Name: Método para el aislamiento de Francisella tularensis Membranas externas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-29T17:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Aprende a aislar vesículas de membrana externa de Francisella tularensis mediante lisis osmótica y ultracentrifugación en gradiente de sacarosa. Este método permite separar proteínas de membrana externa para estudios de virulencia bacteriana.

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El proyecto descrito fue apoyada por los números de Grant P01 AI055637 y AI057156 U54 del NIAID / NIH. Sus contenidos son de exclusiva responsabilidad de sus autores y no representan necesariamente la opinión oficial de la Oficina de Programas de ICE, el NIAID, o NIH.

Día 1: F. tularensis inoculación placa <ol><li> Cultivos en placa de valores congelados de F. tularensis en agar Mueller-Hinton suplementado con 2,5% (vol / vol) de los donantes de suero de ternera, 2% (vol / vol) IsoVitaleX, el 0,1% (wt / vol) de glucosa, y el 0,025% (wt / vol) de pirofosfato de hierro. Crecer F. tularensis a 37 ° C con 5% de CO 2 durante aproximadamente 24 h. </li></ol> Día 2: F. líquido tularensis medios de inoculación <ol><li> Preparar y autoclave de 1 litro de cationes ajustados Mueller-Hinton (que contiene calcio 1,23 mM de dihidrato de cloruro de magnesio hexahidratado y 1,03 mM de cloruro). Cuando se enfría a 37 ° C, medio complementar aún más con el 0,1% (wt / vol) de glucosa, 0.025% (wt / vol) de pirofosfato de hierro, y el 2% (vol / vol) IsoVitaleX. Filtro de esterilización (0,22 μ) medio en dos alícuotas de 500 ml. </li><li> Quitar 12 ml de Mueller-Hinton complementado medio y la transferencia en una estéril de 50 ml tubo Falcon. </li><li> Utilizando una aguja estéril de 10 l asa de siembra, raspar un asa grande de F. tularensis crecimiento de las placas de agar (a partir del día 1) y las bacterias de transferencia en 12 ml de Mueller-Hinton (ver paso 2). Adición de la solución de múltiples ocasiones de ruptura de grupos y preparar la suspensión bacteriana homogénea. No vórtice. </li><li> Con una pipeta estéril, inocular cada buque de 500 ml con 5 ml de suspensión bacteriana desde el paso 3. Los cultivos de caldo a 37 ° C durante 14 a 18 h con agitación suave (190 a 200 rpm en un agitador New Brunswick Innova serie 2300). </li></ol> Día 3: lisis Spheroplasting, osmótico y la centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa <ol><li> Obtener F. culturas tularensis de la incubadora de agitación y eliminar una alícuota de 1 ml de cada cultivo de 500 ml para comprobar la densidad óptica correspondiente. Hemos encontrado la extracción de la membrana y los resultados óptimos cuando se utiliza el aislamiento F. tularensis células en una fase inicial de crecimiento logarítmico, que se correlaciona con una OD 600 entre 0,2 y 0,4 (~ 07 10 hasta 08 10 UFC / ml). Culturas con un OD 600 a menos de 0,2 no dará la suficiente cantidad de material de la membrana total de gradientes de sacarosa posteriores. Por el contrario, las culturas con una OD 600 superior a 0,4 (cerca de la fase estacionaria) se ha encontrado que el rendimiento mixto membrana fusiones. </li><li> Centrifugar los cultivos a 7.500 x g durante 30 minutos a 15 ° C para recoger las células. Se recomienda la centrifugación de las culturas de cada cuatro botellas de centrífuga de 250 ml, ya que facilita la posterior suspensión de pellets. </li><li> Retire con cuidado el sobrenadante los medios de comunicación de cada botella de centrífuga y golpear firmemente las botellas en material absorbente para eliminar el exceso de medio de cultivo. </li><li> Dentro de la terminación de 10 minutos después de la centrifugación, suspender cada sedimento bacteriano en 8,75 ml de sacarosa 0,75 M (en 5 mM Tris, pH 7,5). Los cuatro pellets bacteriana debe ser suspendido y transferido (35 total de ml de suspensión bacteriana) a un recipiente estéril de 250 ml frasco (con una pequeña stirbar) en 10 minutos. </li><li> Mientras mezclar suavemente la suspensión celular en un stirplate, agregue lentamente 70 ml (2 volúmenes), de 10 mM EDTA disódico (en 5 mM Tris, pH 7,8) a lo largo de 10 min. Añadir la solución de EDTA con la punta de la pipeta por debajo del nivel de suspensión de células para evitar la elevación de las concentraciones locales de EDTA. El stirbar debería estar girando a una velocidad suficiente para mezclar completamente la suspensión de células, pero no lo suficientemente rápido para producir espuma o la formación de burbujas. Después de la solución de EDTA se ha añadido, se incuba la solución durante 30 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Después de la incubación de 30 minutos, agregue lentamente 11 ml (volumen 1 / 10 º) de 2 mg / ml de solución de