Name: IP-FCM: inmunoprecipitación detectada por citometría de flujo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-02T10:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: Aprende el método IP-FCM para analizar interacciones proteicas nativas mediante inmunoprecipitación y citometría de flujo. Esta técnica permite detectar complejos proteicos sin necesidad de ingeniería genética.

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Este trabajo fue apoyado por el Premio a la Innovación Águilas (Fraternal Order of Eagles) y por la Fundación Mayo.

** Este protocolo de vídeo se basa en una publicación asociada 1: de alta sensibilidad de detección y análisis cuantitativo de los nativos interacciones proteína-proteína y complejos multiproteicos por citometría de flujo. Adam G. Schrum, Diana Gil, P. Elaine Dopfer, David L. Wiest, Laurence A. Turka, Wolfgang WA Schamel, Ed Palmer. STKE de la ciencia 2007 (389): PL2, 5 de junio de 2007, [DOI: 10.1126/stke.3892007pl2]. <a href="http://stke.sciencemag.org/cgi/content/abstract/2007/389/pl2">Por favor, haga clic aquí para ver esta publicación</a> . Antes de partir, Prepare las siguientes soluciones acuosas de archivo: <table><tbody><tr><td> MES acoplamiento Buffer: </td><td> Guárdela a 25 ° C </td></tr><tr><td> MES, pH 6,0 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Enfriamiento / Bloqueo / Almacenamiento (SBC) Buffer: </td><td> Almacenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Azida de sodio </td><td> 0,02% </td></tr><tr><td> PBS, pH 7,4 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> FCM Buffer: </td><td> Almacenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> Tris, pH 7,4 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> Azida de sodio </td><td> 0,02% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 5% </td></tr><tr><td> PBS, pH 7,4 </td><td> 1x </td></tr></tbody></table> Preparar inmediatamente antes del uso: <table><tbody><tr><td> EDAC-MES: </td><td> Disolver 50 mg / ml polvo EDAC en tampón de acoplamiento MES </td></tr><tr><td> Digitonina solución (2% w / v): </td><td> Disuelva el polvo de digitonina en dH 2 O por calentamiento a 95 º C durante 5 minutos luego enfriar en hielo </td></tr><tr><td> Tampón de lisis: </td><td></td></tr><tr><td> Tris, pH 7,4 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 150 mm </td></tr><tr><td> Digitonina solución </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Inhibidores de la proteasa </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Mantener en hielo </td><td></td></tr></tbody></table> 1. El acoplamiento de mAb a bolas <ol><li> Determinar la concentración de cuentas de las acciones compradas mediante la dilución en PBS y contar con un hemocitómetro. Comience con una dilución 1:10000 de cuentas para el conteo. </li><li> Pipeta de 18 x 10 6 granos en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Lavar las perlas de 2 a 3 veces en 0,5 a 1,0 ml de tampón de acoplamiento MES, centrifugado a 20.000 g durante 3 minutos a 25 ° C después de cada lavado. </li><li> Volver a suspender las bolas en 50 l de acoplamiento Buffer MES. </li><li> Activar los grupos carboxilo de las cuentas mediante la adición de 20 l de recién preparada EDAC-MES. </li><li> Mezclar suavemente durante 15 minutos a 25 ° C de forma manual pipeteando arriba y abajo. </li><li> Lave las cuentas activadas 2 a 3 veces en 0,5 a 1,0 ml de PBS, centrifugar a 20.000 g durante 3 minutos a 25 ° C después de cada lavado. </li><li> Volver a suspender las cuentas activadas en 50 l de PBS. </li><li> Añadir 50 l de la IP MAB (0.2-1.0 en la concentración de las mg / mL) a la solución de cuentas activadas. </li><li> Mezcle por 3 a 4 horas a 25 º C colocando el tubo en un agitador vibratorio. Agite lo suficiente como para evitar la sedimentación de los granos en la parte inferior del tubo. </li><li> Lave mAb-junto cuentas 2 a 3 veces en 0,5 a 1,0 ml de PBS, centrifugar a 20.000 g durante 3 minutos a 25 ° C después de cada lavado. </li><li> Volver a suspender las bolas en 100 l de búfer SBC. Estos pueden ser almacenadas a 4 ° C. </li><li> La suspensión de las cuentas así, diluir 1:200-1:10,000 en PBS y contar con un hemocitómetro. La concentración debe ser medido para cada lote de preparación, por lo que el número de granos utilizados en cada experimento IP o pull-down puede ser controlada con precisión. </li></ol> 2. Post-nuclear lisado preparación e Ip El método de lisis y las condiciones óptimas de lisis dependerá del tipo de células y las interacciones entre proteínas que se examina. Una serie de protocolos existen y pueden ser modificados para su aplicación. <ol><li> Lisis de 20 x 10 6 'pequeño' células, como los linfocitos, o 5 x 10 6 "grandes" las células, como macrófagos o células tumorales, en 100 l buffer de lisis fresco en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml por 20 minutos en hielo. Escala el volumen de lisis, según sea necesario. </li><li> Para eliminar los núcleos y restos celulares insolubles, centrifugar el lisado a 20.000 g durante 10 min a 4 ° C. Mantenga el