Name: Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) para el ensayo dinámico de modificación de las histonas en la expresión génica activado en las células humanas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 20 s
Description: Aprende a realizar ChIP para analizar modificaciones dinámicas de histonas y la ocupación de factores de transcripción en células humanas activadas por interferón gamma. Este método permite estudiar la regulación de la expresión génica.

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Este trabajo es apoyado por la Universidad de Virginia, la Universidad de Virginia y el Centro de Cáncer F. Thomas y Kate Miller Jeffress Memorial Trust. Damos las gracias al James E. Darnell Lab (Rockefeller University) Robert Ross Lab (Fordham University) para las líneas celulares.

PLANIFICACIÓN El día antes de un experimento de chip está previsto, las células deben ser cultivadas de manera que un número suficiente esté disponible. Supongamos que cada chip de ensayo requerirá ~ 1-1,5 x 10 7 células. Siempre el plan de hacer las dos cosas los controles negativos (IgG) y positivo (anticuerpos histona pan) y los experimentos duplicados. Sugerencia - Para obtener las células 2FTGH, cada chip de ensayo requiere alrededor de un 15 cm placa de cultivo de tejidos en la confluencia del 80%. PARTE 1: Preparar la cromatina y REALIZAR chip <ol><li> Eliminar los medios de cultivo e inducir las células de los tiempos requeridos con 20 ml de 10% de suero de ternera cósmica (CCS) / MEDM con IFN-gamma a 5 ng / mL. Vuelva a colocar los medios de comunicación en las placas no inducido con 20 ml de 10% de CCS / DMEM así. </li><li> En una campana de extracción, añadir 540 l de formaldehído 37% a 20 ml de los medios de comunicación (1% concentración final) en el plato de 15 cm. Consejo - placa de inclinación y añadir el formaldehído para el grupo de medios - entonces la placa de roca para repartirla uniformemente. </li><li> Permitir la reticulación de proceder durante 10 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Añadir a la glicina 0,125 M de concentración final para dejar de reticulación. </li><li> Vacío aspirar los medios de comunicación y lavar las células una vez con 10 ml de fosfato de hielo frío (PBS). </li><li> Muestras de células con un rascador de células en PBS ~ 7 ml y se combinan las células (de 6 placas) que fueron tratados de manera idéntica en 50 ml tubo cónico en el hielo. </li><li> Centrífuga (Beckman Coutler Allegra 12-R centrífuga) a 1800 rpm a 4 ° C durante 5 minutos y aspire el PBS. Consejo - Snap congelar el sedimento celular si parar aquí y almacenar a -80 ° C. </li><li> Resuspender el botón celular en tampón de 4 ml Inflamación (25 mM HEPES pH 7,8, 1,5 mM de MgCl2, 10 mM KCl, 0,1% de NP40. Añadir 1 mM DTT, los inhibidores de la proteasa completa y enfriar en hielo antes de su uso) y la transferencia a un 15 mL cónica del tubo. Consejo - El volumen del tampón inflamación es apropiado para una agrupación de 6 placas (~ 6.9 x 10 7 células). Tampón más o menos podría cambiar la eficiencia douncing. </li><li> Incubar la suspensión de células en hielo durante 10 minutos. </li><li> La transferencia de la suspensión a un pre-enfriado douncer 15 ml (Wheaton) y Dounce 20 golpes con su correspondiente mano A. </li><li> Transferencia dounced células a un tubo cónico de 15 ml en hielo. </li><li> Centrifugar a 2500 rpm durante 5 minutos a 4 ° C y descartar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el pellet nuclear (~ 200 l de 6 platos) en 3 ml (15 volúmenes de pellets) de tampón de sonicación (50 mM HEPES pH 7,9, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, desoxicolato de sodio al 0,1%, 0,1% SDS. Añadir inhibidores de la proteasa completa y enfriar en hielo antes de su uso). Consejo - El volumen del tampón de sonicación es apropiado para una agrupación de 6 placas (~ 9.6 x 10 7 células). Tampón más o menos podría cambiar la eficiencia de ultrasonidos. </li><li> Sonicar suspensión