lisozima a una concentración final de 200 mg / ml. Continúe mezclando la suspensión celular durante la adición de solución de lisozima. Como se señaló anteriormente, añadir la solución de lisozima con la punta de la pipeta por debajo del nivel de células de fluido de suspensión para evitar la elevación de las concentraciones locales de la lisozima. Soluciones madre lisozima (2 mg / ml) se puede preparar en un solo uso alícuotas y almacenado a -20 ° C durante tres a cuatro meses. Incube la solución resultante durante 30 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Durante la incubación de 30 minutos, prepare un frasco de 1 litro estéril con una pequeña stirbar y 530 ml de la temperatura ambiente Cellgro molecular Grado dH 2 O (4,5 volúmenes). </li><li> Osmóticamente lisis de la suspensión celular (del paso 6) por la dilución lenta (velocidad de flujo de aproximadamente 11 ml / min) en 530 ml de Biología Molecular Grado dH 2 O (del paso 7) en el transcurso de 10 a 15 minutos con una mezcla suave. Debido al volumen de la solución más importante en este paso, aumentar la velocidad stirbar para asegurar una mezcla adecuada. El stirbar debería estar girando a una velocidad suficiente para dispersar completamente la suspensión de células, una vez añadido a la DH 2 O, pero no lo suficientemente rápido para dar lugar a formación de espuma o la formación de burbujas. Añadir la suspensión de células con la punta de la pipeta descansando en el fondo del frasco, junto a la stirbar, para facilitar la dilución uniforme del cell de la suspensión. Hemos encontrado que 25 ml pipetas funcionan mejor durante esta etapa. Que observe cuidadosamente el proceso de dilución y de interrumpir el caudal necesario para dispersar a la acumulación local de las células, grupos de células, y mechones de la célula. Incube la solución resultante durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tenga en cuenta que este paso parece ser uno de los más difíciles y críticos para el éxito global de la prueba. </li><li> Después de la incubación de 30 minutos, la transferencia de alícuotas de 40 ml de la solución de lisis osmótica en 50 ml tubos cónicos y se centrifuga a 7500 xg durante 30 min a 10 ° C para eliminar las células intactas y los escombros. </li><li> Tras la centrifugación, retire con cuidado 27 a 30 ml de sobrenadante de cada tubo cónico y sobrenadantes de la piscina en un frasco estéril de 1 litro </li><li> 25 ml de sobrenadante agrupados, cada uno, en 16 tubos de ultracentrífuga y centrifugar a 200.000 xg (44.400 rpm en F50L-8x39 rotor ultracentrífuga Fiberlite) durante 2 horas a 4 ° C. Tenga en cuenta que cada rotor con capacidad para 8 tubos, por lo que este paso requiere de dos rotores y ultracentrífugas dos. Por otra parte, el segundo conjunto de 8 tubos deben mantenerse a 4 ° C hasta que se centrifuga. </li><li> Dentro de los 10 minutos de la finalización de la ejecución de ultracentrifugación, preparar modificado buffer membrana resuspensión. Transferencia de 8 ml de tampón de suspensión de membrana (25% [p / p] sacarosa, 5 mM Tris, 30 mM MgCl 2) a un tubo estéril y añadir 1 tableta de EDTA libre de cóctel inhibidor de la proteasa y 375 U de Benzonase. Mezclar suavemente la solución para disolver la tableta inhibidor de la proteasa. </li><li> Después de ultracentrifugación, cuidadosamente vierta sobrenadantes, invertir los tubos de ultracentrífuga con material absorbente, y golpear firmemente los tubos para eliminar el exceso de sobrenadante. Marca la ubicación de cada pastilla de membrana con un marcador para ayudar en la visualización. Resuspenda suavemente ocho pastillas de membrana de 600 l cada uno de buffer modificado la resuspensión de la membrana. La transferencia de cada resuspensión de membrana para la siguiente serie de ocho tubos, resuspender suavemente estos ocho pastillas, y la piscina resuspensiones membrana que resulta en un tubo estéril. Las membranas de pellets son difíciles de volver a suspender, por lo que seguirá pasando el buffer de resuspensión de la membrana modificada por la pastilla hasta que se desprende de la pared del tubo. A menudo es necesario utilizar la punta de la micropipeta para raspar el pellet de membrana de la pared del tubo y la ayuda en el proceso de resuspensión. Cuando pipeteo, evitar formación de espuma o la formación de burbujas. Tenga en cuenta que este paso parece ser uno de los más difíciles y críticos para el éxito global de la prueba. </li><li> Cuando los gránulos de la membrana se han resuspendido y se retira de los 16 tubos, lavar cada cuatro tubos con 600 l de buffer modificado la resuspensión de la membrana. El lavado debe centrarse en torno a la zona marcada (membrana pellet) de cada tubo. Transferencia del lavado en el tubo de la resuspensión