Etiquetado DiOLISTIC de las neuronas de los roedores y no humanos rodajas de cerebro de los primates

Se demuestra el uso de la pistola de genes para introducir tintes fluorescentes, como DII, en las neuronas en secciones de cerebro de los roedores y primates no humanos de diferentes edades. En este caso particular, utilizamos ratones adultos (3-6 meses de edad) y adultos de los monos cynomologus (9-15 años). Esta técnica, descrita originalmente por el laboratorio del Dr. Lichtman (Gan

Mi nombre es Gail Siebel y soy becaria postdoctoral en el laboratorio de la Dra. Verónica Álvarez en el Instituto Nacional sobre el Abuso del Alcohol y el Alcoholismo. Este trabajo se realizó en colaboración con la Dra. Kathleen Grant y Andrew Wow del Centro de Primates de Oregón y el Dr. James Dene de la Universidad de Wake Forest, quienes proporcionaron el tejido de primates no humanos utilizado en este estudio. El objetivo de revisión de este procedimiento es introducir tintes fluorescentes en las neuronas y etiquetar secciones del cerebro de diferentes especies, como roedores y primates de cualquier edad.

Con el fin de estudiar la morfología de las dendritas y las espinas dendríticas, esto se logra recubriendo primero las Ts y las cuentas con un tinte lipofílico como el ojo D. El segundo paso del procedimiento es forrar el tubo con cuentas recubiertas de ojo D y cortarlo en pedazos pequeños que sirven como balas para el sistema de pistola genética Helios. El tercer paso del procedimiento es disparar cuentas recubiertas de ojos D en cortes de cerebro usando la pistola de genes.

El paso final del procedimiento es opcional, ya que el estilo puede combinarse con la inmunotinción para localizar simultáneamente otros marcadores. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran un escaso marcaje fluorescente de las neuronas adecuado para imágenes de alta resolución, como la microscopía confocal o de dos fotones, y el estudio de la ramificación dendrítica y la morfología de la columna dendrítica. La principal ventaja de esta técnica sobre nuestros métodos existentes es que la estilística se puede aplicar a secciones del cerebro de animales de todas las especies, edades y genotipos.

Se puede utilizar en combinación con la inmunotinción y produce un marcaje fluorescente disperso que es adecuado para la microscopía de alta resolución antes de fabricar balas. Cubra las perlas de tungsteno con tinte lipofílico en una campana de humo químico a 450 mililitros de cloruro de metileno por 13,5 miligramos de tinte lipofílico para obtener una concentración final de 30 miligramos por mililitro. Tome un tubo pre Eloqua que contenga 300 miligramos de perlas de tungsteno y agregue 300 microlitros de cloruro de metileno para resuspender las perlas y hacer una solución homogénea.

Solo se utilizan 100 miligramos de perlas de tungsteno por juego de balas pipeteando hacia arriba y hacia abajo para mantener las perlas resuspendidas, agregue 100 mililitros de las perlas y el ojo del troquel disuelto en un portaobjetos de vidrio y mézclelos bien. Con una punta de pipeta, deje que se seque completamente al aire hasta que las perlas se vuelvan de color gris claro. Coloque un pedazo limpio de papel blanco encerado debajo de la diapositiva con una cuchilla de corredor limpia Para cada color de balas, raspe las cuentas del vidrio, deslícelas y córtelas en dados hasta obtener un polvo fino.

Raspe las perlas recubiertas en papel de suero y canalícelas en un tubo cónico de 15 mililitros. Agregue tres mililitros de agua y sonique en el baño de agua durante 10 a 30 minutos a temperatura ambiente para romper completamente los grumos. Corte 0,7 metros de tubo verde azulado con un ángulo en un extremo y conecte el otro extremo a una jeringa de 12 mililitros con un adaptador de tubo, coloque el extremo libre en un tubo que contenga 10 mililitros de una solución de polivinilo perone o PVP de 10 miligramos por mililitro, y extraiga la solución completamente a través del tubo y dentro de la jeringa.

Agite la solución de perlas mientras bombea con la jeringa para hacer una mezcla homogénea que funcione rápidamente para evitar la precipitación de las perlas, extraiga la solución completamente en el tubo. Evite introducir burbujas de aire, lo que evitará que las cuentas se adhieran al tubo en ese lugar mientras mantiene el tubo tenso desde ambos extremos. Inclínalo de lado a lado para uniformemente.

Distribuye las cuentas. Introduzca el tubo en la estación de preparación y deje que las cuentas se asienten durante 30 a 60 segundos. Use la jeringa para lento pero suavemente.

