Name: Cómo Cultura, Registro y estimular las redes neuronales en matrices de micro-electrodos (MEA) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Aprenda a cultivar, registrar y estimular redes neuronales en matrices de microelectrodos (MEA) usando neuronas corticales de rata. Este método permite estudiar la actividad de redes neuronales in vitro durante períodos prolongados.

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Nos gustaría agradecer a los miembros del grupo de Potter para proporcionar valiosos comentarios sobre el protocolo. Este trabajo fue financiado por una beca de formación en investigación clínica de la Academia Americana de Neurología Fundación para la CMS, una beca del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (NIGMS; <a href="http://www.nigms.nih.gov/">http://www.nigms.nih.gov/</a> ) a JDR (GM08169 ), una beca del Instituto de NIH Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NS054809), una Ruth L. Kirschstein de Investigación del Servicio Nacional de Premio a JDR (NS060392), un NSF Efri subvención (0.836.017), el Premio de la Fundación de Investigación Traslacional Coulter, y un beca de investigación traslacional de JDR (NS007480).

<ol><li>Potter, S. M., DeMarse, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+neural+cell+culture+for+long-term+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A new approach to neural cell culture for long-term studies.</a> J Neurosci Methods. 110, 1-2 (2001).</li>
<li>Rambani, K., Vukasinovic, J., Glezer, A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+thick+brain+slices%3A+an+interstitial+3D+microperfusion+system+for+enhanced+viability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Culturing thick brain slices: an interstitial 3D microperfusion system for enhanced viability.</a> J Neurosci Methods. 180, 243-254 (2009).</li>
<li>Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+electrical+stimuli+shape+behavior+of+an+embodied+cortical+network+in+a+goal-directed+learning+task%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal electrical stimuli shape behavior of an embodied cortical network in a goal-directed learning task.</a> J Neural Eng. 5, 310-323 (2008).</li>
<li>Shahaf, G., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+in+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Learning in networks of cortical neurons.</a> J Neurosci. 21, 8782-8788 (2001).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Nadasdy, Z., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+dynamic+attractors+in+activity+patterns+of+cultured+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+E+Stat+Nonlin+Soft+Matter+Phys%22%5BJournal%5D)">Persistent dynamic attractors in activity patterns of cultured neuronal networks.</a> Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 73, 051907-05 (2006).</li>
<li>Esposti, F., Signorini, M. G., Potter, S. M., Cerutti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+long-term+correlations+in+dissociated+cortical+neuron+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Neural+Syst+Rehabil+Eng%22%5BJournal%5D)">Statistical long-term correlations in dissociated cortical neuron recordings.</a> IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 17, 364-369 (2009).</li>
<li>Madhavan, R., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+recurring+spatiotemporal+activity+patterns+in+cortical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of recurring spatiotemporal activity patterns in cortical networks.</a> Phys Biol. 4, 181-193 (2007).</li>
<li>Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+plasticity+in+cortical+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Network plasticity in cortical assemblies.</a> Eur J Neurosci. 28, 221-237 (2008).</li>
<li>Hofmann, F., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+recordings+with+microelectrode+arrays%3A+studies+of+transcription-dependent+neuronal+plasticity+and+axonal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Paris%22%5BJournal%5D)">Long term recordings with microelectrode arrays: studies of transcription-dependent neuronal plasticity and axonal regeneration.</a> J Physiol Paris. 99, 2-3 (2006).</li>
<li>Gortz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+reduction+of+spontaneous+neuronal+network+activity+by+sublethal+amyloid+beta+%281-42%29+peptide+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Transm%22%5BJournal%5D)">Transient reduction of spontaneous neuronal network activity by sublethal amyloid beta (1-42) peptide concentrations.</a> J Neural Transm. 116, 351-355 (2009).</li>
