Evaluación de la función cardiaca y Energética en los corazones de ratón aislado utilizando ³¹ P espectroscopía de RMN

El objetivo general del siguiente experimento es observar la función cardíaca y la energetica en un corazón de ratón aislado y perfundido. Esto se logra mediante la perfusión de un corazón de ratón en modo LOR. Con tampón Krebs-Henseleit enriquecido con glucosa y piruvato como segundo paso, se inserta un balón lleno de agua en el ventrículo izquierdo o VI, lo que permite la monitorización constante de la función cardíaca durante el experimento.

A continuación, el corazón se coloca en un tubo de RMN de 10 milímetros e inserta en el imán para evaluar la energetica cardíaca mediante la observación de las resonancias de los fosfatos de fosfocreatina y de TP, así como del fosfato inorgánico. Se obtuvieron resultados que muestran la función y la energetica cardíaca basados en las ondas de presión del ventrículo izquierdo y en el espectro de 31P-RMN y en un espectro de masas. Hola, soy Steve Kitz del Centro de Metabolismo MIT Cadre, del Departamento de Anestesiología de la Universidad de Washington. Hoy les mostraré un procedimiento para la perfusión aislada del corazón combinado con espectroscopía de 31P-RMN.

Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para evaluar la función cardíaca y la energetica en nuestros modelos de ratón bioingenierizados. Así que comencemos. Para iniciar este protocolo, prepare un litro de buffer KRES, también conocido como buffer KH.

Introduzca burbujas de 5% de dióxido de carbono y 95% de oxígeno en la mezcla durante 10 a 15 minutos. Luego agregue cloruro de calcio a dos milimolares, seguido de los sustratos, glucosa a 10 milimolares y piruvato a 0,5 milimolares. Para estos experimentos, se utilizan simultáneamente dos sistemas separados por cada adquisición de espectros de P 31.

Un imán BRUER de 14 T está conectado a una consola avanzada de tres canales y a un ordenador equipado con el software Top Spin V 2.1 para la evaluación de la función cardíaca. Un sistema de perfusión cardíaca construido a medida está conectado al Power Lab. Cuatro adquisiciones de datos de 30.

Equipado con el software Lab Chart PRO six para el análisis de datos. El aparato de perfusión cardíaca incluye una bomba peristáltica Mini Pulse Three controlada por un controlador de bomba STH, utilizada para perfundir el corazón; la regulación de la temperatura durante el experimento de RMN es fundamental. Se utilizan circuladores calefactados para mantener la temperatura entre 37,0 y 37,5 grados Celsius mientras el corazón está dentro del imán, y la temperatura se monitorea durante toda la duración del experimento mediante una sonda de temperatura de fibra óptica.

Durante todo el experimento, la presión del VI y la presión de perfusión se monitorean mediante transductores de presión conectados a un sistema de adquisición de datos y se muestran utilizando el software incluido. Se utiliza un transductor fisiológico para monitorear la presión del VI y un transductor desechable de presión arterial para monitorear la presión de perfusión. Finalmente, se utiliza un cordón umbilical para suministrar al corazón el tampón oxigenado y calentado.

Una vez dentro del imán, antes de comenzar el experimento, calibre los transductores de presión con el manómetro estándar de la figura en primer lugar, sin presión en el transductor, para ajustar a cero la calibración. Luego infle este manómetro de la figura a una presión más alta. Introduzca este valor en el programa informático.

Luego, confirme que los transductores de presión han sido calibrados adecuadamente inflando este manómetro de fig moment a presiones conocidas y verificándolas en la pantalla del ordenador. Una vez que los transductores de presión hayan sido calibrados, calibre la sonda de RMN con un tubo de RMN de 10 milímetros que contenga una muestra estándar de fosfato de sodio 150 milimolar. Realice la calibración utilizando el programa informático Top Spin.

Primero, ajuste la muestra para establecer la frecuencia de la resonancia del fósforo. Luego, nivele la muestra para crear un campo magnético homogéneo. Esta calibración inicial facilita la señal y disminuye el tiempo necesario para comenzar el período de adquisición.

Una vez que el corazón esté posicionado dentro de la sonda para comenzar la extracción del corazón de ratón, inyecte al ratón 200 unidades de heparina por vía intraperitoneal para reducir la coagulación. Después de cinco minutos, administre 175 miligramos por kilogramo de pentobarbital sódico por vía intraperitoneal. Una vez que el ratón esté anestesiado, colóquelo boca arriba y sujete las patas y brazos con cinta para exponer la zona torácica.

Realice una compresión en el dedo del pie para asegurarse de que el ratón esté completamente anestesiado. Corte. Abra la cavidad peritoneal y el tórax con tijeras y use pinzas para retirar la caja torácica y exponer la cavidad torácica. Sujete el tejido pulmonar y levante suavemente el corazón con tijeras curvas.

Corte los grandes vasos detrás del corazón y continúe lentamente hacia la cabeza del ratón hasta que el corazón quede libre. Detenga inmediatamente el corazón en tampón KH frío con hielo. Mantenga los órganos sobre hielo y retire rápidamente los pulmones.