Retira el agua dejando las perlas. Desconecte inmediatamente la jeringa y comience a girar el tubo. Ajuste el flujo de nitrógeno en la estación de preparación a cuatro o cinco LPM en seco durante 10 a 20 minutos hasta que las gotas de agua ya no sean visibles.

Retire el tubo de la estación de preparación, corte las balas en longitudes de 13 milímetros con el cortador de tubos observado y en buen estado las balas tendrán una tenue neblina gris que cubrirá uniformemente el interior. Coloque las balas en viales de centelleo envueltos en papel de aluminio que contengan un agente secante como el sulfato de calcio anhidro. Guárdelo a temperatura ambiente hasta que esté listo para disparar.

El etiquetado Diic se puede utilizar para teñir neuronas en tejido cerebral de diversas especies y edades y se puede preservar utilizando varios métodos. Coloque las rodajas de cerebro que se hayan fijado antes o después de cortarlas en los pozos de un 24. Plato de pozo.

Lave las rodajas en un XPB S3 veces durante cinco a 10 minutos por lavado. Pipetea el PBS, usa un pincel para centrar la rebanada en el pozo. Coloque un trozo de filtro de 3,0 micrómetros entre las dos pantallas de difusión metálicas en el extremo del revestimiento del cañón de la pistola genética.

Sostenga la pistola genética de modo que el extremo del revestimiento del cañón esté a 1,5 centímetros de la muestra. Dispare las cuentas en la rebanada con una presión de gas helio de 120 a 180 PSI. Enjuague las rodajas rápidamente tres veces con un XPBS para eliminar el tinte adicional.

Asegúrese de mantener la superficie de la rebanada hacia arriba durante todos los pasos de manipulación de líquidos. Guarde las rodajas en PBS durante tres a seis horas para permitir que el DAI se extienda a lo largo de las dendritas y cubra con papel de aluminio. Como el dai es sensible a la luz, las rodajas pueden montarse en esta etapa o someterse a una tinción adicional con anticuerpos como se detalla en la siguiente sección para proceder a la tinción a 300 a 500 microlitros de solución de permeación que contiene 0,01%TRITTON X 100 en un XPBS a cada rebanada, incubar a temperatura ambiente durante exactamente 15 minutos.

Retire la solución de permeación de los pocillos, bloquee las rodajas en una solución que contenga 10% de suero de cabra y 0,01% de tritan X 100 en una incubación XPBS a temperatura ambiente durante 30 minutos. Agregue de 300 a 500 microlitros de anticuerpo primario diluido en solución bloqueante a cada uno. Incubar bien a temperatura ambiente durante una o dos horas o toda la noche, dependiendo del lavado de anticuerpos, cortar tres veces con un XPBS durante cinco a 15 minutos en cada lavado, retirar la solución del pozo.

Agregue de 300 a 500 microlitros de anticuerpo secundario diluido en solución bloqueante a cada uno. Lavar bien cuatro veces con un XPBS durante cinco a 15 minutos cada lavado como antes, montar las rodajas en un portaobjetos de vidrio con medio de montaje fluorescente y cubrir con un tubo de 18 por 18 milímetros. Deje secar de seis a 12 horas a temperatura ambiente antes de sellar los bordes con esmalte de uñas transparente almacenado en la oscuridad o cubierto a cuatro grados centígrados.

Aquí se muestran imágenes ejemplares de secciones cerebrales etiquetadas. Dos características importantes a tener en cuenta son un patrón de etiquetado escaso a bajo aumento y la capacidad de identificar componentes celulares individuales. La preparación incorrecta de las balas o la fijación excesiva del tejido pueden dar lugar a un mal etiquetado, como se muestra aquí.

Los consejos para la solución de problemas se proporcionan en el texto aquí. Hay una imagen confocal de una neurona espinosa media TAL del cerebro de ratón y su complejo patrón de ramificación dendrítica. El corte óptico logrado cuando se utiliza la microscopía confocal permite el aislamiento de células marcadas individuales en la sección de tejido.

Las imágenes de gran aumento muestran segmentos de dendritas de un cerebro de roedor y un cerebro de primate no humano. Obsérvese la alta intensidad de la tinción fluorescente lograda con esta técnica, lo que da como resultado espinas dendríticas bien definidas al combinar ICS con inmunotinción. Esta imagen muestra un ejemplo de colocalización del marcaje ocular D en rojo con inmunotinción para la expresión de GFP en verde.

Esta imagen corresponde a un corte de sal de un ratón transgénico que expresa la proteína fluorescente GFP bajo el promotor del receptor de dopamina D uno. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar balas y usar la pistola Jing para neuronas escasamente susceptibles con tintes fluorescentes. Esta técnica permite la visualización clara de la morfología neuronal y el estudio de las ramificaciones y espinas de los ditos.