Cómo Cultura, Registro y estimular las redes neuronales en matrices de micro-electrodos (MEA)
May 30th, 2010
Este protocolo proporciona la información necesaria para la creación, el cuidado, la grabación de la estimulación eléctrica de las culturas y en los acuerdos ambientales multilaterales. In vitro Redes proporcionan un medio para pedir fisiológicamente preguntas relevantes en la red y los niveles celulares que conducen a una mejor comprensión de la función cerebral y la disfunción.
El objetivo general de este procedimiento es cultivar, registrar y estimular las redes neuronales en matrices de microelectrodos. Esto se logra preparando primero los reactivos y las matrices de microelectrodos para el cultivo. El segundo paso del procedimiento es disociar las neuronas corticales de un embrión de rata de día 18.
El tercer paso del procedimiento es colocar las neuronas en matrices de microelectrodos y cultivarlas durante dos o tres semanas. El paso final del procedimiento es experimentar con las redes neuronales a través de la estimulación y el registro de las matrices de microelectrodos. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la actividad espontánea y evocada por estímulos en redes neuronales con software de registro y estimulación a través de un meticuloso cultivo celular en matrices de microelectrodos.
Hola, soy el profesor Steve Potter. Soy el director del Laboratorio de Neuroingeniería en el Departamento de Ingeniería Biomédica de Georgia Tech. Ese departamento es compartido con la Facultad de Medicina de la Universidad de Emory.
Y yo soy Chad Hales, un postdoctorado en el laboratorio del Dr. Potter. También soy becario cognitivo conductual en el Departamento de Neurología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Emory. Hoy vamos a mostrarte cómo cultivar y cuidar neuronas en matrices de electrodos múltiples.
Como estos. Los utilizamos para estudiar el aprendizaje y la memoria in vitro y el procesamiento de información en red. Así que comencemos En una campana de flujo laminar, comience a preparar la matriz de microelectrodos de los sistemas multicanal o la pipeta MEA de 100 microlitros de amina de polietileno en el centro de un MEA limpio y estéril que descansa en una placa de Petri de 100 milímetros para evitar dañar los electrodos.
Nunca toque objetos sólidos con la superficie MEA. Cubra ligeramente el plato con una tapa estéril provista de una membrana de teflón permeable al gas e incube en la campana durante 30 minutos. La tapa de membrana de teflón proporciona un intercambio gaseoso con una evaporación mínima y la capacidad de cultivar en ambientes de menor humedad.
La menor humedad permite el uso de componentes electrónicos delicados en la incubadora y reduce las tasas de contaminación. Aspire el PEI, enjuague el MEA tres veces con uno o dos mililitros de agua desionizada estéril. Deje que se sequen sin la tapa de la campana durante al menos 30 minutos o hasta que estén completamente secos.
Complete una disociación de neuronas corticales E 18 como se describe en la parte de texto de este protocolo. Cuela las células después de colarlas. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros y lleve el volumen de suspensión celular a cuatro mililitros con medio celular con cuidado.
Coloque 500 microlitros de una solución de BSA al 5% debajo de la centrífuga de suspensión celular a 200 Gs durante seis minutos. Mientras las células están girando, compruebe que el MEA esté completamente seco. Pipetee con cuidado 20 microlitros de solución laminada en el centro del MEA.
Evite introducir burbujas de aire y asegúrese de que todos los electrodos estén cubiertos. Coloque suavemente la tapa de teflón sobre el MEA para evitar la evaporación de la laminina. El MEA debe estar sobre una superficie completamente plana cuando se coloca la tapa.
De lo contrario, la presión podría agrietar el fondo de vidrio de la matriz. Incube la placa a 35 a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono, 9% de oxígeno y 65% de humedad durante 20 minutos. Ahora transfiera las celdas giradas al capó.
Un gránulo de celda debe ser visible en la parte inferior del tubo. Retirar y reservar el sobrenadante en caso de peletización incompleta. Vuelva a suspender suavemente el pellet.
Cuente el número de células en 10 microlitros de la suspensión en un hemocímetro y diluya la suspensión hasta la concentración deseada. Por lo general, de 1000 a 3000 células por microlitro con medio celular. Cuando se complete la incubación del laminado de la matriz, aspire la gota inmediatamente.
Pipetear de 15 a 20 microlitros de la suspensión celular sobre el área recubierta de laminado del MEA. Cubra el plato con la tapa de teflón y colóquelo en la incubadora durante 30 minutos. Bajo un microscopio de contraste de fase, inspeccione la placa para asegurarse de que las celdas se hayan adherido y cubran todos los electrodos.