de núcleos de hielo durante 10 ciclos (20 segundos on/40 segundos / ajuste de amplitud de 8) con un Sonicator Misonix 3000 equipado con la micropunta. Esto generalmente resulta en un promedio de fragmentos de cromatina 200-1000 bps en tamaño. Consejo - Porque sonicadores variará, la eficiencia de ultrasonidos debe ser determinada empíricamente. Para ello, tomar alícuotas de 20 l antes de ultrasonidos y después de cada ciclo de tratamiento con ultrasonidos. El calor de estas muestras a 65 ° C durante 4 horas. Añadir buffer de ADN de carga y ejecuta un estándar de 1% de agarosa / TBE gel para visualizar fragmentos de ADN.) </li><li> Transferencia de material sonicado a un tubo de centrífuga y centrifugar SS34 durante 20 minutos a 4 ° C a 13000 rpm en un rotor SS34 (Sorvall RC6 Además centrífuga) para precipitar lo que es normalmente una pequeña cantidad de restos celulares. </li><li> Transferir cuidadosamente el sobrenadante a un tubo cónico de 15 ml en hielo. </li><li> Pre-claro añadiendo 360 l de esperma de salmón ADN / proteína A o G agarosa suspensión y balanceo a 4 ° C durante al menos 30 minutos. Sugerencia - Este paso se reduce el ruido en el ensayo que surge de la no-eventos específicos de carácter vinculante. </li><li> Centrifugar a 1000 rpm a 4 ° C durante 5 minutos para que sedimenten las perlas de agarosa. </li><li> Transferencia de pre-aprobados sobrenadante a otro tubo cónico de 15 ml en hielo. </li><li> Medir la A260 unidades de la cromatina pre-aprobados y ajustar el volumen con el tampón de sonicación cuatro (4) unidades de A260 (0,2 mg / mL asumiendo una unidad A260 = 0,050 mg / ml) Sugerencia - Para medir la A260 unidades, diluir 10 l de pre-aprobados de la cromatina en 190 l DDW, blanco del espectrofotómetro con 10 l de tampón de sonicación DDW l 190. </li><li> Ahorre un 75 l de la cromatina (a 4 unidades de A260) como la muestra de entrada y almacenar a 20 ° C hasta que esté listo para invertir enlaces cruzados. Sugerencia - Este paso es crucial para el análisis de datos. No se olviden de tomar la alícuota de entrada. </li><li> Alícuota de la cromatina dispuesta a 1.7 mL tubos de microcentrífuga de ice como alícuotas de 1 ml. Sugerencia - Si se detiene aquí, complemento congelar la cromatina preparados en hielo seco y almacenar a -80 ° C. NB: la cromatina almacenados pueden degradar, producir resultados menos que óptimos, así que evite en lo posible. </li><li> Añadir los anticuerpos chip de calidad a las muestras de inducido y no inducido establece por duplicado. Añadir IgG (2 mg) y de anticuerpos pan Histona H3 (15 l) como controles positivos y negativos de inducido y no inducido conjuntos de muestras. Sugerencia - La cantidad de anticuerpo a utilizar debe ser determinada empíricamente, o consulte la hoja del proveedor de productos para cantidades sugeridas. Típicamente 1-2 mg de un anticuerpo chip-grado funciona bien. El volumen apropiado debe ser determinada empíricamente para los anticuerpos que se suministran como suero. </li><li> Todos los tubos de rock la noche a 4 ° C. </li></ol> PARTE 2: Recopilación de inmunocomplejos <ol><li> Añadir 60 l de ADN de esperma de salmón / proteína A o proteína G agarosa suspensión de todos los tubos. Sugerencia Utilice una proteína de anticuerpos policlonales de conejo y la proteína G de anticuerpos monoclonales de ratón. </li><li> Rock en 4 ° C durante al menos 60 minutos. </li><li> Se precipitan los inmunocomplejos (perlas de agarosa) por microfuging suavemente a 2000 rpm a 4 ° C durante 3 minutos. </li><li> Aspirar el sobrenadante. </li><li> Lavado de los inmunocomplejos con 1 ml de cada uno de los tampones de lavado después de 10 minutos con la oscilación a 4 ° C. Microfuga durante 3 minutos a 2000 rpm a 4 ° C entre cada lavado y aspirado de sobrenadante. Mantener las muestras enfriadas en hielo. Añadir PMSF justo antes del uso. <ul><li> Lavar bajo contenido de sal - 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF </li><li> Lave Salinidad - 