sobrenadante y descartar el pellet. </li><li> Añadir 0,5 x 10 5 a 2,5 x 10 5 mAb-junto a las cuentas de lisado clarificado, pipetear suavemente para mezclar. El volumen mínimo que utilizamos pararealizar una sola dirección IP es de 5 mL. </li><li> Colocar en una vertical de rotación de la rueda 4 horas para pasar la noche en una habitación fría. Ajuste a la velocidad suficiente para evitar que las cuentas de liquidación. Es aceptable que el líquido de bajo volumen de IPs para permanecer en el fondo del tubo durante la rotación. </li></ol> 3. Sondeo de bolas-capturado proteínas con anticuerpos conjugados a un fluorocromo <ol><li> Lave las cuentas IP dos veces en 0,2 a 1,0 ml de helado de buffer FCM, la centrifugación a 20.000 g a 4 ° C durante 3 min después de cada lavado. </li><li> Volver a suspender las bolas en 100 l de búfer y la FCM alícuota de 20 l en cada uno de cinco o más tubos de microcentrífuga de 1,5 mL o pocillos de una placa de chimenea de fondo. </li><li> Añadir fluorocromo conjugado AcMo a las muestras. Realizar la FCM mancha de acuerdo a las instrucciones del proveedor o de acuerdo a las concentraciones de determinados empíricamente. Como punto de partida, añadir 0,2 a 1 l de solución madre de anticuerpos (a 0.2-1.0 mg / mL) por tubo o pocillo e incubar durante 40 min en hielo. </li><li> Lave investigado cuentas en tubos de 1,5 ml dos veces en 1,0 ml de Buffer FCM helada, centrifugado a 20.000 g a 4 ° C durante 3 min después de cada lavado. Retire con cuidado el sobrenadante después de cada lavado, teniendo cuidado de no alterar las cuentas. Para una placa de chimenea de fondo, lavado dos veces con 0,2 ml de tampón helado FCM, centrifugar a 1000 g por 5 min a 4 ° C después de cada lavado. Una pipeta multicanal es útil para este paso. Para eliminar el sobrenadante de cuentas en una placa de chimenea de fondo, 'película' de la placa una vez, entonces, al mismo tiempo al revés, borrar cualquier goteo de los bordes de los pozos. El volumen residual en cada pozo, que contiene las cuentas, será de unos 20 mL. </li><li> Volver a suspender las bolas en 200 Buffer FCM l por muestra. Traslado al etiquetado tubos FACS. Las muestras ya están listos para FCM. </li></ol> 4. FCM Adquisición Las cuentas de CML se describe en este protocolo son de 3 a 5 micras de diámetro, aproximadamente la mitad del diámetro de un linfocito del ratón en reposo. Por lo tanto, puede ser necesario aumentar manualmente la dispersión frontal (FSC) y la ganancia del amplificador dispersión lateral (SSC) de tensión a fin de que la población de los acontecimientos de cuentas para registrar en la escala. Individual cuentas IP deben formar una sola población cercanos entre sí. La configuración y la puerta debe ser ajustada para excluir a los dobletes de cuentas y los escombros. <ol><li> Antes de cuentas corrientes o las normas de cuentas, quitar la funda de contención de las gotas que rodea a la entrada de la muestra en algunos citómetros. Permita que el fluido de vaina a gotear entre las muestras, ya que se borrará la entrada y evitar cuentas de ser transferidos de una muestra a otra. </li><li> Utilice cuentas de etiqueta, un control negativo de la fluorescencia, y las partículas de arco iris de calibración (PCR), un control positivo de fluorescencia, para ajustar la configuración para que tanto los extremos positivos y negativos de fluorescencia aparecerá simultáneamente en el diario de escala del eje X. Esto asegura que la fluorescencia de las muestras experimentales también estará en gran escala. Tenga en cuenta que los PCR son más pequeñas que las cuentas de la LMC, por lo que el FSC y los parámetros de cooperación Sur-Sur, así como la posición de la puerta, puede ser necesario modificar temporalmente para esa muestra. </li><li> Volver a la etiqueta de perlas ajustes una vez calibrado con PCR se ha completado. Si sólo hay una sonda fluorescente por cada muestra se utiliza, sin compensación de fluorescencia es necesario. En general, la sonda complejos multiproteicos con un solo fluorocromo conjugado AcM por muestra FCM, y se examina la interacción de múltiples socios de tinción en paralelo muestras de cordón con mAbs específicas para las varias subunidades. </li><li> Adquirir y guardar archivos de datos de fluorescencia. Análisis puede llevarse a cabo utilizando el software de citometría de flujo, tales como CellQuest, FlowJo o cflow. </li></ol> 5. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2066/2066fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. FCM-IP para el complejo multiproteico TCR/CD3. Células T de la cepa de ratones Balb / c fueron lisadas en el 1% digitonina, y el lisado fue sometido a IP-FCM con CD3ε anti-gotas. Los complejos capturados contenían cantidades significativas de TCR-β (región púrpura) y co-asociados CD3-ε (verde), pero, cerca de los niveles de fondo (que se define por la sonda inmunoglobulina irrelevante, rosa de seguimiento) de otras proteínas como Thy1.2 CD45, o H-2K (d) (marrón, naranja, azul y trazas, respectivamente). Ver resultados similares publicados previamente 1-6.

