Diferencial de imágenes de las estructuras biológicas con doblemente resonante coherente anti-Stokes Raman Scattering (CARS)

Este video muestra un procedimiento para realizar imágenes diferenciales de dos resonancias de ramen asociadas con estructuras biológicas con señales coherentes de dispersión de ramen. Los tres primeros láseres de pulso corto sincronizados se superponen en el tiempo y en el espacio. A continuación, los pulsos superpuestos se envían a un microscopio invertido estándar, lo que permite la generación de señales de ramen coherentes a partir de objetos microscópicos.

Las señales se convierten en imágenes utilizando software comercial para comparar las diferentes señales de ramen que se producen. Los resultados indican que la diferencia entre las imágenes obtenidas a partir de señales de ramen resonantes dobles y aisladas proporciona una mayor sensibilidad para las señales débiles de ramen. Hola, soy Tyler Weeks, del Centro de Biofotónica de la Universidad de California Davis.

Soy Thomas ER, del Centro de Biofotónica y del Departamento de Medicina Interna de la Universidad de California en Davis. Hoy le mostraremos un procedimiento para usar la dispersión de ramen antis stokes coherente doblemente resonante para producir imágenes químicamente específicas de las células. Utilizamos este procedimiento para detectar señales de moléculas que son demasiado débiles para ser detectadas directamente por espectroscopía coherente antis Stokes Ramon sola.

Así que comencemos: Para generar la señal de los automóviles y los automóviles Dr simultáneamente, se requieren tres fuentes láser de pulso corto sintonizables y sincronizadas para obtener estos pulsos sincronizados. Comience con un solo láser de pulso corto con una potencia de salida de 10 vatios. Una longitud de onda fija de 1064 nanómetros, una longitud de pulso fija de siete picosegundos y una tasa de repetición fija de 76 megahercios.

Usando una serie de placas de media onda y cubos divisores de haz polarizados, el haz se divide en tres partes. Una placa intermedia combinada con un cubo divisor de haz polarizado permite el ajuste de la cantidad de potencia en cada componente del haz sin cambiar su dirección. Por lo general, dos haces se ajustan a aproximadamente 4,5 vatios cada uno, y el tercer haz contiene el vatio restante.

A continuación, los dos haces de alta potencia se dirigen a dos osciladores ópticos paramétricos independientes u OPO. Las OPO utilizan la generación de diferentes frecuencias para convertir un fotón de alta energía en dos fotones de menor energía con diferentes longitudes de onda. Al controlar la temperatura del cristal utilizado para lograr este efecto, las longitudes de onda de los fotones resultantes se pueden controlar con una precisión de 0,1 nanómetros.

Al duplicar la frecuencia de estas señales, un láser con una longitud de onda fija de 1064 nanómetros ahora se puede transformar en un rayo láser que se puede ajustar en cualquier lugar entre 780 nanómetros y 910 nanómetros bombeando dos OPO separados con la misma fuente de 1064 nanómetros. Se obtienen dos fuentes láser sintonizables de forma independiente que se sincronizan automáticamente con nuestro láser de bomba original. El tercer haz del láser de bomba de 1064 nanómetros se dirige alrededor de los OPO mediante una combinación de espejos dieléctricos para que los tres haces puedan recombinarse más tarde.

Con el fin de producir de manera eficiente fotones de señal de ramen coherentes, los pulsos recombinados deben superponerse tanto temporal como espacialmente porque los OPO contienen cavidades de anillo que permiten que cada pulso de láser pase a través del cristal varias veces que el haz enviado a través de los OPO viaja una distancia adicional, lo que resulta en un retraso considerable en relación con el haz de la bomba original. Esta distancia debe compensarse con un tercer haz mediante la introducción de espejos adicionales que obliguen a este haz a recorrer la misma distancia que los otros dos antes de que se recombinen mediante espejos dicroicos para proporcionar un ajuste fino de la longitud del camino. Cada haz se envía a través de etapas de retardo ajustables, que permiten ajustar la superposición temporal de los diferentes pulsos láser.

Se agrega otro conjunto de placas intermedias y cubos divisores de haz polarizadores a cada haz para permitir el ajuste de la potencia láser de cada haz de forma independiente. Los espejos dicroicos se utilizan para combinar primero los haces de los dos OPO, y luego se debe tener cuidado con el haz de 1064 nanómetros para garantizar que los haces se superpongan con precisión en el espacio. Esto se puede verificar comparando la superposición de los haces a unos pocos centímetros del espejo dicroico con los que se encuentran aproximadamente a un metro del espejo dicroico.

Debido a que la exposición a rayos láser de alta potencia promedio puede dañar la muestra, los tres haces combinados se envían a través de un modulador óptico eléctrico que funciona como un selector de pulsos, lo que permite ajustar la tasa de repetición de los pulsos que llegan a la muestra y, por lo tanto, la potencia promedio. A continuación, los rayos láser combinados se acoplan a un microscopio invertido con una lente objetivo de alta apertura numérica o na. El enfoque ajustado generado por la lente del objetivo de alta NA permite la generación más eficiente de señales de ramen coherentes en escalas de longitud microscópicas.

La lente del objetivo del microscopio está montada en una platina de pizo X, Y, Z, lo que permite obtener imágenes mediante el escaneo de trama de los haces a través de la muestra de manera similar a los microscopios confocales de escaneo de haz comerciales. Ahora veamos cómo generar automóviles y señales D-R-F-W-M, la interacción de tres rayos láser de pulso corto en la muestra da como resultado la generación de varias señales de mezcla de cuatro ondas, como automóviles, de las diversas combinaciones de dos láseres, así como señales de automóviles de tres colores y automóviles DR de la combinación de los tres láseres. Cuando las señales están relativamente cerca en longitud de onda, puede ser difícil separarlas para el análisis.

