo de muestra para su almacenamiento inmediato a 80 grados Celsius negativos.

Para preservar los ARN y la estructura enzimática y la actividad de las muestras, se requiere congelar los tejidos musculares lo antes posible después de su extracción.

Para seccionar el tejido muscular congelado, primero, ajuste la temperatura de trabajo de la cámara interna del criostato a menos 23 grados Celsius. Deje que la muestra negativa de 80 grados Celsius se aclimate a la temperatura de trabajo durante unas horas. Luego, obtenga múltiples secciones de 8 micras de espesor de la muestra en la región media del vientre del músculo, perpendicular al eje de montaje, recolectando las secciones en portaobjetos de vidrio a temperatura ambiente a medida que se cortan. Mantenga las muestras dentro de la cámara de criostato hasta que se hayan recolectado todas las secciones. Luego, almacene las muestras a 80 grados Celsius negativos hasta un análisis adicional.