Name: En el Protocolo situ de Alas de Mariposa pupa Con ribosondas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Aprenda un protocolo optimizado de hibridación in situ con ribosondas para analizar la expresión génica en alas de pupa de Bicyclus anynana. Este método permite estudiar patrones temporales de ARN durante la pupación.

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Damos las gracias a Jayne Selegue, Margaret Hollingsworth, Berry Jin, Futahashi Ryo, Najmus Sahar Mahfudh, Popadic Aleksandar, Bob Reed, de apoyo técnico para ayudar a Roche en la solución de este protocolo. También queremos agradecer a William Piel para el consejo sobre la edición de la película.

DIA 1 <ol><li> Prepare las siguientes soluciones: <ul><li> 10x PBS </li><li> 1x PBS </li><li> 1x PBT </li><li> ddH2O <ul><li> Añadir DEPC 0,1% de volumen total y agitar vigorosamente soluciones. </li><li> Autoclave. </li></ul></li><li> Paraformaldehído al 4% Fix - con PBS-DEPC </li><li> Proteinasa K solución - si precipitado se presente y agitar vigorosamente antes de retirar alícuota </li><li> Detener la digestión Buffer </li><li> Prehibridación Buffer </li><li> 50:50 PBT: Buffer de prehibridación </li><li> La hibridación de búfer <ul><li> Las soluciones deben mantenerse libres de RNasa. Uso ya sea de vidrio-ware que se ha cocido (4 horas a 250 ° C) o de plástico desechable. Pipetas serológicas son muy útiles para la confección de soluciones </li></ul></li></ul></li><li> Diseccionar las alas de vez en escena pupas en PBS </li><li> Mover las alas directamente a Fix de búfer en pozos de 24 de placa de cultivo bien a temperatura ambiente </li><li> Fix discos durante 2 horas </li><li> Lavado de 5 x 5 minutos en PBT </li><li> Incubar las alas durante 3 minutos en solución de proteinasa K </li><li> Enjuague 2 x en tampón de digestión Detener </li><li> Lavado de 5 x 5 minutos en PBT </li><li> Lavado de 2 x 5 minutos en 50:50 PBT: PHB </li><li> Lavado de 1 x 10 minutos en PHB </li><li> Incubar en PHB por lo menos 1 hora a 55 ° C. </li><li> El calor desnaturaliza sonda de ARN (20-50ng necesario por tanto) (80 ° C durante 5 minutos) y añadir al tampón de hibridación (100 l que se necesita por tanto) </li><li> Añadir la sonda a los pozos y se incuba 48 horas a 55 ° C </li></ol> DÍA 3 <ol><li> Lavar 4 x 5 minutos en 55 ° C PHB </li><li> Incubar toda la noche en el PHB a 55 ° C </li></ol> DIA 4 <ol><li> Prepare las siguientes soluciones: <ul><li> Anticuerpos buffer de bloque </li></ul></li><li> Lavado de 1 x 5 minutos en 50:50 PBT: PHB </li><li> Lavar 4 x 5 minutos en PBT </li><li> Alas de incubar durante 1 hora en tampón de bloque a 4 ° C </li><li> Incubar las alas en una dilución 1:2000 de anticuerpos anti-Cavar la noche a 4 ° C </li></ol> DIA 5 <ol><li> Prepare las siguientes soluciones: <ul><li> Detección de Buffer </li></ul><ul><li> Solución en desarrollo - (envolver en papel de aluminio) sensible a la luz </li></ul></li><li> Lavar 3 x 5 minutos en PBT a temperatura ambiente </li><li> Lavado de 7 x 5 minutos en PBT </li><li> Enjuague alas dos veces en tampón de detección </li><li> Desarrollar alas en 1 ml de solución de desarrollo - el tiempo de desarrollo deben ser controlados cada vez que - el tiempo de programación puede cambiar, incluso cuando se utilizan las mismas sondas y la solución de desarrollo - en general, verificación después de 5-10 minutos y luego aumentar los intervalos durante toda la noche. Placa debe ser envuelto en papel de aluminio para evitar exposición a la luz cuando no la comprobación de muestras. </li><li> Enjuague cinco veces en el tampón de detener el desarrollo de </li><li> Montar las alas. </li></ol>