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl, pH 8,0, 500 mM NaCl, 1 mM PMSF </li><li> LiCl Wash - 0,25 M LiCl, 1% NP-40, 1% de desoxicolato de sodio, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM PMSF </li><li> TE Wash - dos lavados con buffer TE -10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF </li></ul></li><li> Quitar el último lavado de buffer TE y de las cuentas, añadir 500 l Tampón de Elución (50 mM Tris-Cl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 1% SDS). Consejo - el tampón de elución debe estar recién preparadas. </li><li> Vortex para mezclar bolas de agarosa en tampón de elución y el calor durante 30 minutos a 65 ° C. Consejo - cada tubo de vórtice por lo menos cada 10 minutos durante estos 30 minutos. </li><li> Microcentrífuga durante 30 segundos a 2000 rpm y transferir el eluyente a un tubo de microcentrífuga nuevo. Consejo - Durante la elución, descongelar las muestras de entrada y añadir 500 l Tampón de Elución a cada uno. Incluir estas muestras en todos los pasos en el futuro. </li><li> Añadir 5 M NaCl hasta una concentración final de 200 mM a todas las muestras y agitar. </li><li> Se incuba a 65 ° C durante la noche (o por lo menos 4 horas). </li></ol> PARTE 3: ChIP'd purificar y entrada de ADN <ol><li> Microfuga todas las muestras durante 30 segundos para recoger la condensación en las tapas. </li><li> Añadir 1μL de RNasa A (10 U / l) a cada tubo y se incuban a temperatura ambiente durante 15 minutos. </li><li> Añadir 10 l de EDTA 0,5 M, 40 ml 0,5 M Tris-Cl pH 6,5, 2 l de proteinasa K (10 mg / ml) y se incuba a 45 ° C durante 60 minutos. Consejo Prepare una mezcla maestra de estos reactivos y añadir 52 l de cada tubo. </li><li> Fenol / cloroformo / isoamílico extracto de alcohol y cloroformo / alcohol isoamílico extraer las muestras. </li><li> Añadir 2 glucógeno l (25 mg / l) y 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3M pH 5,2 y mezclar. </li><li> Añadir 2.5 volúmenes de etanol al 100% y agitar. </li><li> Se incuba a 20 ° C durante la noche. </li></ol> PARTE 4: ChIP'd purificar y continuo aporte de ADN <ol><li> Muestras de microcentrífuga durante un mínimo de 20 minutos a 13000 rpm a 4 ° C para precipitar el ADN / pellets de glucógeno. </li><li> Lavar con sedimentos de ADN / glucógeno con 1 ml de etanol al 70%. </li><li> Seque al aire los pellets o se secan rápidamente en el ADN de centrífuga de vacío Savant velocidad. Sugerencia - No más seco del ADN. </li><li> Resuspender el ADN / pellets de glucógeno en 200 l de buffer TE. </li><li> ADN (1 l) está listo para la cuantificación mediante PCR en tiempo real. Tienda resto de ADN a 20 ° C. Consejo - El uso de más de 1 l de ADN puede inhibir las reacciones de PCR en tiempo real, por lo que ampliar con precaución. </li></ol> Parte 5: RESULTADOS DEL REPRESENTANTE: Muestras de chips de ADN y de entrada se han cuantificado con el Real-Time PCR 7,8 (Applied Biosystems 7500 Rápido PCR en tiempo real del sistema) con iniciadores específicos para el locus del gen de interés. Cebadores que la secuencia genómica conocida objetivo de ser enriquecido en o falta en la modificaciones de las histonas que se analizaron se pueden utilizar como controles positivos y negativos. Los datos se presentan como porcentaje de la entrada. El procedimiento de chip debe ser totalmente repeated con tres repeticiones biológica para asegurar los cambios reportados en modificaciones de las histonas son estadísticamente significativas. Hay varios aspectos importantes a considerar cuando se utiliza PCR en tiempo real para cuantificar el ADN, incluyendo el primer diseño, eficiencia de la PCR, y la forma apropiada de calcular el porcentaje de procedimientos de entrada y la normalización. Cuando el perfil de ocupación de modificación de las histonas a través de un gen, la eficiencia de la PCR debe ser consistente entre todos los pares de cebadores. El fabricante de PCR en tiempo real del sistema puede proporcionar la información necesaria y la capacitación. La figura 