de la membrana. Repita el paso de lavado para los restantes tres series de cuatro tubos. </li><li> Incubar la resuspensión de membrana con balanceo suave durante 30 minutos a temperatura ambiente para degradar el ADN y la ayuda en la reducción de material floculante. </li><li> Eliminar una pequeña alícuota de la suspensión de membrana y llevar a cabo la cuantificación de proteínas para determinar el rendimiento total de la membrana. Por lo general preparan sin diluir, 01:01 diluido (en el 2,5% SDS), y 1:3 diluido (en el 2,5% SDS) muestras de membrana, el calor de las muestras a 90 ° C durante 10 minutos, y el uso del ensayo BioRad DC Proteína de cuantificar la resuspensión de concentración de proteínas de membrana. Producción de proteína total es por lo general entre 1,0 mg / ml y 1,6 mg / ml. El uso del calor y la Ficha de Seguridad está obligado a liberar OMPs de las membranas extraídas de manera que un valor de la proteína cuantificación más precisa se puede obtener. </li><li> Prepare gradientes lineales de sacarosa por capas de 1,8 ml cada una de las soluciones de sacarosa (p / p, preparado en 5 mM EDTA, pH 7,5) a 14 x 95 mm tubos de ultracentrífuga ultra claro en el siguiente orden: 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%. Capas de gradientes de sacarosa es más fácil de realizar cuando se utiliza una pipeta de bulbo, no una pipeta automática. </li><li> En base a la cuantificación de proteínas de membrana resuspensión (Paso 16), la capa de 1,5 mg de resuspensión de membrana en la parte superior de cada gradiente. Cada 14 x 95 tubo de ultracentrífuga mm tiene una capacidad máxima de 12,5 ml y, dado que el 10,8 ml se explica por las soluciones de sacarosa a partir del paso 17, no se debe cargar más de 1,7 ml de la resuspensión de la membrana por gradiente. Individualmente pesan y ajustar cuidadosamente el peso final de cada tubo de gradiente de sacarosa (añadiendo o quitando la resuspensión de membrana), de modo que todos los tubos tienen el mismo peso (± 0,01 g). </li><li> Transferencia de gradientes de sacarosa en un cubo de rotor SW-40Ti movimientos de balanceo y centrifugado a 256.000 xg (38.000 rpm) durante un mínimo de 17 horas a 4 ° C. </li></ol> Día 4: Recolección de fracciones gradiente de sacarosa <ol><li> Después de 17 h de la centrifugación, detener la ejecución de centrífuga, y retirar con cuidado gradientes de sacarosa del rotor SW-40Ti. </li><li> Limpie cuidadosamente la parte inferior del tubo de gradiente de sacarosa con 70% de etanol, la punción de laparte inferior del tubo con una aguja 21G, y recoger secuencial 500 fracciones l del gradiente en tubos de microcentrífuga estéril. Repita el procedimiento para gradientes posteriores. El gradiente se debe permitir que por goteo por gravedad, a fin de no perturbar el gradiente de sacarosa. Sin embargo, si cesa el goteo de la parte inferior del tubo de gradiente, una pequeña cantidad de presión se puede aplicar a la parte superior del tubo con el dedo. </li><li> Determinar el índice de refracción de cada fracción de gradiente de sacarosa con un refractómetro y correlacionar el índice de refracción con un peso específico en g / ml 1. Evaluar la localización de la proteína mediante la preparación de representante de las fracciones gradiente de sacarosa (incrementos de la densidad de 0,01, de 1,11 g / ml a 1,26 g / ml) para la separación SDS-PAGE, transferencia a nitrocelulosa y de inmunotransferencia. </li></ol> Resultados representante Cuando se realiza correctamente, este procedimiento resulta en la separación completa de la mensajería instantánea y las vesículas OM, tanto Tipo A (por ejemplo, SchuS4) y B (por ejemplo, LVS) de las cepas de F. tularensis. Como se muestra en immunoblots representante en la figura 1, F. OMPs tularensis localizar entre las densidades de 1,17 y 1,20 g / ml. En comparación, el PIM localizar entre las densidades de 1,13 y 1,14 g / ml. <img src="/files/ftp_upload/2044/2044fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Immunoblotting de F. tularensis gradientes de densidad de sacarosa. Secuencial fracciones se obtuvieron de los degradados y las densidades (g / ml) se calcula en base a índices de refracción. Las proteínas fueron separadas por SDS-PAGE, transferidos a nitrocelulosa, y inmunoblot para detectar OMP y fraccionamiento IMP. mw, prestained estándares de peso molecular con un tamaño (en kDa) señaló en el lado izquierdo de cada mancha. LVS, lisados ​​de células enteras de F. LVS tularensis. La densidad de sacarosa correspondiente fracción de gradiente se observan por encima de sus carriles respectivos. OMPs y PIM, como se señala en el margen izquierdo, se detectaron con el antisuero policlonal monoespecífico. Resultados similares fueron obtenidos por F. tularensis SchuS4.

