Etiquetado DiOLISTIC de las neuronas de los roedores y no humanos rodajas de cerebro de los primates

Mi nombre es Gail Siebel y soy investigadora postdoctoral en el laboratorio de la Dra. Veronica Alvarez en el Instituto Nacional sobre el Abuso de Alcohol y Alcoholismo. Este trabajo se realizó en colaboración con el Dr. Kathleen Grant y Andrew Wow en el Centro de Primates de Oregón, y con el Dr. James Dene en la Universidad Wake Forest, quienes proporcionaron el tejido de primates no humanos utilizado en este estudio. El objetivo principal de este procedimiento es introducir colorantes fluorescentes en neuronas y etiquetar secciones cerebrales de diferentes especies, como roedores y primates de cualquier edad.

Para estudiar la morfología de las dendritas y las espinas dendríticas, esto se logra primero recubriendo las Ts y las perlas con un colorante lipofílico como D eye. El segundo paso del procedimiento consiste en revestir el tubo con perlas recubiertas de D eye y cortarlo en pequeños fragmentos que sirven como proyectiles para el sistema de la pistola génica Helios. El tercer paso del procedimiento es disparar perlas recubiertas con D eye hacia cortes cerebrales utilizando la pistola génica.

El paso final del procedimiento es opcional, ya que la estilística puede combinarse con la tinción inmunológica para localizar simultáneamente otros marcadores. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran una marcación fluorescente dispersa de neuronas, adecuada para imágenes de alta resolución, como microscopía confocal o de dos fotones, y para el estudio de la ramificación dendrítica y la morfología de las espinas dendríticas. La principal ventaja de esta técnica frente a nuestros métodos existentes es que la estilística puede aplicarse a secciones cerebrales de animales de cualquier especie, edad y genotipo.

Puede utilizarse en combinación con inmunotinción y produce una marcación fluorescente dispersa adecuada para microscopía de alta resolución. Antes de fabricar las microperlas, recubra las perlas de tungsteno con un colorante lipofílico en una campana extractora química utilizando 450 mililitros de cloruro de metileno por 13,5 miligramos de colorante lipofílico (diluyendo el colorante para obtener una concentración final de 30 miligramos por mililitro). Tome un tubo pre-eloja que contenga 300 miligramos de perlas de tungsteno y añada 300 microlitros de cloruro de metileno; agite vigorosamente para resuspender las perlas y obtener una solución homogénea.

Solo se utilizan 100 miligramos de perlas de tungsteno por conjunto de balas, pipeteando hacia arriba y hacia abajo para mantener las perlas en suspensión, añada 100 mililitros de las perlas y el colorante disuelto sobre un portaobjetos de vidrio y mézclelos completamente. Con la punta de una pipeta, deje secar al aire completamente hasta que las perlas adquieran un color gris claro. Coloque un trozo limpio de papel encerado blanco debajo del portaobjetos utilizando una cuchilla limpia; para cada color de balas, raspe las perlas del vidrio, deslice y muela las perlas en un polvo fino.

Raspe las perlas recubiertas sobre papel de suero y colóquelas mediante un embudo en un tubo cónico de 15 mililitros. Añada tres mililitros de agua y someta a ultrasonidos en un baño de agua durante 10 a 30 minutos a temperatura ambiente para deshacer completamente cualquier grumo. Corte 0,7 metros de tubo turquesa con un ángulo en un extremo y conecte el otro extremo a una jeringa de 12 mililitros utilizando un adaptador de tubo, coloque el extremo libre en un tubo que contenga 10 mililitros de una solución de polivinil peroné o PVP de 10 miligramos por mililitro y aspire la solución completamente a través del tubo y dentro de la jeringa.

Vortexee la solución de perlas mientras impulsa con la jeringa para obtener una mezcla homogénea, trabajando rápidamente para evitar la precipitación de las perlas; aspire completamente la solución hacia el interior del tubo. Evite introducir burbujas de aire, ya que impedirán que las perlas se adhieran al tubo en esos puntos, mientras mantiene el tubo tenso desde ambos extremos. Inclínelo de un lado a otro para distribuir uniformemente.

Distribuya las perlas. Introduzca el tubo en la estación de preparación y deje que las perlas sedimenten durante 30 a 60 segundos. Utilice la jeringa para empujar de forma lenta pero constante.

Retire el agua dejando las perlas. Desconecte inmediatamente la jeringa y comience a girar el tubo. Ajuste el flujo de nitrógeno en la estación de preparación a cuatro o cinco LPM secos durante 10 a 20 minutos hasta que las gotas de agua ya no sean visibles.