<ol><li>Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+and+eyespot+determination+in+butterfly+wings%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings.</a> Science. 265, 109-114 (1994).</li>
<li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+in+formamide+protects+RNA+from+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Solubilization in formamide protects RNA from degradation.</a> Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).</li>
<li>Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+a+hedgehog+regulatory+circuit+in+butterfly+eyespot+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution.</a> Science. 283, 532-534 (1999).</li>
<li>Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+line+transformation+of+the+butterfly+Bicyclus+anynana%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+R+Soc+Lond+B+%28Suppl%29%22%5BJournal%5D)">Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana.</a> Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).</li>
<li>Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+insights+into+questions+of+lepidopteran+wing+pattern+homology%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology.</a> BMC Developmental Biology. 6, 52(2006).</li>
<li>Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spatial+control+of+transgene+expresson+using+laser+induction+of+the+hsp70+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter.</a> BMC Developmental Biology. 6, 55(2006).</li>
<li>Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrabithorax+function+in+butterfly+wings+and+the+evolution+of+insect+wing+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns.</a> 9, 109-115 (1999).</li>
</ol>

Optimización de los protocolos existentes Hibridaciones in situ en los discos de ala larvas se han realizado exitosamente usando discos de Precis mariposas coenia (Carroll et al 1994;. Keys et al 1999;. Weatherbee et al 1999).. El actual protocolo ha sido adaptado de un protocolo escrito detallado disponible a petición del Laboratorio de Carroll para tinciones alas larvas. Los cambios que hemos hecho servir para dar cabida a las diferencias entre los tejidos del ala de larva y pupa. Durante pupal disecciones alas posteriores, la mem...

<table><tbody><tr><td>Buffer de fijación</td><td></td><td></td><td></td><td>4% Paraformaldehído en PBS</td></tr><tr><td>PBT</td><td></td><td></td><td></td><td>0,1% Tween 20 en PBS</td></tr><tr><td>Solución de Proteinasa K</td><td></td><td></td><td></td><td>2,5&amp;#109;g/ml de Proteinasa K en PBT</td></tr><tr><td>Buffer de detención de la digestión</td><td></td><td></td><td></td><td>2 mg/ml de glicina en PBT</td></tr><tr><td>Buffer de prehibridación</td><td></td><td></td><td></td><td>Para 50 ml de PHB: 12 ml de agua tratada con DEPC + 25 ml de formamida + 12,5 ml de SSC 20x + 50 µl de Tween 20 + 500 µl de esperma de salmón 10 mg/ml (libre de RNasa, desnaturalizado por calor antes de añadirlo a la solución).</td></tr><tr><td>Buffer de hibridación</td><td></td><td></td><td></td><td>Añadir glicógeno a 1 mg/ml al buffer de prehibridación</td></tr><tr><td>Buffer de bloqueo</td><td></td><td></td><td></td><td>50 mM Tris pH 6,8, 150 mM NaCl, 0,5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml de BSA</td></tr><tr><td>Anti-DIG</td><td>Ab</td><td>Roche Group</td><td>11 093 274 910</td><td>Conjugado con fosfatasa alcalina</td></tr><tr><td>Kit de buffer de lavado y bloqueo para DIG</td><td></td><td>Roche Group</td><td>11 585 762 001</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje acuoso Crystal Mount</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0612</td><td>Medio de montaje</td></tr></tbody></table>

en el protocolo situ de alas de mariposa pupa con ribosondas

In situ Protocol for Butterfly Pupal Wings Using Riboprobes

Aquí presentamos, en formato de vídeo, un protocolo para hibridaciones in situ en las alas de la crisálida de mariposa anynana Bicyclus con riboprobes. Hibridaciones in situ, uno de los pilares de la biología del desarrollo, son útiles para estudiar los patrones espaciales y temporales de la expresión génica en el desarrollo de los tejidos a nivel de la transcripción. Si los anticuerpos que se dirigen los productos de proteína de la transcripción de genes todavía no se han desarrollado, y / o hay varias copias del gen de una proteína en el genoma que no se puede diferenciar el uso de anticuerpos disponibles, en situs se puede utilizar en su lugar. Mientras que una técnica in situ para los discos de ala larval ha estado disponible para la comunidad de mariposas durante varios años, el actual protocolo ha sido optimizado para las alas más grandes y más frágiles de pupa.

