Evaluación de la función cardiaca y Energética en los corazones de ratón aislado utilizando ³¹ P espectroscopía de RMN

El objetivo general del siguiente experimento es observar la función cardíaca y la energía en un corazón de ratón perfundido aislado. Esto se logra perfundiendo un corazón de ratón en modo LOR. Como segundo paso, se inserta un globo lleno de agua en el ventrículo izquierdo o ventrículo izquierdo, lo que permite la monitorización constante de la función cardíaca durante el experimento.

A continuación, se coloca el corazón en un tubo de RMN de 10 milímetros y se inserta en el imán con el fin de evaluar la energía cardíaca mediante la observación de las resonancias de los fosfo-creatina-fosfatos de un TP y se obtuvieron los resultados de fosfato inorgánico que muestran la función cardíaca y la energética en base a las ondas de presión del VI y P 31 y una espectroscopia de masas p. Hola, Soy Steve Kitz del Centro de Metabolismo del MIT Cadre en el Departamento de Anestesiología de la Universidad de Washington. Hoy les mostraré un procedimiento para la perfusión cardíaca aislada combinada con espectroscopía de 31 PNMR.

Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para evaluar la función cardíaca y la energía en nuestros modelos de ratones de bioingeniería. Así que comencemos. Para comenzar este protocolo, prepare un litro de kres, por lo tanto, tampón ligero o KH.

Introduzca un 5% de dióxido de carbono y un 95% de burbujas de oxígeno en la mezcla durante 10 a 15 minutos. A continuación, añadir dos milimolares de cloruro cálcico, seguidos de sustratos, 10 milimolares de glucosa y 0,5 milimolares de piruvato. Para estos experimentos, se utilizan dos sistemas separados simultáneamente por adquisición de espectros P 31.

Un imán BRUER 14 T está conectado con la consola de tres avanzados y un ordenador equipado con el software top spin V 2.1 para la evaluación de la función cardíaca. Un sistema de perfusión cardíaca hecho a medida está conectado con el laboratorio de potencia. Cuatro 30 requisición de datos.

Equipado con el software lab chart PRO six para el análisis de datos. El aparato de perfusión cardíaca incluye una bomba peristáltica de tres pulsos mini controlada por un controlador de bomba STH utilizada para perfundir el tampón KH en la regulación de la temperatura cardíaca durante el experimento de RMN es fundamental. Los circuladores calentados se utilizan para mantener la temperatura entre 37,0 y 37,5 grados Celsius mientras el corazón está dentro del imán y la temperatura se controla durante la duración del experimento mediante una sonda de temperatura de fibra óptica.

A lo largo del experimento, la presión del VI y la presión de perfusión se controlan a través de transductores de presión que están conectados a un sistema de adquisición de datos y se muestran mediante el software incluido. Se utiliza un transductor fisiológico para controlar la presión del ventrículo izquierdo y un transductor de presión arterial desechable para controlar la presión de perfusión. Por último, se utiliza un cordón umbilical para suministrar el tampón oxigenado calentado al corazón.

Una vez dentro del imán, antes del inicio del experimento, calibre los transductores de presión con el manómetro de momento de fig estándar en primer lugar, sin presión en el transductor, para poner a cero la calibración. Luego infle este manómetro de modo fig a una presión más alta. Introduzca este valor en el programa informático.

A continuación, confirme que los transductores de presión se han calibrado adecuadamente inflando este manómetro de momento de higuera a presiones conocidas y verificándolas en la pantalla del ordenador. Una vez calibrados los transductores de presión, calibre la sonda de RMN con un tubo de RMN de 10 milímetros que contenga una muestra estándar de fosfato sódico de 150 milimolares. Realice la calibración utilizando el programa de software de giro superior.

Primero, ajuste la muestra para establecer la frecuencia de la resonancia del fósforo. A continuación, calza la muestra para crear un campo magnético homogéneo. Esta calibración inicial facilita la señal y disminuye el tiempo necesario para comenzar el período de adquisición.

Una vez que el corazón se coloca dentro de la sonda para iniciar la extracción del corazón del ratón, inyecte al ratón 200 unidades de heparina intraperitoneal para reducir la coagulación. Transcurridos cinco minutos, administrar 175 miligramos por kilogramo de Penta barbital sódico intraperitoneal. Una vez que el ratón esté anestesiado, colóquelo en su espalda y pegue los brazos y las piernas con cinta adhesiva para exponer el área del pecho.

Realice un pellizco en el dedo del pie para asegurarse de que el ratón esté completamente anestesiado. Cortar. Abra la cavidad peritoneal y el tórax con unas tijeras y use fórceps para despegar la caja torácica y exponer la cavidad torácica con fórceps. Sujete el tejido pulmonar y levante suavemente el corazón con unas tijeras curvas.

Corta los grandes vasos detrás del corazón y continúa lentamente hacia la cabeza del ratón hasta que el corazón esté libre. Detenga inmediatamente el corazón en el tampón KH helado. Mantenga los órganos en hielo y extraiga rápidamente los pulmones.