1 muestra los resultados representativos de la cromatina immunoprecipitated STAT1 en la activación del gen IRF1 9, provocada por el IFN-γ. <img src="/files/ftp_upload/2053/2053fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Ocupación de STAT1, la RNA polimerasa II y H3K36me3 es dinámica durante STAT1 la activación del gen IRF1. (A, B, C) ​​con chip α-H3K36me3, STAT1 α y α-Pol II de la cromatina de las células recogidas 2FTGH inducidos con IFN-γ durante 30 minutos (cuadrados rojos), 1,5 horas (círculos azules), 5 horas ( triángulos verdes) o inducidas (diamante negro). IgG es el control negativo (gris cruces). (D) Pan H3 es el control positivo y muestra la ocupación de las histonas en el lugar en el inducido (círculos azules) y las condiciones no inducidas (diamante negro). La inmersión alrededor de -5 pb se debe a la disminución de nucleosomas que se encuentra en los sitios de inicio de la transcripción.

<ol><li>Levy, D., Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling%3A+Stats%3A+transcriptional+control+and+biological+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Signalling: Stats: transcriptional control and biological impact.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 651-662 (2002).</li>
<li>Bromberg, J., Darnell, J. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+STATs+in+transcriptional+control+and+their+impact+on+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The role of STATs in transcriptional control and their impact on cellular function.</a> Oncogene. 19, 2468-2473 (2000).</li>
<li>Hu, X., Ivashkiv, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-regulation+of+signaling+pathways+by+interferon-gamma%3A+implications+for+immune+responses+and+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cross-regulation of signaling pathways by interferon-gamma: implications for immune responses and autoimmune diseases.</a> Immunity. 31, 539-550 (2009).</li>
<li>Campos, E. I., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histones%3A+annotating+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Histones: annotating chromatin.</a> Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+Modifications+and+Their+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin Modifications and Their Function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293, 1074-1080 (2001).</li>
<li>Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+fluorescence+monitoring+of+rapid+cycle+DNA+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification.</a> Biotechniques. 22 (130-131), 134-138 (1997).</li>
<li>Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S., Griffith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+amplification+and+detection+of+specific+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%28N+Y%29%22%5BJournal%5D)">Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences.</a> Biotechnology (N Y). 10, 413-417 (1992).</li>
<li>Kroger, A., Koster, M., Schroeder, K., Hauser, H., Mueller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activities+of+IRF-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Activities of IRF-1.</a> J Interferon Cytokine Res. 22, 5-14 (2002).</li>
<li>Ross, R. A., Spengler, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neuroblastoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cancer+biology%22%5BJournal%5D)">Human neuroblastoma stem cells.</a> Seminars in cancer biology. 17, 241-247 (2007).</li>
</ol>

El protocolo indica chip se ha utilizado con éxito en el laboratorio de ensayo de más de veinte diferentes modificaciones de las histonas. Además, se han caracterizado los cambios en la ocupación de los factores de transcripción, histonas modificación de enzimas, proteínas que reconocen modificaciones de las histonas y el ARN polimerasa II maquinaria de transcripción, en varios de IFN-γ inducida por los genes. También hemos utilizado el procedimiento para caracterizar los cambios en las modificaciones de las histonas du...