Con el fin de examinar la expresión de genes en el tejido del ala pupal de Bicyclus anynana, presentamos un protocolo optimizado para hibridaciones in situ utilizando riboprobes. También proporcionar directrices para la optimización de este protocolo para su uso en las alas de las especies de lepidópteros pupal otros.

En el Protocolo situ de Alas de Mariposa pupa Con ribosondas

Presentamos, en formato de vídeo, un protocolo para hibridaciones in situ en alas de pupas de la mariposa Bicyclus anynana mediante el uso de ribosondas. La hibridación in situ...

Este es un protocolo ceto para alas de mariposa en la etapa de pupa. Así que comenzamos recolectando las prepupas del jaulón, colocándolas sobre una bandeja y luego fotografiando sus tiempos exactos de PPU paciente mediante fotografía de intervalos. Esto nos permite realizar las tinciones en momentos precisos posteriores a la pupación.Esto es importante porque diferentes ARNm para distintas proteínas se expresan en momentos diferentes después de la pupación. Aquí estamos diseccionando las alas de la pupa en una placa de Petri con base de silicona, y la parte importante consiste en retirar las alas y colocarlas en la solución fijadora para que queden muy planas. Si no están planas en esta etapa, nunca volverán a estarlo.Después del tiempo adecuado de fijación, eliminamos el tampón fijado y realizamos cinco lavados. El paso de proteinasa K con PBT es bastante crítico y se utiliza para permeabilizar los tejidos para que la sonda pueda penetrar; debe detenerse en el momento adecuado mediante estos enjuagues y lavados. El esperma de salmón funciona como una fuente económica de ADN para evitar que la sonda se una en todas partes.El esperma es uno de los componentes del tampón previo a la hibridación. Aquí estamos añadiendo el esperma al tampón previo a la hibridación, y luego se preparará una solución, que es esta mezcla 1:50:50 de P-B-T-P-H-B, mitad PBT y mitad tampón previo a la hibridación. Esta solución se utiliza como solución intermedia para transferir suavemente las alas desde la solución de PBT, donde han sido incubadas, hacia la solución previa a la hibridación.Y así hay un paso intermedio en el que las alas permanecerán inicialmente en esta solución al 50 50. Aquí, las alas se incuban en PHP durante 10 minutos y luego nuevamente en PHP durante una hora a 55 grados. Mientras tanto, prepararemos el tampón de hibridación, que consiste simplemente en tampón de prehibridación mezclado con glucógeno.Aquí estamos agregando glucógeno al PHV para preparar una pequeña cantidad de tampón de hibridización; a este tampón, vamos a añadir la sonda desnaturalizada. Por lo tanto, estamos calentando un bloque calefactor y centrifugando la sonda que se ha almacenado a menos 20, y trasladamos solo la cantidad adecuada de sonda a un tubo para desnaturalizarla a 80 grados durante aproximadamente cinco minutos. Aquí estamos desnaturalizando dos sondas simultáneamente, así que agregamos tampón de hibridización a la sonda, y luego añadimos cien microlitros de la mezcla de sonda a cada pocillo.Para finalizar este paso, cubriremos todos los pozos con perfil porque las alas se incubarán durante los próximos dos días a 55 grados, y el parfum evita la evaporación. Después de dos días de incubación, la sonda se elimina lavando las alas con PHP, y el último lavado permanece sobre las alas durante otras 12 a 24 horas. Finalmente, las alas se lavan mediante una serie de pasos para devolverlas a la solución PBT. Así pues, nuevamente utilizando la solución mixta 50 50 entre cada paso.En esta etapa, se añade la solución bloqueadora de anticuerpos a las alas y el anticuerpo anti-dig conjugado con fosfatasa alcalina se añade al PBT para obtener una concentración de aproximadamente uno a 2000. Se añadirán alrededor de 300 microlitros de esta solución de anticuerpo a cada pocillo, y luego las alas se colocarán en el refrigerador para incubar con el anticuerpo durante toda la noche. Al día siguiente, el anticuerpo se eliminará mediante una serie de lavados con PBT, y luego las alas se enjuagarán dos veces en el tampón de detección a temperatura ambiente.Finalmente, se añade un mililitro de solución reveladora a cada pocillo y las alas se cubren rápidamente con papel de aluminio. Después de aproximadamente 10 minutos, revisamos y observamos que las alas comienzan a verse de color púrpura, pero aún están un poco claras. Por lo tanto, se vuelven a cubrir, y algunos minutos después volvemos a revisar y han oscurecido un poco más.Tenga en cuenta que las alas incubadas en diferentes sondas parecían oscurecerse a tasas ligeramente distintas, por lo que decidimos volver a cubrirlas y, finalmente, 20 minutos después, decidimos detener la reacción con el tampón de parada del desarrollo. Ahora las alas están listas para ser montadas sobre un portaobjetos, así que agregamos una pequeña gota de medio de montaje a un portaobjetos etiquetado y trasladamos las alas al portaobjetos simplemente tomándolas con pinzas y colocándolas sobre la gota. Retire cualquier burbuja de aire, enderece suavemente el ala y cúbrala con un cubreobjetos.En este experimento, utilizamos la sonda que se dirige a los transcritos del gen grail, y los observamos localizados en el centro del futuro patrón IPO de la mariposa mediante cyclist anana durante las etapas tempranas del desarrollo de la pupa alar.