<ol><li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Sci STKE. , pl2-pl2 (2007).</li>
<li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Visualization of multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 5, 9-9 (2009).</li>
<li>Teixeiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+division+and+death+are+segregated+by+mutation+of+TCRbeta+chain+constant+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T cell division and death are segregated by mutation of TCRbeta chain constant domains.</a> Immunity. 21, 515-526 (2004).</li>
<li>Teixeiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+T+Cell+receptor+signals+determine+CD8%2B+memory+versus+effector+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Different T Cell receptor signals determine CD8+ memory versus effector development.</a> Science. 323, 502-505 (2009).</li>
<li>Treves, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctate+is+a+key+element+in+calcium+entry+induced+by+activation+of+InsP3+receptors+and%2For+calcium+store+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Junctate is a key element in calcium entry induced by activation of InsP3 receptors and/or calcium store depletion.</a> J Cell Biol. 166, 537-548 (2004).</li>
<li>Gil, D., Schrum, A. G., Alarcon, B., Palmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+engagement+by+peptide-MHC+ligands+induces+a+conformational+change+in+the+CD3+complex+of+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">T cell receptor engagement by peptide-MHC ligands induces a conformational change in the CD3 complex of thymocytes.</a> J Exp Med. 201, 517-522 (2005).</li>
</ol>