<table><tbody><tr><td>Formaldehído al 37%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo/alcohol isoamílico</td><td>Acros Organics</td><td>AC32715-5000</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidores completos de proteasas Mini</td><td>Roche Group</td><td>1836153</td><td></td></tr><tr><td>Suero de ternera cósmico</td><td>Hyclone</td><td>SH30087.04N</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30243</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118-500</td><td></td></tr><tr><td>Etil alcohol</td><td>Pharmco Products, Inc.</td><td>zp1110EP</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Roche Group</td><td>100149</td><td></td></tr><tr><td>Glicógeno</td><td>Roche Group</td><td>901393</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>IFN-gamma</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>285-IF-100</td><td></td></tr><tr><td>IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-005-003</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>MP Biomedicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Sal sódica del ácido desoxicólico</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP349-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>US Biological</td><td>N3500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-histona H3, CT, pan</td><td>EMD Millipore</td><td>07-690</td><td></td></tr><tr><td>Fenol/cloroformo/isoamilo</td><td>Fisher Scientific</td><td>108-95-2</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>EMD Millipore</td><td>50-230-0316</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>5 PRIME</td><td>2500140</td><td></td></tr><tr><td>RNAsa A</td><td>5 PRIME</td><td>2500130</td><td></td></tr><tr><td>ADN de esperma de salmón/agarosa de proteína A</td><td>EMD Millipore</td><td>16-157</td><td></td></tr><tr><td>ADN de esperma de salmón/agarosa de proteína G</td><td>EMD Millipore</td><td>16-201</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Tritón X-100</td><td>Acros Organics</td><td>327372500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-K36me3</td><td>Abcam</td><td>ab9050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-STAT1</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-345X</td><td></td></tr><tr><td>Anti-RNA polimerasa II</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-899</td><td></td></tr></tbody></table>

inmunoprecipitación de cromatina (chip) para el ensayo dinámico de modificación de las histonas en la expresión génica activado en las células humanas

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

En respuesta a una variedad de ligandos extracelulares, el STAT (transductor de señal y activador de la transcripción) factores de transcripción son rápidamente contratados en su estado latente en el citoplasma a los receptores de superficie celular en el que se activan por fosforilación en un único residuo de tirosina 1. A continuación, dímeros y trasladar al núcleo para conducir la transcripción de genes diana, lo que afecta el crecimiento, la diferenciación, la homeostasis y la respuesta inmune. No es de extrañar, dada su amplia participación en los procesos celulares normales, la desregulación de la función STAT contribuye a la enfermedad humana, en particular con el cáncer y enfermedades autoinmunes 2 3. Está bien establecido que la transcripción está regulada por la alteración de la plantilla de 4,5 cromatina. Estas alteraciones incluyen las actividades de la ATP-dependientes de los complejos, así como covalentes modificaciones de las histonas y la metilación del ADN 6. Debido a la activación de STAT de la expresión génica es a la vez rápido y transitorio, se requiere de mecanismos específicos para la modulación de la plantilla de la cromatina en los loci de genes dependientes de STAT. Para definir estos mecanismos, que caracterizan a la modificaciones de las histonas y la actividad enzimática que los generan en los loci de genes que responden a STAT de señalización. Este protocolo describe inmunoprecipitación de cromatina, un método que es valioso para el estudio de STAT de señalización de la cromatina en la expresión de genes activados.

Este protocolo describe cómo inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) se utiliza para estudiar las alteraciones dinámicas de la plantilla de la cromatina que regulan la transcripción inducida por una vía de transducción de señal.

Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) para el ensayo dinámico de modificación de las histonas en la expresión génica activado en las células humanas

En respuesta a una variedad de ligandos extracelulares, los factores de transcripción STAT (transductor de señal y activador de la transcripción) son reclutados rápidamente...