in-situ-protocol-for-butterfly-pupal-wings-using-riboprobes

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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El embrión de Xenopus laevis sigue siendo excepcionalmente útil en el estudio del desarrollo temprano debido a su gran tamaño y facilidad de manipulación.   Se proporciona un protocolo simplificado para el protocolo de hibridación in situ de montaje completo que se puede utilizar en la identificación de órganos específicos en este sistema modelo.

La comprensión temprana Organogenesis Usando una simplificado<em&gt; In Situ</em&gt; Protocolo de hibridación en<em&gt; Xenopus</em

Este protocolo demuestra cómo la proximidad Ligadura ensayo se puede usar para detectar in situ en las interacciones proteína-proteína en la unión neuromuscular Drosophila larval. Con esta técnica, los discos grandes y Hu-li shao tai se muestra para formar un complejo en la región postsináptica, una asociación identificado previamente a través de co-inmunoprecipitación.

Detección de In Situ Complejos proteína-proteína en la Drosophila Larval unión neuromuscular Usando proximidad Ligadura Ensayo

Se describe un montaje de todo el hibridación in situ procedimiento multi-objetivo cromogénico (MC-DESEO) en embriones de Drosophila intactos permitiendo la detección simultánea y específica de tres patrones de distribución de ARNm diferentes contrastando precipitados de color.

Multi-objetivo Cromogénico Todo el montaje<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación para comparar dominios de expresión génica en<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones

La capacidad para detectar con precisión las transcripciones o las proteínas en los tejidos de la Drosophila es fundamental para el estudio de su abundancia y localización relacionada con el proceso de desarrollo. Aquí está la descripción de un sencillo procedimiento para disecar alas pupas. Estas alas pueden utilizarse como muestras en diversas técnicas (análisis de PCR, immunohistochemistry, etc.).

Un método rápido y eficiente para disecar alas Pupal de Drosophila apto para Immunodetections o ensayos PCR

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Este protocolo describe un enfoque eficaz de hibridación in situ para detectar los niveles de expresión de ARNm y los patrones espaciales de los genes diana en el líquido celómico Sipunculus nudus.

Hibridación in situ para Sipunculus nudus Coelomic Fluid

Aprenda un protocolo optimizado de hibridación in situ con ribosondas para analizar la expresión génica en alas de pupa de Bicyclus anynana. Este método permite estudiar patrones temporales de ARN durante la pupación.

En el Protocolo situ de Alas de Mariposa pupa Con ribosondas

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