Información acerca de las interacciones proteína-proteína es altamente relevante para el análisis de muchos procesos celulares como la transducción de señales, la maduración del linaje, la progresión del ciclo celular, apoptosis y cascadas. IP-FCM proporciona una forma rápida, cuantitativa y sensible para examinar la interacción de las proteínas y complejos de definir los miembros de multiproteico en su conformación nativa. Cuentas se pueden acoplar y se incubaron con lisados ​​de células en un día y se puede probar y analizar al día siguiente. Un formato de placa de 96 pocillos permite un gran número de muestras a analizar a la vez que ofrezcan servicios de recogida de datos eficiente para fines estadísticos o de tamizaje. Utilizando fluorescentes estándares de cuentas, el número de proteínas capturadas por cada cuenta puede ser estimado. Muy poco material de origen es necesaria para la captura y detección, lo que las muestras limitadas y analitos escasos todavía se pueden analizar las interacciones múltiples. A pesar de IP-FCM no requiere de la ingeniería genética, epítopo de etiquetado, desnaturalización, o in vitro, la mezcla de proteínas en un entorno no-fisiológico, se puede acoplar con estas y otras técnicas, por lo que es un instrumento valioso y accesible, con aplicabilidad a muchos sistemas biológicos. Solución de problemas: Muchos IP-FCM experimentos generar datos útiles de interacción de proteínas de la primera vez que se intentó. Sin embargo, la optimización de IP-FCM puede mejorar la conjugación de anticuerpos a los granos, la captura de proteínas complejas, y la sonda fluorescente vinculante. La eficiencia de la conjugación de anticuerpos IP puede ser determinado mediante el sondeo cuentas directamente acoplado con un anticuerpo anti-inmunoglobulina. Si esta eficiencia es baja, el aumento de la concentración de anticuerpos en la reacción de acoplamiento puede permitir que mayor cantidad de anticuerpos IP para conectar a cada cuenta. Esto puede aumentar la capacidad de unión de los lotes de cuentas IP, lo que resulta en la captura de mejora y la detección de analitos. Otros productos primarios-las moléculas que contienen aminas (por ejemplo, Tris, albúmina sérica bovina) no debe estar presente durante la reacción de acoplamiento, ya que pueden competir con el MAB para la fijación de cuentas y en consecuencia bajo acoplamiento mAb. Si la conjugación de mAb de cuentas resulta problemática por otras razones, en lugar de cuentas puede ser acoplado a avidina / estreptavidina, y posteriormente anticuerpos con biotina puede ser no-covalente y se utiliza para immunprecipitation. A pesar de una buena conjugación de anticuerpos, la detección inicial de cordón-fluorescencia asociada puede ser baja. La primera captura, el complejo en sí mismo puede ser baja. Debido a que IP-FCM depende de la concentración de los analitos, lo que aumenta el número de células lisadas por unidad de volumen de lisis puede aumentar la captura y detección de analitos. Además, la captura puede ser mejorada al reducir el número de cuentas de IP se incubaron con el lisado, que distribuye a través de complejos de captura menos granos, y los resultados de la fluorescencia mayor promedio por bolas al investigado. En segundo lugar, es posible que el acceso de los anticuerpos de la sonda a los complejos de captura es estéricamente impedido por el anticuerpo inmunoprecipitación. En este caso, el problema puede abordarse mediante el uso de diferentes anticuerpos para capturar y / o la sonda.

<table><tbody><tr><td>esferas de látex de poliestireno modificadas con carboxilato (CML) (5 mm sin surfactante)</td><td>Reactivo</td><td>Interfacial Dynamics</td><td>2-5000</td><td>Almacenar a 4&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Partículas de calibración Rainbow</td><td>Reactivo</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>RCP-30-5A</td><td>Almacenar a 4&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Ácido 2-[N-morpholino] etanosulfónico (MES)</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-5287</td><td></td></tr><tr><td>1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida HCl (EDAC)</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22980 E-6383</td><td>Almacenar a -20&amp;#x00B0;C en condiciones desecantes.</td></tr><tr><td>Cóctel general de inhibidores de proteasas, que contiene AEBSF, Bestatina, Aprotinina, EDTA, E-64 y Leupeptina</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-2714</td><td>Preparar una solución stock 100x en H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. Ali-cuotar y almacenar a -20&amp;#x00B0;C. Manipular con guantes.</td></tr><tr><td>Placas para PCR, de 96 pocillos, 0,2 mL, naturales, con chimenea alta</td><td>Reactivo</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-408-230</td><td>Para usar en lugar de tubos de microcentrifugación durante la tinción por CMF</td></tr></tbody></table>

ip-fcm: inmunoprecipitación detectada por citometría de flujo

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Inmunoprecipitación detectada mediante citometría de flujo (IP-FCM) es un método eficaz para la detección y cuantificación de interacciones proteína-proteína. El principio básico es extensivo de ELISA sandwich, en la cual puede ser el analito capturado primaria detectados junto con otras moléculas físicamente asociados dentro de los complejos multiproteico. El procedimiento consiste en el acoplamiento covalente de microesferas de látex de poliestireno con inmunoprecipitación anticuerpos monoclonales (mAb) específico para una proteína de interés, la incubación de estas cuentas con lisados ​​de células, el sondeo capturado complejos de proteínas con el conjugado a un fluorocromo sondas, y el análisis de cuentas asociadas a fluorescencia por citometría de flujo. IP-FCM es extremadamente sensible, permite el análisis de proteínas en su país natal (no desnaturalizado) del estado, y se presta a ninguno de los análisis semi-cuantitativo o cuantitativo. Como ventajas adicionales, IP-FCM no requiere de la ingeniería genética o equipo especializado, que no sea un citómetro de flujo, y puede ser fácilmente adaptada para aplicaciones de alto rendimiento.