<li>Koito, H., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rat+brain+aggregate+cultures+for+neuron+and+glia+development+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of rat brain aggregate cultures for neuron and glia development studies.</a> J Vis Exp. 31, (2009).</li>
<li>Brewer, G. J., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+growth+of+hippocampal+neurons+in+defined+medium+at+low+density%3A+advantages+of+a+sandwich+culture+technique+or+low+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Survival and growth of hippocampal neurons in defined medium at low density: advantages of a sandwich culture technique or low oxygen.</a> Brain Res. 494, 65-74 (1989).</li>
<li>Lelong, I. H., Petegnief, V., Rebel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cells+mature+faster+on+polyethyleneimine+coated+plates+than+on+polylysine+coated+plates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Neuronal cells mature faster on polyethyleneimine coated plates than on polylysine coated plates.</a> J Neurosci Res. 32, 562-568 (1992).</li>
<li>Potter, S. M., Pine, J., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+transplant+staining+with+DiI+and+vital+imaging+by+2-photon+laser-scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning+Microsc+Suppl%22%5BJournal%5D)">Neural transplant staining with DiI and vital imaging by 2-photon laser-scanning microscopy.</a> Scanning Microsc Suppl. 10, 189-199 (1996).</li>
<li>Rolston, J. D., Gross, R. E., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low-cost+multielectrode+system+for+data+acquisition+enabling+real-time+closed-loop+processing+with+rapid+recovery+from+stimulation+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroengineering%22%5BJournal%5D)">A low-cost multielectrode system for data acquisition enabling real-time closed-loop processing with rapid recovery from stimulation artifacts.</a> Front Neuroengineering. 2, (2009).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+all-channel+stimulator+for+electrode+arrays%2C+with+real-time+control%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">A versatile all-channel stimulator for electrode arrays, with real-time control.</a> J Neural Eng. 1, 39-45 (2004).</li>
<li>van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+characterization+of+firing+dynamics+of+spontaneous+bursts+in+cultured+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 51, 2051-2062 (2004).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extremely+rich+repertoire+of+bursting+patterns+during+the+development+of+cortical+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures.</a> BMC Neurosci. 7, (2006).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+multi-channel+stimulus+artifact+suppression+by+local+curve+fitting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time multi-channel stimulus artifact suppression by local curve fitting.</a> J Neurosci Methods. 120, 113-120 (2002).</li>
<li>Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+activity-dependent+plasticity+of+action+potential+propagation+delay+and+amplitude+in+cortical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-term activity-dependent plasticity of action potential propagation delay and amplitude in cortical networks.</a> PLoS One. 3 (5), e2088-e2088 (2008).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+bursting+in+cortical+cultures+with+closed-loop+multi-electrode+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation.</a> J Neurosci. 25 (3), 680-688 (2005).</li>
<li>Jimbo, Y., Tateno, T., Robinson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+induction+of+pathway-specific+potentiation+and+depression+in+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Simultaneous induction of pathway-specific potentiation and depression in networks of cortical neurons.</a> Biophys J. 76 (2), 670-678 (1999).</li>
<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanker%2C+G+%22Culturing+nerve+cells%22">Culturing nerve cells</a>. , 2nd ed, MIT Press. Cambridge, Mass. (1998).</li>
</ol>

CMS no tiene nada que revelar.<br /&gt; JDR y leche desnatada en polvo se paga a los consultores Axion Biosystems.<br /&gt; Las tasas de presentación y las tasas de procesamiento de video para este artículo y el vídeo fueron patrocinados por la gracia sistemas multi-canal.