Identifique los lóbulos del timo y retire suavemente cada uno para exponer la aorta. A continuación, elimine el timo. Finalmente, aísle la aorta retirando cuidadosamente cualquier tejido circundante.

Utilizando fórceps de sutura microquirúrgica, sostenga generalmente ambas paredes de la aorta para exponer la luz. Luego, coloque cuidadosamente la aorta sobre la cánula. Hecha de tubo de polietileno con diámetro externo de 0.965 milímetros.

Sujete la aorta en su lugar con una pinza para microvasos y ate rápidamente suturas alrededor de la aorta. Una vez anudadas las suturas, retire la pinza. Utilice la pinza para verificar cuidadosamente que la cánula esté por encima de la raíz aórtica.

Agregue cualquier atadura adicional necesaria para mantener el corazón en su lugar. Retire cualquier tejido sobrante utilizando la pinza y las tijeras microquirúrgicas. Luego, realice una pequeña incisión en el oráculo izquierdo.

Sujete suavemente el corazón e inserte con cuidado un tubo de polietileno de 0,61 mm de diámetro externo a través de la aurícula izquierda, la cavidad del ventrículo izquierdo y hacia afuera a través del ápice. Recorte el exceso de tubo. A continuación, inserte un balón desinflado lleno de agua a través de la aurícula hacia el ventrículo izquierdo.

Sujete el globo en su lugar utilizando cinta adhesiva. Luego aumente gradualmente la velocidad de la bomba peristáltica para proporcionar un flujo suficiente al corazón. Continúe perfundiendo el corazón con tampón KH utilizando un flujo constante equivalente a aproximadamente dos mililitros por minuto hasta que el corazón se coloque en la sonda de RMN.

Inflar el balón del VI con un pequeño volumen utilizando una jeringa micrométrica para verificar que el transductor de presión del VI está funcionando para la espectroscopía de RMN. Primero, insertar cuidadosamente el corazón en un tubo de RMN de 10 milímetros. Se coloca un rotor ancho alrededor del tubo de RMN para ayudar a guiar el tubo hacia la posición adecuada.

Dentro del sonda, sujete firmemente todo el aparato al cordón umbilical con cinta adhesiva. A continuación, baje lentamente el cordón umbilical dentro del orificio superior del imán hasta que el tubo de RMN que contiene el corazón esté dentro de la bobina de la sonda de RMN de 10 milímetros. Una vez que el corazón esté en la posición adecuada dentro de la sonda, ajuste el flujo de la bomba parasitaria para lograr una presión de perfusión de 80 milímetros de mercurio.

Mantenga la presión de perfusión habilitando el mecanismo de retención en el controlador de la bomba. Permita un período de equilibrio de 15 a 20 minutos para el corazón. Durante el período de equilibrio, ajuste el volumen del balón del VI para alcanzar una presión diastólica final de ocho a 10 milímetros de mercurio.

Luego optimice los parámetros del espectrómetro para obtener la mejor señal posible de fósforo. Ajuste el instrumento de RMN estableciendo el pulso de radiofrecuencia, de modo que coincida con la frecuencia a la cual resuena el núcleo de fósforo. A continuación, nivele la muestra para homogeneizar el campo magnético tras el período de equilibrio.

Inicie la adquisición de múltiples espectros de RMN de P 31. El período de adquisición para cada espectro depende de la intensidad del campo magnético, del tamaño de la muestra y de la relación señal-ruido requerida para un experimento específico. Aquí, los espectros se obtienen utilizando un imán de 14 Tesla, promediando la señal obtenida de 256 pulsos de radiofrecuencia de 20 microsegundos con un ángulo de giro de 60 grados y retrasos de 2,0 segundos.

Este experimento requerirá aproximadamente 10 minutos. Una medida típica de la función cardíaca, la presión desarrollada en el VI, se obtiene restando la presión al final de la diástole o EDP de la presión sistólica. En un ratón normal C57 black six, la presión desarrollada en el VI es típicamente de entre 100 y 110 milímetros de mercurio a una presión diastólica final fija de ocho a 10 milímetros de mercurio.

Se muestran curvas representativas de estrés desde ratones control y con banda aórtica. La función sistólica se representa mediante la presión desarrollada en el VI sobre volúmenes crecientes del VI, según se determinó por el volumen del balón en el VI. La función diastólica se representa mediante la PPD sobre volúmenes crecientes del VI.

Los espectros de RMN de 31P de un corazón de ratón aislado y perfundido proporcionan señales de FOSFOCREATINA o PCR, los tres fosfatos del ATP y el fosfato inorgánico o Pi. En este caso, el pico de Pi es relativamente pequeño. Esto es típico de un corazón perfundido en condiciones aeróbicas y suministrado con piruvato o ácidos grasos.

Además de la glucosa durante los períodos de isquemia, este pico aumenta mientras el pico de PCR disminuye. Acabo de mostrarle cómo preparar un corazón de ratón para la perfusión, de modo que tanto la función cardíaca como la energetica puedan medirse simultáneamente durante el experimento. Es importante asegurarse de que el corazón esté adecuadamente perfundido.

De lo contrario, sus datos de RMN no serán confiables. Eso es todo. Gracias y buena suerte con sus experimentos.