El método IP-FCM se presenta, lo que permite un sensible, sólida evaluación, bioquímicos nativos de interacciones proteína-proteína, sin necesidad de la ingeniería genética o muestras de gran tamaño.

IP-FCM: inmunoprecipitación detectada por citometría de flujo

La inmunoprecipitación detectada por citometría de flujo (IP-FCM) es un método eficiente para detectar y cuantificar las interacciones proteína-proteína. El proceso básico...

En los experimentos de citometría de flujo por inmunoprecipitación (IP FCM), los complejos proteicos se capturan en perlas para identificar y estudiar las diferentes proteínas que interactúan entre sí. Primero, un anticuerpo inmunoprecipitante específico para la proteína de interés se acopla covalentemente a perlas de látex de poliestireno. En un segundo paso, estas perlas se incuban con lisados celulares, permitiendo que la proteína específica y las proteínas que interactúan se unan a las perlas.Las perlas junto con las proteínas capturadas se lavan y luego se incuban con anticuerpos marcados con fluorescencia específicos para diversas moléculas que podrían estar asociadas con la proteína inmunoprecipitada. Finalmente, las perlas marcadas con fluorescencia se analizan mediante citometría de flujo para determinar qué proteínas están presentes y cuáles están ausentes en los complejos capturados. Las ventajas de esta técnica frente a otros métodos, como la inmunoprecipitación seguida de transferencia western, son la capacidad del I-P-F-C-M para permitir la evaluación de interacciones nativas entre proteínas sin necesidad de ingeniería genética ni de tamaños grandes de muestra.I-P-F-C-M puede producir una alta relación señal-ruido incluso cuando está disponible muy poca biomaterial para el análisis, ya que puede realizarse con pequeños volúmenes y bajas concentraciones de analitos. Para comenzar este procedimiento, prepare los siguientes tampones: tampón de acoplamiento MES, tampón de bloqueo de apagado de reacción, abreviado como QBS, y tampón para citometría de flujo o FCM. Determine la concentración de las perlas de látex de poliestireno modificadas con carboxilato o perlas CML diluyéndolas en PBS y contándolas con un hemocitómetro.Una vez determinada la concentración de las perlas, pipetee 18 veces 10 a la seis perlas en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. Lave las perlas de dos a tres veces con 0,5 a un mililitro de tampón de acoplamiento MES, centrifugando a 20.000 veces la gravedad durante tres minutos a temperatura ambiente. Después de cada lavado, mientras las perlas están centrifugando.Prepare tampón MES e dac fresco para su uso en la activación de las perlas. Una vez completados los lavados, mantenga el tampón a temperatura ambiente o sobre hielo. Después del lavado final, re suspenda las perlas en 50 microlitros del tampón de acoplamiento MES.Luego, agregue 20 microlitros de MES EEC a la suspensión de perlas. Para activar los grupos carboxilo de las perlas, mezcle suavemente a temperatura ambiente pipeteando manualmente hacia arriba y hacia abajo de forma continua durante 15 minutos. Aunque este paso requiere mucho trabajo manual, este método de mezcla proporciona los mejores resultados después de la mezcla.Lave las perlas activadas dos o tres veces en 0,5 a un mililitro de PBS Centrifusion a 20.000 × g durante tres minutos a temperatura ambiente. Después de cada lavado y tras el lavado final, re suspenda las perlas activadas en 50 microlitros de PBS para acoplar el anticuerpo IP a las perlas. Añada 50 microlitros del anticuerpo monoclonal IP proveniente de una concentración stock entre 0,2 y un miligramo por mililitro.Asegúrese de que no estén presentes moléculas distintas del anticuerpo que contengan aminas primarias. Estas moléculas que contienen aminas, como el tris o la albúmina sérica bovina, compiten con el anticuerpo por la unión a las perlas. Mezcle la suspensión de perlas con anticuerpo en un agitador vibratorio durante tres a cuatro horas a temperatura ambiente.Agite suficientemente para evitar la sedimentación