Retire el tubo de la estación de preparación, corte las balas en segmentos de 13 milímetros de longitud con el cortador de tubos; en las balas buenas se observará una tenue bruma gris que recubre uniformemente el interior. Coloque las balas en viales de centelleo envueltos en papel de aluminio que contengan un agente desecante como sulfato de calcio anhidro. Almacénelos a temperatura ambiente hasta que estén listos para usar.

La marcación con DiI se puede utilizar para teñir neuronas en tejido cerebral de diversas especies y edades, y se puede conservar mediante varios métodos. Coloque secciones de cerebro, fijadas ya sea antes o después de cortar, en los pocillos de una placa de 24 pocillos.

Lave las secciones en una XPB S3 tres veces, durante cinco a 10 minutos por lavado. Aspire el PBS y use un pincel para centrar la sección en el pocillo. Coloque un trozo de filtro de 3.0 micrómetros entre las dos pantallas metálicas de difusión en el extremo del revestimiento del cañón del genio.

Sostenga la pistola génica de modo que el extremo del revestimiento del cañón esté a 1,5 centímetros de distancia de la muestra. Dispare las perlas hacia la sección con una presión de gas de helio entre 120 y 180 PSI. Enjuague las secciones rápidamente tres veces con un XPBS para eliminar el exceso de colorante.

Asegúrese de mantener la superficie del corte del fragmento orientada hacia arriba durante todos los pasos de manipulación de líquidos. Almacene los fragmentos en PBS durante tres a seis horas para permitir que el DAI se extienda a lo largo de las dendritas, cubriendo con papel de aluminio. Dado que el DAI es sensible a la luz, los fragmentos pueden montarse en esta etapa o someterse a tinción adicional con anticuerpos, como se detalla en la siguiente sección, para continuar con la tinción usando de 300 a 500 microlitros de solución de permeabilización que contiene 0,01 % TRITON X-100 en 1X PBS por cada fragmento, e incubar a temperatura ambiente durante exactamente 15 minutos.

Retire la solución de permeabilización de los pocillos, bloquee las secciones en una solución que contenga 10% de suero de cabra y 0,01% de Triton X-100 en PBS 1X, e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. Añada de 300 a 500 microlitros de anticuerpo primario diluido en la solución de bloqueo a cada pocillo, incube a temperatura ambiente durante una a dos horas o durante la noche, según el anticuerpo. Lave las secciones tres veces con PBS 1X, durante cinco a 15 minutos cada lavado, y retire la solución del pocillo.

Añada de 300 a 500 microlitros de anticuerpo secundario diluido en solución bloqueante a cada pozo. Lave cuatro veces con un XPBS durante cinco a 15 minutos por lavado, como antes. Monte las secciones sobre un portaobjetos de vidrio con medio de montaje fluorescente y cúbralas con una cubreobjetos de 18 por 18 milímetros. Deje secar durante seis a 12 horas a temperatura ambiente antes de sellar los bordes con esmalte transparente, y almacene en la oscuridad o cubierto a cuatro grados Celsius.

Se muestran aquí imágenes ejemplares de secciones cerebrales marcadas. Dos características importantes a observar son un patrón de marcado escaso a baja magnificación y la capacidad de identificar componentes celulares individuales. Una preparación incorrecta de las microbalas o una fijación excesiva del tejido pueden provocar un marcado deficiente, como se muestra aquí.

Se proporcionan consejos para la resolución de problemas en el texto siguiente. Hay una imagen confocal de una neurona espinosa media del TAL del cerebro de ratón y su complejo patrón de ramificación dendrítica. El seccionado óptico logrado al utilizar microscopía confocal permite el aislamiento de células individualmente marcadas en el corte de tejido.

Las imágenes de alta magnificación muestran segmentos de dendritas de un cerebro de roedor y de un cerebro de primate no humano. Obsérvese la alta intensidad de la tinción fluorescente lograda con esta técnica, que da como resultado espinas dendríticas bien definidas al combinar ICS con tinción inmunológica. Esta imagen muestra un ejemplo de colocalización de la marcación D eye en rojo con la tinción inmunológica para la expresión de GFP en verde.

Esta imagen corresponde a un corte de sal del cerebro de un ratón transgénico que expresa la proteína fluorescente GFP bajo el promotor del receptor de dopamina D1. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar proyectiles y utilizar la pistola Jing para marcar escasamente neuronas con colorantes fluorescentes. Esta técnica permite la visualización clara de la morfología neuronal y el estudio de la ramificación dendrítica y las espinas.