Identifique los lóbulos del timo y pélelos suavemente para exponer la aorta. A continuación, retira el timo. Por último, aísla la aorta retirando con cuidado cualquier tejido circundante.

Usando pinzas de microsutura, generalmente sostenga ambas paredes de la aorta para exponer la luz. A continuación, coloque con cuidado la aorta sobre la cánula. Fabricado con tubo de polietileno de 0,965 milímetros de diámetro exterior.

Sostenga la aorta en su lugar con una pinza de microvasos y ate rápidamente las suturas alrededor de la aorta. Una vez atadas las suturas, retire la pinza. Use las pinzas para verificar cuidadosamente que la cánula esté por encima de la raíz aórtica.

Añade los lazos adicionales que sean necesarios para mantener el corazón en su lugar. Retire cualquier tejido adicional con las pinzas y las microtijeras. Luego haz una pequeña incisión en el oráculo izquierdo.

Sostenga suavemente el corazón e inserte con cuidado un tubo de polietileno de 0,61 milímetros de diámetro a través de la aurícula izquierda, la cavidad ventricular izquierda y salga a través del ápice. Recorta el exceso de tubos. A continuación, inserte un globo lleno de agua desinflado a través de la aurícula hasta el ventrículo izquierdo.

Sostenga el globo en su lugar con cinta adhesiva. A continuación, aumente gradualmente la velocidad de la bomba peristáltica para proporcionar suficiente flujo al corazón. Continúe perfundiendo el corazón con tampón KH utilizando un flujo constante equivalente a aproximadamente dos mililitros por minuto hasta que el corazón se coloque en la sonda de RMN.

Infle el balón de VI con un volumen pequeño utilizando una jeringa micrómetro para verificar que el transductor de presión de VI funciona para la espectroscopia de RMN. Primero, inserte cuidadosamente el corazón en un tubo de RMN de 10 milímetros. Se coloca un spinner de jabalí ancho alrededor del tubo de RMN para ayudar a guiar el tubo a la posición correcta.

Dentro de la sonda, fije firmemente todo el aparato al cordón umbilical con cinta adhesiva. A continuación, baje lentamente el cordón umbilical en el orificio superior del imán hasta que el tubo de RMN que contiene el corazón esté dentro de la bobina de la sonda de RMN de 10 milímetros. Una vez que el corazón esté en la posición correcta dentro de la sonda, ajuste el flujo de la bomba parásita para lograr una presión de perfusión de 80 milímetros de mercurio.

Mantenga la presión de perfusión activando el mecanismo de retención en el controlador de la bomba. Permita un período de equilibrio de 15 a 20 minutos para el corazón. Durante el período de equilibrio, ajuste el volumen del balón VI para lograr una presión diastólica final de ocho a 10 milímetros de mercurio.

A continuación, optimice los parámetros del espectrómetro para obtener la mejor señal de fósforo posible. Sintonice el instrumento de RMN configurando el pulso de radio, es decir, la frecuencia a la que resuena el núcleo de fósforo. A continuación, calza la muestra para que el campo magnético sea homogéneo después del período de equilibrio.

Comience la adquisición de múltiples espectros de RMN P 31. El período de adquisición de cada espectro depende de la intensidad de campo del imán, el tamaño de la muestra y la relación señal/ruido requerida para un experimento específico. Aquí, los espectros se obtienen utilizando un imán de 14 Tesla promediando la señal obtenida de 256 pulsos de radiofrecuencia de 20 microsegundos con un ángulo de giro de 60 grados y retrasos de 2,0 segundos.

Este experimento requerirá aproximadamente 10 minutos. Una medida típica de la función cardíaca, la presión desarrollada por el VI se obtiene restando la presión diastólica final o PED de la presión sistólica. En un ratón C 57 negro seis, la presión cardíaca desarrollada por el VI es típicamente entre 100 y 110 milímetros de mercurio a una presión diastólica fija de ocho a 10 milímetros de mercurio.

Se muestran curvas de peinado representativas de ratones control y con bandas aórticas. La función sistólica está representada por la presión desarrollada en el VI sobre el aumento de los volúmenes del VI, determinado por el volumen del balón del VI. La función diastólica está representada por la PED sobre el aumento de los volúmenes del VI.

Los espectros de RMN P 31 de un corazón de ratón perfundido aislado proporcionan señales de FOSFOCREATINA o PCR, los tres fosfatos de un TP y fosfato inorgánico o pi. Aquí, el pico PI es relativamente pequeño. Esto es típico de un corazón con profusión aeróbica suministrado con piruvato o ácidos grasos.

Además de la glucosa durante los períodos de isquemia, este pico aumenta mientras que el pico de PCR disminuye. Acabo de mostrarte cómo preparar el corazón de un ratón para la perfusión, de modo que tanto la función cardíaca como la energía se puedan medir simultáneamente durante el experimento. Es importante asegurarse de que el corazón esté adecuadamente perfundido.

De lo contrario, los datos de RMN no serán fiables. Así que eso es todo. Gracias y buena suerte con tus experimentos.