El experimento de chip se utiliza para monitorear los cambios dinámicos en las modificaciones de histonas que ocurren durante la expresión génica activada por STAT1. Asimismo, se pueden analizar alteraciones en la ocupación de factores de transcripción, complejos modificadores de histonas y la maquinaria de transcripción misma de esta manera. Para comenzar el ensayo, se inducen las células con interferón gamma para activar la señalización de STAT1, se entrecruzan las células con formaldehído y se recolectan. A continuación, se procede a aislar los núcleos y se sonicar, lo que rompe la cromatina en fragmentos de aproximadamente 200 a 1000 pares de bases. Luego, se añade un anticuerpo que reconoce la proteína o modificación de histona de interés y se precipitan los complejos inmuno.Los complejos inmuno son lavados, se invierten los enlaces cruzados y se purifica el ADN. Los cambios en las modificaciones histónicas o el reclutamiento de proteínas a regiones específicas de un gen se pueden determinar mediante análisis cuantitativo de PCR en tiempo real del ADN inmuno precipitado. Hola, me llamo Lauren Borow del laboratorio de la Dra. Melissa Hendrickson y del Departamento de Biología de la Universidad de Virginia.Hoy les mostraremos un procedimiento para la inmunoprecipitación de cromatina. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar las modificaciones histónicas dinámicas que ocurren durante la transcripción a continuación de la señalización de STAT1. Así que comencemos.Un día antes de comenzar este procedimiento, cultive la célula para disponer de una cantidad suficiente para las dos células FTGH utilizadas aquí. Prepare un platillo de cultivo tisular de 15 centímetros al 80 % de confluencia por cada ensayo con chip. En cada experimento incluya un control negativo de IgG, un control positivo con anticuerpo pan-histona y réplicas duplicadas.Para comenzar este procedimiento, retire el medio de cultivo. Sustitúyalo con 20 mililitros de DMEM suplementado con 10% de suero de ternera cósmico y que contenga interferón gamma a cinco nanogramos por mililitro. Además, sustituya el medio en las placas no inducidas con 20 mililitros de C-C-S-D-M-E-M al 10%.A continuación, trabaje en una campana extractora. Incline la placa de cultivo de tejidos de 15 centímetros y agregue 540 microlitros de una solución de formaldehído al 37% a 20 mililitros de medio. Luego, mueva suavemente la placa para distribuirlo uniformemente.Deje que la reacción de entrecruzamiento proceda durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, agregue glicina hasta una concentración final de 125 milimolar para detener la reacción de entrecruzamiento. Aspire al vacío el medio y lave las células una vez con 10 mililitros de PBS frío con hielo utilizando una espátula para células, recoja las células en aproximadamente siete mililitros de PBS y combine las células tratadas de manera idéntica provenientes de seis placas de 15 centímetros en un tubo cónico de 50 mililitros sobre hielo.Finalmente, centrifugue las células recolectadas a 1.800 RPM durante cinco minutos a cuatro grados Celsius y aspire el PBS. Si se detiene aquí, congеле rápidamente la muestra celular y almacénela a menos 80 grados Celsius tras el reticulado. El siguiente paso es preparar la cromatina.Comience añadiendo DTT un milimolar e inhibidores completos de proteasas al tampón de hinchamiento enfriado en hielo. Re-suspenda el precipitado de seis placas en cuatro mililitros del tampón de hinchamiento y transfiera a un tubo cónico de 15 mililitros. Usar más o menos tampón podría alterar la eficiencia del baile.Incube la suspensión celular en hielo durante 10 minutos. Una vez finalizada la incubación en hielo, transfiera la suspensión a un tubo cónico de 15 mililitros previamente enfriado y homogenice. Realice 20 movimientos con el pistilo A. Después de homogenizar, transfiera las células de vuelta a un tubo cónico de 15 mililitros y coloque en hielo. Centrifugue a 2.500 RPM durante cinco minutos a cuatro grados Celsius y deseche el sobrenadante, dejando el sedimento