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<li>Sjostedt, A., Tarnvik, A., Sandstrom, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+T-cell-stimulating+17-kilodalton+protein+of+Francisella+tularensis+LVS+is+a+lipoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">The T-cell-stimulating 17-kilodalton protein of Francisella tularensis LVS is a lipoprotein.</a> Infect Immun. 59 (9), 3163-3163 (1991).</li>
<li>Twine, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Francisella+tularensis+proteome%3A+low+levels+of+ASB-14+facilitate+the+visualization+of+membrane+proteins+in+total+protein+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Francisella tularensis proteome: low levels of ASB-14 facilitate the visualization of membrane proteins in total protein extracts.</a> J Proteome Res. 4 (5), 1848-1848 (2005).</li>
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Este protocolo describe una variación de la lisis spheroplasting, osmótica, y la densidad de centrifugación en gradiente de sacarosa &quot;patrón oro&quot; para la separación física y el enriquecimiento de las bacterias Gram-negativas OM de otros componentes celulares 2, 3, 4. Mientras que se ha descrito anteriormente la aplicación de este método para aislar OM de ambas cepas del tipo A y tipo B de F. tularensis 5, esta presentación ofrece un procedimiento más detallado y optimizado para el aislamiento de OM. De hecho, este es un avance importante para la identificación de potenciales de superficie expuesta y los factores de virulencia de este presunto patógeno mortal. La importancia de este procedimiento se ha demostrado en estudios realizados por nuestro laboratorio muestran que la inmunización de ratones con OMPs purificadas conceden una considerable protección contra el tipo A virulenta F. tularensis pulmonar reto 6. Como se señaló anteriormente, la fase de crecimiento de las células bacterianas, un monitoreo cuidadoso durante la lisis osmótica y la resuspensión de pellets suave membrana son pasos críticos que parecen estar en correlación con el éxito / fracaso de este procedimiento de separación por membranas. Si bien este método optimizado es riguroso y está sujeto a cierta variabilidad experimental, el resultado OM parecen ser de calidad muy mejorada en comparación con los obtenido por el uso de detergentes, cloruro de litio, carbonato de sodio o 7, 8, 9, 10, 11, 12.