Este protocolo muestra instrucciones acerca de cómo la cultura y mantener las redes neuronales en arrays de micro-electrodos, así como una introducción a la grabación de las redes neuronales y estimulante. Algunos de los problemas más comunes durante la grabación de los acuerdos ambientales multilaterales también se discutieron en la sección de solución de problemas MEA. Hay variaciones ocasionales en el protocolo como discutido a lo largo y muchas veces estos cambios son utilizados para optimizar las condiciones específicas requeridas por ciertos diseños experimentales. Aunque el sistema de registro y estimulación que aquí se presenta se compone de nuestro diseño personalizado NeuroRighter 15 con el previo MCS, hay varios otros sistemas que pueden proporcionar una interfaz con las redes neuronales. La elección de una configuración particular dependerá de las necesidades experimentales específicas. Grabación simple y ejemplos de estimulación fueron en el presente Protocolo sin embargo, estas culturas de los acuerdos ambientales multilaterales se puede utilizar para proporcionar información sobre cuestiones complejas sobre la actividad sináptica y la conectividad de la red neuronal. Como se mencionó anteriormente, los trabajos en curso es la utilización de esta tecnología para estudiar procesos como la plasticidad celular, el desarrollo, la excitotoxicidad y neurodegeneración. 6-10 Por ejemplo, una publicación reciente de nuestro laboratorio mostraron objetivo reproducible aprendizaje dirigido in vitro en tiempo real con la estimulación de circuito cerrado en respuesta a la actividad actual de la red neuronal 3. Aunque las culturas MEA son a menudo meticuloso y delicado, gracias a su sencillez y accesibilidad (en comparación con animales intactos), que proporcionan un poderoso modelo para estudiar la actividad neuronal a nivel de red.