de las perlas en el fondo del tubo. Después de la unión, lave las perlas conjugadas con anticuerpo dos o tres veces con 0,5 a un mililitro de PBS, centrifugando a 20.000 ×g.Gravedad durante tres minutos a temperatura ambiente después de cada lavado. Finalmente, resuspenda las perlas en 100 microlitros de tampón QBS. La acoplamiento de anticuerpos monoclonales a las perlas CML se puede verificar teñendo las perlas con anticuerpos conjugados con fluorocromo contra IgG.Después del análisis por citometría de flujo, las perlas recubiertas con el anticuerpo monoclonal pueden almacenarse a cuatro grados Celsius hasta que estén listas para usar en un experimento de inmunoprecipitación. Primero, suspenda bien las perlas y dilúyalas de uno a 200 a uno a 10,000 en PBS y cuéntelas con un hemocitómetro. La concentración debe medirse para cada lote preparativo para que el número de perlas utilizadas en cada experimento de inmunoprecipitación pueda controlarse con precisión.A continuación, prepare una solución fresca de dig en agua al 2% peso por volumen. Caliente a 95 grados Celsius durante cinco minutos. Luego enfríe en hielo.Diluya y digiera al 1 % en peso por volumen en tampón de lisis recién preparado, y mantenga en hielo. Determine el número de células a lisar utilizando la tabla mostrada como guía. Sin embargo, el número de células necesario depende de la proteína de interés y debe determinarse empíricamente.Aquí se utilizan 30 veces 10 a la seis células de una línea celular de tumor linfocítico pequeño. Transfiera el volumen requerido de la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros. Precipite las células a 20.000 veces.Centrifugar durante 30 segundos a cuatro grados Celsius y aspirar el medio. Añadir la cantidad adecuada de tampón de lisis Dig recién preparado al precipitado, mezclando suavemente mediante pipeteo ascendente y descendente.Luego, deje que las células se lisen durante 20 minutos en hielo. Tenga en cuenta que, dependiendo del tipo celular y de las interacciones proteína-proteína estudiadas, las condiciones de lisis pueden variar y deben determinarse empíricamente cuando la lisis esté completa. Elimine los núcleos y los restos celulares insolubles centrifugando el lisado a 20.000 ×g.La gravedad, los 10 minutos a cuatro grados Celsius. Mantenga el SNA y deseche el pellet para unir la proteína diana a las perlas recubiertas con anticuerpo. Añada de 50.000 a 250.000 perlas acopladas a anticuerpo monoclonal al lisado clarificado pipeteando suavemente.Para mezclar, el volumen mínimo de lisado utilizado para un IP individual es de cinco microlitros. Coloque la mezcla de lisado clarificado y perlas en una rueda rotatoria vertical durante cuatro horas hasta toda la noche en una cámara fría ajustada a una velocidad suficiente para evitar que las perlas sedimenten por debajo del volumen de ips, permitiendo que el líquido permanezca en la parte inferior del tubo durante la rotación. Tras la unión de la proteína diana al anticuerpo de IP.Proceda a marcar fluorescentemente el complejo inmuno. Lave las perlas de inmunoprecipitación dos veces con un mililitro de tampón FCM frío, centrifugando a 20.000 × g durante tres minutos a cuatro grados Celsius. Después de cada lavado, re suspenda las perlas en 100 microlitros de tampón FCM y alícuota 20 microlitros en cada uno de cinco o más tubos.Tubos microc&eacute;ntrifugos de 1,5 mililitros o pocillos de una placa de fondo de chimenea. Ambos se muestran aqu&iacute;. A&ntilde;ada anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromo a las muestras.Realice la tinción por citometría de flujo siguiendo las instrucciones del proveedor o según concentraciones determinadas empíricamente como punto de partida. Añada de 0,2 a un microlitro de la solución stock de anticuerpo de al menos 0,1 miligramos por mililitro por tubo o pocillo e incube durante 40 minutos en hielo. Lave las perlas marcadas dos veces en tubos de 1,5 mililitros con un mililitro de hielo frío.Tampón de FCM, centrifugando a 20.000 × g a cuatro grados Celsius