<table><tbody><tr><td>Suero de ternera donante</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>35-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>IsoVitaleX</td><td>BD Biosciences</td><td>211876</td><td></td></tr><tr><td>Agua destilada grado molecular Cellgro dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de policarbonato de 38,5 ml</td><td>FiberLite</td><td>010-0514</td><td></td></tr><tr><td>Rotador de ultracentrífuga F50L-8x39</td><td>FiberLite</td><td>096-087051</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel completo de inhibidores de proteasas sin EDTA</td><td>Roche Group</td><td>04693132001</td><td></td></tr><tr><td>Benzonasa</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>70664-3</td><td></td></tr><tr><td>Ensayo de proteína DC</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga Ultra-Clear de 14x95 mm</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>344060</td><td></td></tr><tr><td>Rotador tipo cubeta oscilante SW-40Ti</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>331301</td><td></td></tr><tr><td>Refractómetro de banco Abbe</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-964-10</td><td></td></tr></tbody></table>

método para el aislamiento de francisella tularensis membranas externas

Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes

Francisella tularensis es un cocobacilo Gram-negativa intracelular y el agente causante de la tularemia enfermedad zoonótica. En comparación con otros patógenos bacterianos, la dosis infecciosa muy baja (&lt;10 UFC), la progresión rápida de la enfermedad, y la morbilidad y mortalidad sugieren que las cepas virulentas de Francisella codifican factores de virulencia de la novela. Superficie expuesta moléculas, las proteínas de membrana externa a saber (OMP), se ha demostrado que promover la unión de la célula huésped bacteriana, de entrada, la supervivencia intracelular, la virulencia y la evasión inmune. La relevancia para el estudio de OMPs es aún más por el hecho de que pueden servir como vacunas de protección contra una serie de enfermedades bacterianas. Mientras que OMPs se puede extraer de bacterias gram-negativas a través de técnicas de mayor extracción de la membrana, incluyendo la sonicación de las células, seguido de centrifugación y / o extracción con detergente, estas preparaciones son a menudo contaminados con periplásmico y / o citoplásmica (interior) de la membrana (IM) los contaminantes. Durante años, el &quot;patrón oro&quot; método para la separación de bioquímica y biofísica de bacterias gram-negativas de mensajería instantánea y las membranas externa (OM) ha sido el de las bacterias sometidas a lisis osmótica y spheroplasting, seguido por centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa. Una vez en capas en un gradiente de sacarosa, la OMS puede ser separado de mensajes instantáneos basados ​​en las diferencias en la densidad de flotación, que se cree basa en gran medida de la presencia de lipopolisacárido (LPS) de la OM. Aquí se describe un método riguroso y optimizado para extraer, enriquecer y aislar F. tularensis membranas externas y sus asociados OMPs.

Un protocolo para la separación de membranas internas y externas de<em&gt; Francisella tularensis</em&gt; Por lisis spheroplasting, osmótica y sacarosa ultracentrifugación en gradiente de densidad.

Método para el aislamiento de Francisella tularensis Membranas externas

Francisella tularensis es un cocobacilo intracelular Gram negativo y el agente causal de la tularemia, una enfermedad zoonótica. Al compararse con otros...