Si la cobertura es incompleta, agregue más células y vuelva a incubar. Inunda lentamente el plato con un mililitro de medio celular equilibrado calentado. Vuelva a colocar la tapa de teflón y vuelva a colocar el plato en la incubadora durante 24 horas.
Al día siguiente. Bajo el microscopio de contraste de fase, verifique que las células cultivadas estén adheridas y que la cantidad de desechos y muerte celular esté limitada con el cuidado y la alimentación adecuados. Como se explica en el texto adjunto, las neuronas cultivadas de esta manera pueden sobrevivir durante más de un año.
Después de dos o tres semanas, los cultivos han alcanzado un estado estable de actividad y se pueden grabar a partir de este video ahora demostrará la grabación con el programa de escritura neurológica hecho a medida. Transfiera el plato a la incubadora de registro nuevamente mantenida a 35 a 37 grados Celsius, 5% de dióxido de carbono, 9% de oxígeno y 65% de humedad. Para mantener la temperatura y el pH ideales, al mover la placa, llévela paralela al suelo y evite movimientos rápidos que puedan desalojar las células del sustrato.
Levante el MEA de la antena y colóquelo en los sistemas multicanal. Grabación del amplificador preem, asegurándose de hacer coincidir correctamente la tierra interna con la tierra del amplificador preem. El preamplificador se asienta sobre un dispositivo de piel, que funciona para disipar el calor como se describe en el texto adjunto aquí, el preamplificador se ha movido fuera de la incubadora.
Es mejor mostrar el asiento adecuado del plato. Utilice una toallita humedecida con etanol al 70% para limpiar los contactos alrededor del perímetro de la matriz. Asegúrese de que el MEA esté asentado correctamente, baje y cierre la tapa.
Utilice un bastoncillo de algodón para alinear los contactos de la matriz si es necesario. En neuro writer, elija la configuración adecuada para el experimento. El interruptor de grabación debe estar activado hacia arriba.
Para escribir los datos en un archivo, haga clic en el botón de inicio para comenzar a grabar. La pantalla de picos ahora mostrará rastros de actividad y ruido de fondo con potenciales de acción ocasionales y ráfagas de actividad. Si un electrodo muestra demasiado ruido, puede haber un pin desalineado en la tapa del preamplificador, un pequeño trozo de basura, una gota de medio, una superficie del electrodo degradada o una membrana transparente superpuesta de la tapa que interrumpe el contacto.
Compruebe la clavija de contacto y ajústela con un bastoncillo de algodón empapado en etanol al 70% si es necesario. Haga clic en la pestaña de forma de onda de pico para cambiar la vista de la pantalla al modo de detección de picos, donde los potenciales de acción se muestran en ventanas estáticas de tres milisegundos de duración. Para estimular la red neuronal en el MEA, entrene el algoritmo de salpa en la pestaña de configuración de grabación para limitar el artefacto de estimulación, active salpa en la pestaña de configuración en línea.
Una vez iniciada la grabación, haga clic en la pestaña STEM para establecer un paradigma de estimulación adecuado para utilizar el programa de bucle abierto para estimular un electrodo y observar las respuestas en la antena. Elija la configuración adecuada en la sección de bucle abierto y, a continuación, pulse inicio. Visualice las respuestas en la pestaña principal de picos y en la pestaña de formas de ondas de picos.
Esta película retrata el desarrollo in vitro de las neuronas y las células gliales del séptimo día a medida que crecen y forman una red conectada en un MEA para que los microelectrodos sean visibles. Se trata de un gráfico raster de dos minutos de actividad espontánea de una red neuronal. Cada punto negro representa un potencial de acción.
Dos ráfagas de actividad se indican con las flechas azules. La respuesta a través de múltiples electrodos es una función de la conectividad de la red. Aquí hay un gráfico ráster de 16 segundos de actividad evocada por estímulos.
Las estrellas rojas representan estímulos. Las flechas rojas muestran cinco estímulos que indujeron con éxito ráfagas de actividad sináptica a través de múltiples electrodos. A veces, un estímulo no produce una ráfaga.
Aquí en la flecha azul, acabamos de mostrarle cómo registrar y estimular redes neuronales en matrices de microelectrodos. Probablemente lo más importante que preocupa es evitar que los cultivos se infecten y reducir la evaporación. Si se usan tapas con membranas semipermeables como esta, están selladas y evitan la evaporación y la infección, y es posible que pueda cultivar los cultivos durante meses, tal vez incluso más de un año.
Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.
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