Suministros <ul><li> Desechables botella superior del filtro (150 ml, 0.2μm de tamaño de poro; Nalgene # 565 a 0.020) </li><li> Embrionarias día 18 de disolución-rata hembra embarazada </li><li> Microelectrodos (ver descripción en el protocolo, B1) </li><li> Tapas de microelectrodos array (ver descripción en el protocolo, B3) </li><li> Nylon de células colador (40μm, BD Falcon, # 352340) </li><li> Polipropileno cónico viales (estéril, 15 ml) </li><li> Poliestireno Petri (estériles, de 35 mm y 100x15mm) </li><li> Puntas de pipeta (estéril, 20μl, 200μl y 1000μl) </li><li> Pipetas serológicas (5 ml) </li></ul> Equipos: <ul><li> Gabinete de seguridad biológica / campana de flujo laminar </li><li> Contador de células </li><li> Centrífugo </li><li> Contenedor de hielo </li><li> Tijeras y pinzas de disección (esterilizada) </li><li> Microscopio de disección en una campana de flujo laminar </li><li> De mano eléctrico Pipetman </li><li> Hemocitómetro </li><li> Isofluorano y la cámara de gas </li><li> Microscopio de luz </li><li> Mano Pipetman (P-20 (20μl), P-200 (200μl), P-1000 (1000μl)) </li><li> MEA sistema de grabación (ver descripción en el protocolo, D1) </li><li> Roedores guillotina </li><li> Tri-incubadora de gas (ver descripción en el protocolo, B15) </li><li> Termo con aspirador conectado en la campana </li><li> Vórtice </li><li> Baño de agua (35-37 ° C) </li></ul> Soluciones y reactivos: BSA solución: Hacer 5% de BSA (Sigma A-9418) en tampón fosfato salino pH 7,4 y se filtran a 0.2μm. Esta solución se puede preparar con anticipación y se almacenan a 4 ° C durante varios meses. Celular Medio: Combine 90 modificado ml Dulbecco medio de Eagle (Irvine Scientific 9024), 10 ml de suero de caballo (Gibco 16.050), piruvato de sodio 1 ml (100 mM, Gibco 11.360), 250 l Glutamax (Gibco 35.050), y la insulina (concentración final de 2,5 mg / ml, Sigma I-5500) a continuación, pasar a través de un 0,2 micras filter.22 caliente y equilibrar el medio celular en la incubadora antes de su uso. Disección de solución para la preparación de solución de papaína: 23 <table border="1"><tr><td> Disección de la solución (100 ml de archivo) </td><td> Se combinan en el orden, filtro de 0,22 micras y se almacenan a 4 ° C. </td><td></td></tr><tr><td> Componente </td><td> Ml de volumen </td><td> La concentración final (mM) </td></tr><tr><td> Agua doblemente destilada </td><td> 91.175 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M de MgCl2 </td><td> 0.58 </td><td> 5,8 mM </td></tr><tr><td> 1 M de CaCl2 </td><td> 0.025 </td><td> 0,25 mm </td></tr><tr><td> HEPES 0,5 M </td><td> 0.32 </td><td> 1,6 mM </td></tr><tr><td> 0,5% de rojo fenol </td><td> 0.2 </td><td> (0,001%) </td></tr><tr><td> 0,1 N NaOH </td><td> 0.2 </td><td> 0,2 mM </td></tr><tr><td> 2 M Na2SO4 </td><td> 4.5 </td><td> 90 mM </td></tr><tr><td> 1 M K2SO4 </td><td> 3.0 </td><td> 30 mM </td></tr><tr><td> 0,1 M de ácido quinurénico </td><td> 1.0 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> 5 mM APV </td><td> 1.0 </td><td> 0,05 mM </td></tr></table> Esta solución se puede preparar con anticipación y se almacenan a 4 ° C durante varios meses. DNAsa I: Invitrogen (# 18047019). Alícuotas de 50μl se destello congeladas y almacenadas a -80 ° C. Una alícuota se descongela en la campana de flujo laminar antes de iniciar el proceso de disociación celular. Solución salina equilibrada de Hank: Sigma (# 4891). Una solución 1X es preparado en agua desionizada, estéril filtrado a 0.2μm y almacenadas a 4 ° C. Hibernate solución: Preparar el día de cultivo. Combine 98 ml medio L-15 (Invitrogen 11415) con 2 ml de suplemento de B-27 (50X, Invitrogen # 17504) y el filtro de 0,2 micras. Laminina solución: Preparar el día de cultivo. Diluir 20μl de laminina (1mg/ml, Sigma L-2020) en 980 l medio celular para una concentración final de 0.02mg/ml. Alícuotas de 20 l de la laminina (1mg/ml) se almacenan a -80 ° C y descongelar antes de su uso. Descongelación se producen en la parte superior del banco y no en el baño de agua en rápido proceso de deshielo en ocasiones puede conducir a la gelificación de la laminina. Solución de papaína: 23 Ml de solución caliente 10 disección (arriba) a 30-32 º C. Añadir 200 unidades de papaína (Sigma P-4762) y 1,6 mg L-cisteína (Sigma C-7880). Ajustar el pH a 7,4 con unos 14 l de NaOH 0,1 N. Se incuba durante unos 30 minutos hasta que la solución cllos oídos, filtro de 0,2 micras, congelar flash con nitrógeno líquido en alícuotas de 2 ml en 15 ml de polipropileno estéril frascos cónicos y almacenar a -80 ° C. Descongelar una alícuota a 35-37 ° C antes de comenzar el protocolo. Polietilenimina (PEI) solución: 13 100 l de PEI (50% w / v, Sigma P-3143) se diluye en 100 ml de tampón de borato de sodio (0,1 M pH 8,4, Sigma B-9876) para una concentración final de 0,05% w / v. Filtro estéril de 0,2 micras. Esto puede ser preparado con antelación y se almacenan a 4 ° C durante meses. Estéril con agua desionizada: Autoclave y dejar enfriar a temperatura ambiente antes de su uso. Tripsina (0,25% con EDTA, Gibco 25200): Alícuotas de 1 ml se destello congeladas y almacenadas a -80 ° C. Alícuotas se descongelan en el baño de 35-37 ° C el agua antes de su uso.

cómo cultura, registro y estimular las redes neuronales en matrices de micro-electrodos (mea)

How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs)