El aislamiento de vesículas de la membrana externa de Francisella y de las proteínas asociadas a esta membrana comienza con la lisis osmótica de las células bacterianas. Las bacterias en fase logarítmica se tratan secuencialmente con soluciones hipertónicas de sacarosa, EDTA y lisozima antes de diluirse lentamente en agua desionizada. Los lisados bacterianos resultantes se someten a una centrifugación a baja velocidad, que elimina los restos celulares y las células no rotas, seguida de una centrifugación a alta velocidad para obtener un precipitado de vesículas de membrana.A continuación, se depositan vesículas de membrana total sobre gradientes de densidad de sacarosa para separar las vesículas de la membrana interna o IM y las de la membrana externa o OM. Las vesículas de OM pueden separarse de las vesículas de IM en función de las diferencias en densidades de flotación, que se cree que dependen principalmente de la presencia de lipopolisacárido o LPS en la OM. La inmunodetección de fracciones sucesivas procedentes de gradientes de densidad de sacarosa muestra una separación espacial de las proteínas de la membrana interna frente a las proteínas de la membrana externa. Hola, soy el Dr. Michael Norgaard, y este es el Dr. Jason Huntley del Departamento de Microbiología del Centro Médico UT Southwestern en Dallas.Hoy, el Dr. Huntley les mostrará un procedimiento para extraer, enriquecer y aislar las membranas externas de Francella cellis y las proteínas de membrana asociadas. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar las moléculas localizadas en la membrana externa y potencialmente expuestas en la superficie de este patógeno bacteriano intracelular. Tenemos un día ocupado, así que comencemos.Para comenzar este procedimiento, prepare y cultive dos cultivos de 500 mililitros de bacterias FCIs según se describe en el protocolo escrito adjunto. Retire los cultivos bacterianos del incubador agitador y tome un mililitro de Eloqua de cada cultivo para la medición de OD, con el fin de obtener células en fase logarítmica temprana de crecimiento, lo que corresponde a una OD 600 entre 0,2 y 0,4. Se obtienen resultados óptimos de extracción y aislamiento de membranas cuando los cultivos alcanzan la OD 600 deseada.Utilice cuatro botellas de centrífuga de 250 mililitros para centrifugar los cultivos a 7.500 G durante 30 minutos a 15 grados Celsius con el fin de recolectar las células. Después de la centrifugación, retire cuidadosamente el sobrenadante del medio de cada botella de centrífuga y golpee firmemente las botellas sobre material absorbente para eliminar el exceso de medio de crecimiento. Dentro de los 10 minutos posteriores a la finalización de la centrifugación, suspenda cada pellet bacteriano en 8,75 mililitros de sacarosa 0,75 molar en tris 5 milimolar pH 7,5.Después de suspender cada pellet, transfiera la solución a un matraz estéril de 250 mililitros que contenga un agitador magnético pequeño. Repita el procedimiento para los cuatro pellets bacterianos, obteniendo una suspensión final de pellets bacterianos con un volumen total de 35 mililitros. Mezcle bien la suspensión celular en una placa agitadora, pero no demasiado rápido.Para evitar espuma o burbujas durante la mezcla lenta, agregue 70 mililitros de EDTA 10 milimolar intereses a la solución durante un período de 10 minutos. Mantenga la punta de la pipeta por debajo del nivel de la suspensión celular para evitar concentraciones locales elevadas de EDTA. Después de agregar el EDTA, incube la solución durante 30 minutos a temperatura ambiente.Luego, mientras continúa mezclando lentamente, agregue 11 mililitros de una solución de lisozima a dos miligramos por mililitro para obtener una concentración final de 200 microgramos por mililitro. Siga mezclando la suspensión celular durante la adición de la solución de lisozima. Como antes, mantenga la punta por debajo del nivel de la suspensión celular.Incube las células con el lisozima durante 30 minutos a temperatura ambiente. Durante esta incubación, prepare un matraz estéril de un litro con una pequeña barra de agitación y 530 mililitros de agua desionizada grado molecular para cultivo celular a temperatura ambiente.Cuando las células hayan terminado la incubación, lisar osmóticamente la suspensión celular utilizando una pipeta de 25 mililitros, apoyada en el fondo del matraz junto al agitador magnético, diluyendo lentamente las células en el agua del matraz de un litro durante un período de 10 a 15 minutos con mezcla suave. Este paso es difícil y es fundamental para el éxito general del experimento. La agitación debe ser lo suficientemente rápida como para dispersar completamente la suspensión celular, pero no demasiado rápida para evitar la formación de espuma o burbujas, según sea necesario.Aumente lentamente la velocidad del agitador magnético para asegurar una mezcla adecuada. Supervise cuidadosamente el proceso de dilución y ajuste la velocidad de flujo o gire el matraz según sea necesario para dispersar acumulaciones locales de células, agregados celulares y filamentos celulares. Una vez que se hayan agregado todas las células, incube la mezcla durante 30 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, transfiera alícuotas de 40 mililitros de la solución de lisis osmótica a tubos cónicos de 50 mililitros y centrifugue a 7.500 G durante 30 minutos a 10 grados Celsius.Para eliminar células intactas y restos celulares tras la centrifugación, retire cuidadosamente de 27 a 30 mililitros de sobrenadante de cada tubo cónico y reúna el sobrenadante en un matraz estéril de un litro. Transfiera 25 mililitros del sobrenadante combinado a cada uno de 16 tubos para ultracentrífuga y centrifugue a 200.000 Gs durante dos horas a cuatro grados Celsius. Diez minutos antes de que finalice la centrifugación.Prepare el tampón de suspensión de membrana modificado. Combine ocho mililitros de tampón de suspensión de membrana con una tableta de una mezcla de inhibidores de proteasas libre de EDTA y 375 unidades de benzonasa en un tubo estéril y mezcle suavemente tras la centrifugación de las células lisadas. Continúe con