durante tres minutos. Después de cada lavado, retire cuidadosamente el sobrenadante después de cada lavado, teniendo cuidado de no perturbar las perlas.Alternativamente, para un chimenea, lave dos veces la placa inferior con 0,2 mililitros de tampón FCM frío con hielo, centrifugando a 1000 × g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Después de cada lavado, después de cada lavado. Para eliminar el sobrenadante de las perlas, golpee suavemente la placa una vez y, mientras aún esté boca abajo, absorba cualquier goteo de los bordes de los pocillos.El volumen residual en cada pocillo que contiene las perlas será de aproximadamente 20 microlitros. Suspender las perlas en 200 microlitros de tampón FCM por muestra y transferir a tubos cónicos etiquetados. Las muestras ya están listas para citometría de flujo o FCM en citómetros Becton Dickinson y de flujo.Retire la manga de contención de gotas que podría rodear la entrada de la muestra o el tubo capilar. Permita que el tubo capilar gotee entre muestras, ya que esto evitará que las perlas se transfieran de una muestra a otra. Las perlas de LMC utilizadas aquí tienen de tres a cinco micrómetros de diámetro, aproximadamente la mitad del diámetro de un linfocito de ratón en estado de quiescencia.Por lo tanto, puede ser necesario aumentar manualmente la ganancia del amplificador de dispersión directa y el voltaje de dispersión lateral para que la población de eventos de las perlas sea registrada en el citómetro. Esto se realiza utilizando perlas sin marca o perlas en blanco. Los ajustes en GAIT se modifican para excluir perlas, dobletes y abri antes de la lectura.Las muestras experimentales aseguran que la fluorescencia estará dentro de escala. Las microesferas no marcadas sirven como control negativo de fluorescencia y las partículas de calibración arcoíris o RCPs pueden utilizarse como control positivo de fluorescencia. Dado que las RCPs son más pequeñas que las microesferas CML, es posible que sea necesario alterar temporalmente los parámetros de dispersión directa y dispersión lateral, así como la posición del portón, para esa muestra.Después de estas calibraciones, los extremos negativos y positivos de la fluorescencia se visualizan en un eje logarítmico. Una vez completada la calibración con RCPs, regrese a la configuración de cuentas no marcadas para la dispersión directa y lateral. Mientras solo se utilice una sonda fluorescente por muestra, como en el experimento mostrado aquí, no es necesaria ninguna compensación de fluorescencia.Ahora adquiera y guarde los archivos de datos de fluorescencia; posteriormente se realiza el análisis utilizando software de citometría de flujo, como Cell Quest o FlowJo. A continuación se muestra el resultado de un análisis de citometría de flujo inmunoprecipitado (IP FCM) de linfocitos T murinos LY en 1 % de digitonina. El complejo no proteico TCR-CD3 fue precipitado con perlas de anticuerpo anti-CD3 epsilon.Los complejos capturados contienen cantidades significativas de la cadena beta del TCR y de la CD3 épsilon asociada. Se detectaron niveles cercanos al fondo de otras proteínas, según se determinó mediante el uso de una sonda de inmunoglobulina irrelevante o de anticuerpos contra las proteínas TH 1.2, CD 45 o H dos KD. Las ventajas de esta técnica frente a otros métodos, como la inmunoprecipitación seguida de inmunotransferencia, son la capacidad del I-P-F-C-M para permitir la evaluación de interacciones proteína-proteína nativas sin necesidad de ingeniería genética ni de grandes tamaños de muestra. El I-P-F-C-M puede proporcionar altas relaciones señal-ruido incluso cuando está disponible muy poca biomasa para el análisis, ya que puede realizarse con pequeños volúmenes y bajas concentraciones de analitos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este video, demostramos una técnica basada en citometría de flujo para determinar la proporción de células T asesinas inducidas por citocinas, células CIK, expandidas a partir de un cultivo de células mononucleares de sangre periférica.