Durante el último siglo, muchos neurocientíficos de todo el mundo han dedicado su vida a la comprensión de cómo las redes neuronales funcionan y por qué dejar de trabajar en diversas enfermedades. Los estudios han incluido observaciones neuropatológicas, microscopía de fluorescencia con el etiquetado de genética, y el registro intracelular, tanto en neuronas disociadas y preparaciones rebanada. Este protocolo describe otra tecnología, que consiste en cultivar cultivos de neuronas disociadas en matrices de micro-electrodos (también llamados electrodos múltiples arrays, AAM). Hay muchas ventajas de usar este sistema frente a otras tecnologías. Disociarse cultivos neuronales en los acuerdos ambientales multilaterales proporcionan un modelo simplificado en el que se puede manipular con la actividad de red secuencias de estimulación eléctrica a través de múltiples electrodos de la matriz. Debido a que la red es pequeña, el impacto del estímulo se limita a las áreas observables, que no es el caso de las preparaciones intactas. Las células crecen en una monocapa de hacer cambios en la morfología fácil de controlar con técnicas de imagen. Finalmente, los cultivos en los acuerdos ambientales multilaterales pueden sobrevivir durante más de un año in vitro que elimina las limitaciones de tiempo claro inherentes a las técnicas de cultivo de otros 1. Nuestro laboratorio y otros en todo el mundo están utilizando esta tecnología para hacer preguntas importantes acerca de las redes neuronales. El objetivo de este protocolo es proporcionar la información necesaria para la creación, el cuidado, la grabación de la estimulación eléctrica de las culturas y en los acuerdos ambientales multilaterales. En las redes in vitro proporcionan un medio para pedir fisiológicamente preguntas relevantes en la red y los niveles celulares que conducen a una mejor comprensión de la función cerebral y la disfunción.

Este protocolo proporciona la información necesaria para la creación, el cuidado, la grabación de la estimulación eléctrica de las culturas y en los acuerdos ambientales multilaterales.<em&gt; In vitro</em&gt; Redes proporcionan un medio para pedir fisiológicamente preguntas relevantes en la red y los niveles celulares que conducen a una mejor comprensión de la función cerebral y la disfunción.

Cómo Cultura, Registro y estimular las redes neuronales en matrices de micro-electrodos (MEA)

For the last century, many neuroscientists around the world have dedicated their lives to understanding how neuronal networks work and why they stop ...