nuclear.Añada inhibidores completos de proteasas al tampón de sonicación enfriado en hielo. Seis placas producen aproximadamente 200 microlitros de resuspensión del pellet nuclear. Suspenda el pellet en 15 volúmenes del pellet o tres mililitros del tampón de sonicación.El uso de un volumen diferente para esta cantidad de células podría alterar la eficiencia de la sonicación. La eficiencia de la sonicación debe determinarse previamente para el equipo de su laboratorio. Aquí se utiliza un sonicador Miss Sonic 3000 equipado con el microchip.Sonicar la suspensión de núcleos en hielo durante 10 ciclos de 20 segundos encendidos y 40 segundos apagados, con un ajuste de amplitud de ocho. Esto generalmente produce fragmentos de cromatina cuyo tamaño promedio oscila entre 200 y 1000 pares de bases al finalizar la sonicación. Transferir el material sonicado a un tubo para centrífuga SS 34 y centrifugar a 13.000 RPM durante 20 minutos a cuatro grados Celsius.En un rotor SS 34, centrifugue para obtener el sedimento de los restos celulares, que generalmente es una pequeña cantidad. Transfiera cuidadosamente el sobrenadante a un tubo cónico de 15 mililitros sobre hielo. Proceda al fraccionamiento para reducir el fondo proveniente de eventos de unión no específica.Primero, preclear la preparación de cromatina añadiendo 360 microlitros de suspensión de perlas de agarosa A o G con ADN de esperma de salmón y agitando a cuatro grados Celsius durante al menos 30 minutos. Centrifugar a 1000 RPM durante cinco minutos a cuatro grados Celsius para obtener un precipitado de las perlas de agarosa. Luego, transferir el sobrenadante preclearado a otro tubo cónico de 15 mililitros sobre hielo.A continuación, mida la absorbancia a 260 nanómetros o las unidades A260 de la cromatina. Diluya 10 microlitros de cromatina previa en 190 microlitros de agua doblemente destilada. Para el blanco, combine 10 microlitros de tampón de sonicación con 190 microlitros de agua doblemente destilada.Ajuste el volumen de la muestra con tampón de sonicación hasta alcanzar cuatro unidades A 260. Guarde 75 microlitros del cromatina pre-limpiado a cuatro unidades A 260 como muestra de entrada y almacénela a menos 20 grados Celsius hasta que esté listo para revertir los enlaces cruzados. Recuerde que este paso es crucial para el análisis de datos.Por lo tanto, no olvide tomar la alícuota de entrada y dispensar el resto de la preparación de cromatina en alícuotas de un mililitro en tubos microcentrífugos de 1,7 mililitros sobre hielo. Si se detiene aquí, congele rápidamente el cromatina preparado en hielo seco y almacénelo a menos 80 grados Celsius.Sin embargo, dado que la cromatina almacenada puede degradarse, lo mejor es continuar con el ip. Ahora agregue los anticuerpos de grado chip a los conjuntos de muestras inducidas y no inducidas. En duplicado.Normalmente, una a dos microgramos de anticuerpo funcionan bien, pero la cantidad debe determinarse empíricamente con anterioridad. Añada dos microgramos de IgG y 15 microlitros de anticuerpo pan histona H tres como controles negativo y positivo a los conjuntos de muestras inducidas y no inducidas. Asimismo, agite suavemente todos los tubos durante la noche a cuatro grados Celsius antes de proceder a aislar los complejos inmuno tras la incubación nocturna con los anticuerpos.Añada 60 microlitros de suspensión de perlas de ADN de esperma de salmón con proteína A o proteína G a todos los tubos. Incube a cuatro grados Celsius durante al menos 60 minutos para unir los complejos inmunes a las perlas.Centrifugar suavemente los complejos inmunes unidos a las perlas de agarosa a 2000 RPM durante tres minutos a cuatro grados Celsius y aspirar el sobrenadante. A continuación, realizar una serie de lavados con tampón, comenzando con un lavado de baja salinidad, seguido de un lavado de alta salinidad. Luego, un lavado con cloruro de litio.Y finalmente, dos lavados con TE para cada uno de los tampones de lavado. Añada PMSF inmediatamente antes de usar, lave con un mililitro de tampón durante 10 minutos con agitación horizontal a