Reconocimiento de marcadores CD de células asesinas inducidas por citocinas humanas mediante citometría de flujo

Análisis citométrico de flujo de Complementación fluorescencia bimolecular proporciona un método cuantitativo de alto rendimiento para estudiar la interacción proteína-proteína. Esta metodología se puede aplicar a los sitios de unión de proteínas y de mapeo para los factores que regulan la interacción proteína-proteína de cribado.

El análisis por citometría de Complementación fluorescencia Bimolecular: A High Throughput Método cuantitativo para estudiar la interacción proteína-proteína

Análisis de la interacción de nanopartículas con subpoblaciones definidas de células inmunes por citometría de flujo.

La detección de nanopartículas fluorescentes Interacciones con inmunodeficiencia primaria subpoblaciones celulares por citometría de flujo

La inflamación juega un papel central en la patogénesis del ictus isquémico. Cada vez hay más pruebas que sugieren que actúa como un arma de doble filo que exacerba las lesiones cerebrales tempranas, pero también contribuye a la reparación posterior. Este protocolo describe el aislamiento de células inmunitarias del cerebro isquémico y su posterior fenotipado por citometría de flujo.

Aislamiento y análisis de citometría de flujo de células inmunes del cerebro isquémico Ratón

Un flujo de ensayo de enlace celular basado en la citometría se describe que se utiliza principalmente como una herramienta de detección para identificar compuestos que inhiben el atascamiento de un ligand de quimiocina CXC fluorescencia etiquetado 12 (CXCL12) para el receptor de quimiocina CXC 4 (CXCR4).

Un análisis basado en la citometría de flujo para identificar compuestos que alteran la Unión del ligando de quimiocina CXC marcada con fluorescencia 12 al CXC Chemokine Receptor 4

Este artículo describe un método para analizar el contenido de la célula inmune del tejido adiposo por el aislamiento de las células inmunes del tejido adiposo y posterior análisis mediante citometría de flujo.

Caracterización de células inmunes en el tejido adiposo humano mediante el uso de citometría de flujo

Imágenes de citometría de flujo proporciona un enfoque ideal para detectar la alteración morfológica y funcional de las células a nivel individual y poblacional. Alteración función endocíticas para la presentación de antígeno lípido en las células dendríticas humanas expuestas al contaminante se demostró con un combinado transcriptómicos de perfiles de expresión génica y manifestación morfológica de la proteína trata.

Integrar imágenes de citometría de flujo y transcriptómicos perfilado para evaluar trata de CD1d endocíticas alterada

El aislamiento de células de implantes disecados y su caracterización por citometría de flujo puede contribuir significativamente a la comprensión del patrón de respuesta inmune contra implantes. En este trabajo se describe un método preciso para el aislamiento de células de implantes disecados y su tinción para el análisis citométrico de flujo.

Citometría de flujo de alta dimensionalidad para el análisis de la función inmunitaria de tejidos de implantes disecados

Este protocolo describe un método de cribado de alto rendimiento basado en citometría de flujo para identificar fármacos de moléculas pequeñas que inhiben la activación de la integrina β2 en neutrófilos humanos.

Una técnica de alto rendimiento basada en citometría de flujo para el cribado de fármacos inhibidores de integrinas

En este trabajo se describe un protocolo para la cuantificación de modificaciones globales de histonas mediante citometría de flujo intranuclear en microglía cerebral aislada. El trabajo también contiene el protocolo de aislamiento de microglía que se utilizó para la recolección de datos.

Cuantificación de las modificaciones postraduccionales globales de histonas mediante citometría de flujo intranuclear en microglía cerebral de ratón aislada

La identificación de la microglía (MG) y los macrófagos infiltrantes periféricos (Mø) en la médula espinal lesionada es difícil. En este protocolo, se utilizó la citometría de flujo (FCM) para identificar MG similares a M1, MG similares a M2, Mø similares a M1 y Mø similares a M2, respectivamente. Esta tecnología también se puede aplicar a otras enfermedades del sistema nervioso central para comprender el papel de MG y Mø.

Identificación de microglía y macrófagos infiltrantes periféricos en la médula espinal lesionada mediante citometría de flujo

Aprende el método IP-FCM para analizar interacciones proteicas nativas mediante inmunoprecipitación y citometría de flujo. Esta técnica permite detectar complejos proteicos sin necesidad de ingeniería genética.

IP-FCM: inmunoprecipitación detectada por citometría de flujo

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