El objetivo general de este procedimiento es cultivar, registrar y estimular las redes neuronales en matrices de microelectrodos. Esto se logra preparando primero los reactivos y las matrices de microelectrodos para el cultivo. El segundo paso del procedimiento es disociar las neuronas corticales de un embrión de rata de día 18.El tercer paso del procedimiento es colocar las neuronas en matrices de microelectrodos y cultivarlas durante dos o tres semanas. El paso final del procedimiento es experimentar con las redes neuronales a través de la estimulación y el registro de las matrices de microelectrodos. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la actividad espontánea y evocada por estímulos en redes neuronales con software de registro y estimulación a través de un meticuloso cultivo celular en matrices de microelectrodos.Hola, soy el profesor Steve Potter. Soy el director del Laboratorio de Neuroingeniería en el Departamento de Ingeniería Biomédica de Georgia Tech. Ese departamento es compartido con la Facultad de Medicina de la Universidad de Emory.Y yo soy Chad Hales, un postdoctorado en el laboratorio del Dr. Potter. También soy becario cognitivo conductual en el Departamento de Neurología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Emory. Hoy vamos a mostrarte cómo cultivar y cuidar neuronas en matrices de electrodos múltiples.Como estos. Los utilizamos para estudiar el aprendizaje y la memoria in vitro y el procesamiento de información en red. Así que comencemos En una campana de flujo laminar, comience a preparar la matriz de microelectrodos de los sistemas multicanal o la pipeta MEA de 100 microlitros de amina de polietileno en el centro de un MEA limpio y estéril que descansa en una placa de Petri de 100 milímetros para evitar dañar los electrodos.Nunca toque objetos sólidos con la superficie MEA. Cubra ligeramente el plato con una tapa estéril provista de una membrana de teflón permeable al gas e incube en la campana durante 30 minutos. La tapa de membrana de teflón proporciona un intercambio gaseoso con una evaporación mínima y la capacidad de cultivar en ambientes de menor humedad.La menor humedad permite el uso de componentes electrónicos delicados en la incubadora y reduce las tasas de contaminación. Aspire el PEI, enjuague el MEA tres veces con uno o dos mililitros de agua desionizada estéril. Deje que se sequen sin la tapa de la campana durante al menos 30 minutos o hasta que estén completamente secos.Complete una disociación de neuronas corticales E 18 como se describe en la parte de texto de este protocolo. Cuela las células después de colarlas. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros y lleve el volumen de suspensión celular a cuatro mililitros con medio celular con cuidado.Coloque 500 microlitros de una solución de BSA al 5% debajo de la centrífuga de suspensión celular a 200 Gs durante seis minutos. Mientras las células están girando, compruebe que el MEA esté completamente seco. Pipetee con cuidado 20 microlitros de solución laminada en el centro del MEA.Evite introducir burbujas de aire y asegúrese de que todos los electrodos estén cubiertos. Coloque suavemente la tapa de teflón sobre el MEA para evitar la evaporación de la laminina. El MEA debe estar sobre una superficie completamente plana cuando se coloca la tapa.De lo contrario, la presión podría agrietar el fondo de vidrio de la matriz. Incube la placa a 35 a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono, 9% de oxígeno y 65% de humedad durante 20 minutos. Ahora transfiera las celdas giradas al capó.Un gránulo de celda debe ser visible en la parte inferior del tubo. Retirar y reservar el sobrenadante en caso de peletización incompleta. Vuelva a suspender suavemente el pellet.Cuente el número de células en 10 microlitros de la suspensión en un hemocímetro y diluya la suspensión hasta la concentración deseada. Por lo general, de 1000 a 3000 células por microlitro con medio celular. Cuando se complete la incubación del laminado de la matriz, aspire la gota inmediatamente.Pipetear de 15 a 20 microlitros de la suspensión celular sobre el área recubierta de laminado del MEA. Cubra el plato con la tapa de teflón y colóquelo en la incubadora durante 30 minutos. Bajo un microscopio de contraste de fase, inspeccione la placa para asegurarse de que las celdas se hayan adherido y cubran todos los electrodos.Si la cobertura es incompleta, agregue más células y vuelva a incubar. Inunda lentamente el plato con un mililitro de medio celular equilibrado calentado. Vuelva a colocar la tapa de teflón y vuelva a colocar el plato en la incubadora durante 24 horas.Al día siguiente. Bajo el microscopio de contraste de fase, verifique que las células cultivadas estén adheridas y que la cantidad