la recuperación del precipitado de membrana.Una vez completada la ultracentrifugación de las células lisadas, vierta cuidadosamente el sobrenadante, luego invierta los tubos sobre un material absorbente y golpéelos firmemente. Para eliminar el sobrenadante en exceso, marque la ubicación de cada pellet de membrana con un rotulador para facilitar su visualización. Suspender suavemente ocho pellets de membrana con 600 microlitros cada uno de tampón de resuspensión de membranas modificado.Es difícil resuspender los pellet de membrana. Por lo tanto, continúe pasando suavemente el tampón de resuspensión de membrana modificado sobre el pellet hasta que se desprenda de la pared del tubo. Este es otro paso que resulta complicado y crítico para el éxito general del experimento.Si es necesario, utilice la punta de micropipeta para raspar el precipitado de membrana de la pared del tubo. Al pipetear, evite la formación de espuma o burbujas, ya que fuerzas de cizallamiento excesivas provocarán la formación de micelas mixtas, lo que impide la separación de membranas. Transfiera cada suspensión de resuspensión de membranas a otro conjunto de ocho tubos.Reuspenda suavemente los pellets restantes y reúna todas las suspensiones en un tubo estéril. Después de retirar los pellets de membrana de los 16 tubos, lave cada grupo de cuatro tubos con 600 microlitros de tampón modificado de resuspensión de membrana. Enfóquese en el lavado alrededor del área marcada de cada tubo y combine el lavado con las membranas resuspendidas.Repita el lavado para los tubos restantes. Incube la suspensión de membrana resus con agitación suave durante 30 minutos a temperatura ambiente para degradar el ADN y ayudar a reducir el material floculento. A continuación, retire una pequeña alícuota de la suspensión de membrana y realice la cuantificación de proteína.Para determinar el rendimiento total de membrana, prepare una dilución de uno a uno y de uno a tres de la suspensión de membrana en SDS al 2,5 %, y caliente las suspensiones de membrana sin diluir de uno a uno y de uno a tres a 90 grados Celsius durante 10 minutos. Se requiere SDS y calor para liberar O MPS de las membranas extraídas. Utilice el ensayo de proteína BioRad DC para cuantificar la concentración de proteína en la resuspensión de membrana.El rendimiento total de proteína generalmente está entre uno y 1,6 miligramos por mililitro. Una vez determinada la concentración de proteína en la preparación de membranas, las muestras pueden separarse en un gradiente de sacarosa. Comience por preparar una serie de soluciones de sacarosa en EDTA.Para preparar los gradientes lineales de sacarosa, utilice una pipeta con perilla para superponer 1,8 mililitros de cada solución de sacarosa en tubos ultracentrífugos UltraClear de 14 por 95 milímetros en el siguiente orden: 55%, 50%, 45%, 40%, 35% y 30%. A continuación, coloque encima de cada gradiente 1,5 miligramos de suspensión de membranas resuspendidas. No cargue más de 1,7 mililitros de suspensión de membranas resuspendidas por gradiente; pese individualmente cada tubo y ajuste cuidadosamente el peso final añadiendo o eliminando suspensión de membranas, de modo que todos los tubos tengan el mismo peso. Transfiera los gradientes de sacarosa a un rotor oscilante SW 40 TI y centrifugue a 256.000 ×g durante un mínimo de 17 horas a cuatro grados Celsius.Después de 17 horas de centrifugación, detenga la centrifugación y retire cuidadosamente los gradientes de sacarosa del rotor. A continuación, recoja las fracciones. Limpie cuidadosamente la parte inferior del tubo de gradiente de sacarosa con etanol al 70 %.Luego, perfore el fondo del tubo con la aguja de calibre 21 y recoja fracciones secuenciales de 500 microlitros del gradiente en tubos microcentrífugos estériles. Se debe permitir que el gradiente gotee por flujo gravitacional para no perturbar el gradiente de sacarosa. Sin embargo, si cesa el goteo desde el fondo del tubo del gradiente, se puede aplicar una pequeña presión en la parte superior del tubo utilizando el dedo.Finalmente, determine el índice de refracción de cada fracción del gradiente de sacarosa utilizando un refractómetro y correlacione el índice de refracción con una densidad específica en gramos por mililitro. Evalúe la localización de proteínas de fracciones representativas del gradiente de sacarosa mediante separación por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE) e inmunotransferencia. A continuación se muestra una inmunotransferencia de fracciones del gradiente de sacarosa utilizado para separar las membranas extraídas de la cepa vacunal viva Freis, en la que las proteínas de la membrana externa o Omps se localizan entre densidades de 1.17 y 1.2 gramos por mililitro.Por comparación, las proteínas de la membrana interna o ips se localizaron entre densidades de 1,13 y 1,14 gramos por mililitro. Se obtuvieron resultados similares para la cepa FHU cuatro. Acabo de demostrar cómo extraer y aislar vesículas de la membrana externa de Francisella mediante lisis osmótica y ultracentrifugación en gradiente de densidad de sacarosa.Al realizar este procedimiento, es importante recordar utilizar células bacterianas en las fases logarítmicas tempranas de crecimiento, diluyendo lentamente pero de manera constante dichas células bacterianas en agua desionizada durante el paso de glico-osmosis, y tener cuidado al resuspender los pellet de membrana tras la ultracentrifugación. Esto concluye nuestro procedimiento de separación de membranas. Gracias por ver este video y buena suerte en sus futuros experimentos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Fuente: Cian, M. B. et. al., Separación de la envoltura celular de bacterias gramnegativas en fracciones de membrana interna y externa con ajustes técnicos para Acinetobacter baumannii. J. Vis. Exp. (2020)Este video demuestra la separación de las fracciones de membrana interna y externa de bacterias gramnegativas mediante ultracentrifugación en gradiente de sacarosa. Las fracciones de membrana se purifican y almacenan a bajas temperaturas para el análisis específico de componentes específicos...