cuatro grados Celsius, centrifugue durante tres minutos a 2000 RPM a cuatro grados Celsius y aspire el sobrenadante, manteniendo las muestras frías sobre hielo. Tras eliminar el último lavado con tampón TE, añada 500 microlitros de tampón Lucian recién preparado a las perlas, vortexee para mezclar las perlas aros en el tampón Lucian y caliente durante 30 minutos a 65 grados Celsius.Vortexee cada 10 minutos mientras las muestras se eluyen, descongele las muestras de entrada y añada 500 microlitros de tampón de elución a cada una. Incluya estas muestras en todos los pasos siguientes. Una vez que las muestras finalicen la incubación a 65 grados Celsius, microfúndalas cada 30 segundos a 2000 RPM y transfiera el EENT a un nuevo tubo microfuga.Finalmente, invierta el entrecruzamiento. Añada cloruro de sodio cinco molar hasta una concentración final de 200 milimolar a todas las muestras y vortexee en un incubador a 65 grados Celsius durante al menos cuatro horas hasta toda la noche. Una vez que se hayan revertido los enlaces cruzados de los complejos inmunes, el ADN ligado puede recuperarse cuando finalice la incubación a 65 grados Celsius.Microcentrifugar las muestras durante 30 segundos. Para recoger la condensación en las tapas, añadir un microlitro de ARNs A a cada tubo e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos tras el tratamiento con ARNs a cada tubo con 10 microlitros de EDTA 0,5 molar, 40 microlitros de Tris-cloruro 0,5 molar pH 6,5 y dos microlitros de proteinasa K, o un total de 52 microlitros a partir de una mezcla maestra, e incubar a 45 grados Celsius durante 60 minutos. Extraer las muestras con fenol-cloroformo, alcohol isoamílico, y luego con cloroformo-alcohol isoamílico.Luego, para precipitar el ADN, agregue dos microlitros de glicógeno y 0,1 volúmenes de acetato de sodio tres molar, pH 5,2, a cada muestra y vortexee. Añada 2,5 volúmenes de etanol al 100 %, vortexee nuevamente e incube a menos 20 grados Celsius durante la noche. Recupere las muestras y centrifugue a 13.000 RPM durante 20 minutos a cuatro grados Celsius.Lave los pellet de glicógeno de ADN con un mililitro de etanol al 70 % y aire seco. Seque los pellet al aire o utilice una centrífuga de vacío rápido. No seque en exceso el ADN; re suspenda los pellet en 200 microlitros de tampón TE y cuantifique no más de un microlitro mediante PCR en tiempo real.Las PCR mostradas aquí son los resultados de un experimento de chip que sigue la dinámica de H three K 36 ME three. Durante la inducción por interferón gamma del gen IRF one, se utilizó un anticuerpo contra H three K 36 ME three para inmunoprecipitar cromatina recolectada de células FTGH inducidas con interferón gamma durante 30 minutos, 1,5 horas y cinco horas, utilizando IgG como control negativo. También se determinó la ocupación de STAT one en estos puntos temporales, al igual que la ocupación de la ARN polimerasa dos.La ocupación de histonas a lo largo del locus del gen IRF uno se determinó para las condiciones no inducidas e inducidas utilizando el anticuerpo pan-histona tres, que también sirve como control positivo. La depresión alrededor de menos cinco pares de bases se debe al agotamiento de nucleosomas que se encuentra en los sitios de inicio de la transcripción. Acabamos de mostrarle el procedimiento para la inmunoprecipitación de cromatina.Este ensayo es útil para observar las modificaciones de la cromatina que ocurren durante la transcripción génica activada. Al realizar este procedimiento, es importante optimizar el procedimiento de fragmentación de su cromatina con su ator antes de comenzar un experimento de chip. También recuerde tomar sus muestras de entrada.Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) para el ensayo dinámico de modificación de las histonas en la expresión génica activado en las células humanas (Video) | JoVE Journal

Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) para el ensayo dinámico de modificación de las histonas en la expresión génica activado en las células humanas

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