de desechos y muerte celular esté limitada con el cuidado y la alimentación adecuados. Como se explica en el texto adjunto, las neuronas cultivadas de esta manera pueden sobrevivir durante más de un año.Después de dos o tres semanas, los cultivos han alcanzado un estado estable de actividad y se pueden grabar a partir de este video ahora demostrará la grabación con el programa de escritura neurológica hecho a medida. Transfiera el plato a la incubadora de registro nuevamente mantenida a 35 a 37 grados Celsius, 5% de dióxido de carbono, 9% de oxígeno y 65% de humedad. Para mantener la temperatura y el pH ideales, al mover la placa, llévela paralela al suelo y evite movimientos rápidos que puedan desalojar las células del sustrato.Levante el MEA de la antena y colóquelo en los sistemas multicanal. Grabación del amplificador preem, asegurándose de hacer coincidir correctamente la tierra interna con la tierra del amplificador preem. El preamplificador se asienta sobre un dispositivo de piel, que funciona para disipar el calor como se describe en el texto adjunto aquí, el preamplificador se ha movido fuera de la incubadora.Es mejor mostrar el asiento adecuado del plato. Utilice una toallita humedecida con etanol al 70% para limpiar los contactos alrededor del perímetro de la matriz. Asegúrese de que el MEA esté asentado correctamente, baje y cierre la tapa.Utilice un bastoncillo de algodón para alinear los contactos de la matriz si es necesario. En neuro writer, elija la configuración adecuada para el experimento. El interruptor de grabación debe estar activado hacia arriba.Para escribir los datos en un archivo, haga clic en el botón de inicio para comenzar a grabar. La pantalla de picos ahora mostrará rastros de actividad y ruido de fondo con potenciales de acción ocasionales y ráfagas de actividad. Si un electrodo muestra demasiado ruido, puede haber un pin desalineado en la tapa del preamplificador, un pequeño trozo de basura, una gota de medio, una superficie del electrodo degradada o una membrana transparente superpuesta de la tapa que interrumpe el contacto.Compruebe la clavija de contacto y ajústela con un bastoncillo de algodón empapado en etanol al 70% si es necesario. Haga clic en la pestaña de forma de onda de pico para cambiar la vista de la pantalla al modo de detección de picos, donde los potenciales de acción se muestran en ventanas estáticas de tres milisegundos de duración. Para estimular la red neuronal en el MEA, entrene el algoritmo de salpa en la pestaña de configuración de grabación para limitar el artefacto de estimulación, active salpa en la pestaña de configuración en línea.Una vez iniciada la grabación, haga clic en la pestaña STEM para establecer un paradigma de estimulación adecuado para utilizar el programa de bucle abierto para estimular un electrodo y observar las respuestas en la antena. Elija la configuración adecuada en la sección de bucle abierto y, a continuación, pulse inicio. Visualice las respuestas en la pestaña principal de picos y en la pestaña de formas de ondas de picos.Esta película retrata el desarrollo in vitro de las neuronas y las células gliales del séptimo día a medida que crecen y forman una red conectada en un MEA para que los microelectrodos sean visibles. Se trata de un gráfico raster de dos minutos de actividad espontánea de una red neuronal. Cada punto negro representa un potencial de acción.Dos ráfagas de actividad se indican con las flechas azules. La respuesta a través de múltiples electrodos es una función de la conectividad de la red. Aquí hay un gráfico ráster de 16 segundos de actividad evocada por estímulos.Las estrellas rojas representan estímulos. Las flechas rojas muestran cinco estímulos que indujeron con éxito ráfagas de actividad sináptica a través de múltiples electrodos. A veces, un estímulo no produce una ráfaga.Aquí en la flecha azul, acabamos de mostrarle cómo registrar y estimular redes neuronales en matrices de microelectrodos. Probablemente lo más importante que preocupa es evitar que los cultivos se infecten y reducir la evaporación. Si se usan tapas con membranas semipermeables como esta, están selladas y evitan la evaporación y la infección, y es posible que pueda cultivar los cultivos durante meses, tal vez incluso más de un año.Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Una forma sólida para estudiar las avalanchas neuronales, es decir, invariante en escala espacio-temporal de ráfagas de actividad, lo que indica la dinámica de estado crítico en la corteza. Avalanchas surgen espontáneamente en el desarrollo de las capas superficiales de la corteza cultivo que permite mediciones a largo plazo de la actividad con planos las redes distribuidas multi-electrodo (MEA) en condiciones controladas con precisión.