Separación de las fracciones de membrana interna y externa de bacterias gramnegativas

Fuente: Watson, D. C., et.al. Aislamiento y purificación escalables de vesículas extracelulares de Escherichia coli y otras bacterias. J. Vis. Exp. (2021)Este video demuestra el aislamiento y la concentración de vesículas extracelulares (EV) derivadas de la membrana externa de bacterias modificadas genéticamente. El proceso consiste en cultivar las bacterias para liberar vehículos eléctricos, seguido de pasos secuenciales de centrifugación y filtración para eliminar células y desechos.

Aislamiento y enriquecimiento de vesículas extracelulares derivadas de la membrana externa de bacterias

Fuente: Jung, A. L., et al. Vesículas de membrana externa de Legionella pneumophila: aislamiento y análisis de su potencial proinflamatorio en macrófagos. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demuestra el aislamiento de vesículas de membrana externa (OMVs) de Legionella pneumophila mediante centrifugación secuencial, filtración estéril y ultracentrifugación. Los OMVs purificados, enriquecidos en proteínas de membrana y lipopolisacáridos, son adecuados para estudios de interacción huésped-patógeno.

Aislamiento basado en ultracentrifugación de vesículas de membrana externa de Legionella pneumophila

Este protocolo describe intratraqueal inoculaciones de ratas Fischer 344 con tularensis de francisella. Este procedimiento simula la exposición pulmonar de los seres humanos a este agente potencial de biothreat y puede utilizarse para probar la vacuna y la eficacia terapéutica contra la tularemia pulmonar.

La inoculación de Fischer 344 ratas con Francisella tularensis

Este método proporciona un marco para el estudio de la incorporación de ácidos grasos exógenos de fuentes huésped complejas en membranas bacterianas, particularmente Staphylococcus aureus. Para lograrlo, se describen los protocolos para el enriquecimiento de partículas de lipoproteínas a partir de la yema de huevo de pollo y el posterior perfilado de ácidos grasos de fosfolípidos bacterianos utilizando espectrometría de masas.

Aislamiento de partículas de lipoproteínas de yema de huevo de pollo para el estudio de la incorporación de ácidos grasos patógenos bacterianos en fosfolípidos de membrana

Mycobacterium tuberculosis muestra un aumento de la producción y liberación de vesículas extracelulares en respuesta a condiciones bajas de hierro. Este trabajo detalla un protocolo para generar condiciones de hierro bajas y métodos para la purificación y caracterización de vesículas extracelulares micobacterianas liberadas en respuesta a la deficiencia de hierro.

Aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares producidas por micobacterias limitadas por hierro

Las bacterias gramnegativas producen dos membranas segregadas espacialmente. La membrana externa se divide a partir de la membrana interna por una periplasma y una capa de peptidogglicano. La capacidad de aislar las bicapas duales de estos microbios ha sido fundamental para entender su fisiología y patogénesis.

Separación del sobre celular para bacterias gramnegativas en fracciones de membrana interna y externa con ajustes técnicos para Acinetobacter baumannii

Las bacterias secretan vesículas extracelulares (EV) de tamaño nanométrico que transportan moléculas biológicas bioactivas. La investigación EV se centra en comprender su biogénesis, su papel en las interacciones y enfermedades microbio-microbio y huésped-microbio, así como sus posibles aplicaciones terapéuticas. Se presenta un flujo de trabajo para el aislamiento escalable de vehículos eléctricos de varias bacterias para facilitar la estandarización de la investigación de vehículos eléctricos.

Aislamiento escalable y purificación de vesículas extracelulares de Escherichia coli y otras bacterias

Este protocolo describe la cromatografía de exclusión de tamaño, una técnica fácil y reproducible para enriquecer vesículas extracelulares de Mycobacterium tuberculosis a partir de sobrenadantes de cultivo.

Mycobacterium tuberculosis Enriquecimiento de vesículas extracelulares mediante cromatografía de exclusión de tamaño

Este protocolo describe cómo utilizar la microscopía TIRF para rastrear canales iónicos individuales y determinar su actividad en las membranas lipídicas soportadas, definiendo así la interacción entre el movimiento de la membrana lateral y la función del canal. Describe cómo preparar las membranas, registrar los datos y analizar los resultados.

Imágenes de una sola molécula de la movilidad lateral y la actividad del canal iónico en bicapas lipídicas utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF)

Este protocolo separa las proteínas insolubles de la pared celular y la membrana en fracciones simples (1-5 proteínas) utilizando un enfoque isoeléctrico preparativo (IEF) basado en el punto isoeléctrico, seguido de una separación por peso molecular. Las fracciones resultantes se pueden utilizar directamente para análisis inmunológicos y proteómicos sin necesidad de una mayor purificación.

Separación y fraccionamiento de proteínas de la pared celular y la membrana celular de Mycobacterium tuberculosis para el análisis de proteínas aguas abajo

Aprende a aislar vesículas de membrana externa de Francisella tularensis mediante lisis osmótica y ultracentrifugación en gradiente de sacarosa. Este método permite separar proteínas de membrana externa para estudios de virulencia bacteriana.

Método para el aislamiento de Francisella tularensis Membranas externas

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