Electrodos múltiples grabaciones matriz de avalanchas neuronal en cultivos organotípicos

Este video demuestra el desarrollo de un cultivo neuronal 3D acoplado a una matriz plana de microelectrodos con neuronas del hipocampo. Las neuronas aisladas forman una red 2D en el área activa de la matriz de microelectrodos y se adhieren a las microperlas de vidrio en una placa de pocillos múltiples con un inserto de membrana. Al transferir estas microperlas recubiertas de neuronas al electrodo, se organizan en una red neuronal 3D interconectada.

Construcción de redes neuronales tridimensionales acopladas a matrices de microelectrodos

El video demuestra cómo usar una matriz de microelectrodos (MEA) para registrar la actividad electrofisiológica de las neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs). Se registra la actividad electrofisiológica de un MEA multipocillo que contiene un cocultivo neurona-astrocito para detectar potenciales de acción de múltiples neuronas en la red, lo que confirma la diferenciación exitosa de las hiPSC en neuronas.

Medición de la actividad electrofisiológica de las redes neuronales mediante matrices de microelectrodos

Este video muestra el registro de la actividad neuronal espontánea y dependiente de la estimulación de cultivos primarios de neuronas espirales espirales murinas (SGN) en una matriz de electrodos múltiples (MEA). Consiste en lavar y preparar el MEA, registrar la actividad neuronal espontánea y aplicar estímulos eléctricos controlados para identificar la actividad neuronal dependiente de la estimulación.

Análisis de la actividad neuronal en neuronas primarias de ganglios espirales murinos mediante matrices de electrodos múltiples

Este video presenta grabaciones electrofisiológicas de cocultivos organotípicos de cortes de médula espinal, capturados usando una matriz de electrodos múltiples o un dispositivo MEA. Estas grabaciones evalúan la regeneración neuronal entre los cortes. La actividad eléctrica sincronizada observada confirma el éxito de la regeneración neuronal.

Registros electrofisiológicos para la evaluación de las regeneraciones neuronales en cortes de médula espinal cocultivados

Este video muestra el procedimiento de uso de la matriz de electrodos múltiples (MEA) para medir la fisiología sináptica en esferas de cocultivo 3D. Este método permite comprender la dinámica de la red neuronal y la actividad de ráfaga de la red sináptica dentro de las esferas 3D.

Utilización de matrices de electrodos múltiples para medir la fisiología sináptica en esferas de cocultivo en 3D

Este video demuestra el establecimiento de un cocultivo neurona-astrocito para registrar la actividad de la red neuronal. Al establecer el cocultivo de neuronas motoras y astrocitos en una placa de matriz de electrodos múltiples (MEA), la actividad eléctrica rítmica sincrónica de la red neuronal se registró extracelularmente utilizando el MEA.

Registro de la actividad electrofisiológica de la red neuronal en un cocultivo neurona-astrocito

En este trabajo, se presented. 3D un nuevo modelo experimental en el que los cultivos neuronales 3D se acoplan a matrices de microelectrodos planas (MEAs) se construyen redes sembrando neuronas en un andamio formado por microperlas de vidrio en las que las neuronas crecen y forman estructuras 3D interconectadas.

Interfaz culturas 3D Engineered neuronales a micro-electrodos matrices: un innovador<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo Experimental

Presentamos un protocolo para cultivar explantes primarios de ganglios espirales murinos en matrices de electrodos múltiples para estudiar los perfiles de respuesta neuronal y optimizar los parámetros de estimulación. Dichos estudios tienen como objetivo mejorar la interfaz neurona-electrodo de los implantes cocleares para beneficiar la audición de los pacientes, así como el consumo de energía del dispositivo.

Ganglio espiral neurona explante cultura y Electrofisiología de multi electrodos matrices

Las células neuronales de ratón cultivadas en matrices de múltiples electrodos muestran un aumento de la respuesta después de la estimulación eléctrica. Este protocolo demuestra cómo cultivar las neuronas, cómo registrar la actividad, y cómo establecer un protocolo para entrenar a las redes para responder a los patrones de estimulación.

Incremento dependiente del tiempo en la respuesta de la red a la estimulación de cultivos de células neuronales en matrices de microelectrodos

Este protocolo pretende demostrar cómo combinar arreglos de microelectrodos en vitro con dispositivos microfluídicos para estudiar la transmisión del potencial de acción en cultivos neuronales. Análisis de los datos, es decir, la detección y caracterización de propagar potenciales de acción, es realizada con un nuevo avanzado, pero fácil de usar y libremente disponible, herramienta computacional.

Microfluídica de entretela con arreglos de microelectrodos para el estudio de la comunicación Neuronal y Axonal señal propagación

Aprenda a cultivar, registrar y estimular redes neuronales en matrices de microelectrodos (MEA) usando neuronas corticales de rata. Este método permite estudiar la actividad de redes neuronales in vitro durante períodos prolongados.

Cómo Cultura, Registro y estimular las redes neuronales en matrices de micro-electrodos (MEA)

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