Por esta razón, las señales se pasan a un espectrómetro de imágenes que también sirve como monocromador o filtro de paso de banda para separar espacialmente las señales en diferentes longitudes de onda. Un espejo abatible accionado electrónicamente dentro del espectrómetro en la posición bajada envía la señal a un dispositivo acoplado de carga de agotamiento profundo retroiluminado o cámara CCD, que proporciona información espectroscópica en todo el rango de la señal y nos permite identificar y optimizar las diversas señales petirrojos coherentes para seleccionar la señal a la imagen. Simplemente gire la clasificación dentro del espectrómetro utilizando el software de control y adquisición de datos suministrado por el proveedor para centrar el pico de interés en la cámara CCD.

A continuación, cambie la posición del espejo abatible para redirigir la señal a un segundo puerto de salida al que se conecta un solo recuento de fotones, una avalancha, una foto, DDE o un PD. Mapa de bits. Escanee la lente del objetivo y luego use las señales registradas en el A PD para generar una imagen mostrando la tasa de conteo de fotones para cada píxel con el software de adquisición de datos. Repita este procedimiento de imagen para cada señal de ramen coherente deseada para que las señales se puedan comparar durante el posprocesamiento.

Ahora veamos cómo preparar correctamente una muestra para obtener imágenes claras y reproducibles. Se debe tener cierto cuidado en la preparación de las muestras. Por lo general, las muestras se preparan en cubreobjetos de vidrio de aproximadamente 150 micras de grosor.

Estos cubreobjetos son lo suficientemente delgados como para permitir imágenes de alta resolución con las lentes de objetivo de inmersión en agua o aceite de alta NA que se utilizan en estos experimentos. Para demostrar la preparación de una muestra típica, preparamos secciones de aproximadamente 20 micras de espesor de tejido muscular de ratón que se fijan a un portaobjetos de microscopio. Se añade a la muestra una gota de 20 microlitros de solución de glucosa deuterada de cinco molares.

La solución de glucosa deuterada proporciona una firma de fondo de ramen única y fuerte. Se coloca un cubreobjetos de vidrio encima de la muestra y se fija en su lugar con esmalte de uñas para células y cultivo. Se pueden utilizar placas de cultivo con fondo de vidrio que permiten obtener imágenes sin necesidad de separar las células de sus placas de crecimiento de cultivo celular.

Ahora veamos cómo determinar el ron y los picos adecuados para los autos Dr. Con el fin de aprovechar adecuadamente el efecto de mejora doblemente resonante, se deben conocer los espectros de ramen de ambas sustancias resonantes del ramen. Por lo general, estos son 2.845 centímetros inversos asociados con lípidos y 2.121 centímetros inversos para el modo de estiramiento CD asociado con la glucosa deuterada.

La dispersión coherente del ramen se logra cuando la diferencia de frecuencia entre dos láseres coincide con la frecuencia de una vibración molecular. Al ajustar un OPO a 817 nanómetros, sondeará el modo C de 2.845 centímetros inversos cuando se combine con el rayo láser de 1064 nanómetros, y al ajustar el otro OPO a 868 nanómetros, sondeará los 2.121 centímetros inversos cuando se combine con el haz de 1064 nanómetros. En el modo espectroscópico, el microscopio del automóvil nos permite observar tres señales de ramen coherentes de interés, una señal de automóvil que sondea la vibración de estiramiento CH, una señal de automóvil que sondea el modo de estiramiento CD y una señal de automóvil DR que sondea ambos en el diagrama que se muestra aquí, las flechas discontinuas indican fotones del láser en los OPO y las flechas sólidas indican la señal resultante.

Las líneas horizontales continuas indican la energía de la vibración del ramen y dan una representación visual de que en los coches DR la mezcla de los mismos tres fotones de entrada simultáneamente sondea dos vibraciones de ramen diferentes. La intensidad de la señal para cada pico deberá optimizarse sintonizando en pasos finos alrededor de estas ubicaciones de pico. Aquí seleccionamos cada pico y tomamos imágenes de gusanos de mar elgan en una solución de glucosa disminuida, la extracción de información adicional basada en estas tres imágenes obtenidas individualmente requiere un procesamiento de imágenes bastante simple.

En primer lugar, hay que normalizar las imágenes. Un método práctico para la normalización se basa en el hecho de que los lípidos son hidrofóbicos. Esto significa que en regiones de lípidos de alta densidad, la resonancia CD de la glucosa debería contribuir muy poco a la señal de doble resonancia.

Por el contrario, en regiones de solución de glucosa pura, las resonancias CH de los lípidos también deberían contribuir muy poco. Con esto en mente, normalice la imagen del automóvil DR y la imagen del automóvil obtenida en la resonancia CD de la solución de glucosa deuterada a una región muy fuera del gusano de CL egan que no debería exhibir resonancia CH. A continuación, identifique una región dentro del gusano en la imagen del coche resonante CH que sea rica en lípidos y normalícela a la región correspondiente dentro de la imagen del coche DR normalizada.

Para que este método funcione correctamente, suponga que en las profundidades de esta región no hay glucosa deuterada. Esta es una suposición segura, ya que los lípidos son hidrofóbicos y no se mezclarán con la solución. Ahora, al restar la imagen de coche resonante CH normalizada de la imagen de coche DR normalizada, sólo la señal resonante de CD amplificada permanece de forma similar restando la imagen de coche resonante de CD normalizada de la imagen Dr.FWM normalizada.

Solo la señal resonante ch amplificada permanece aquí es el espectro ramen para un ácido oleico modificado que incluye una modificación de alcina, las fuertes resonancias CH a 2.845 centímetros inversos y la resonancia alpina a 2.121 centímetros inversos están bien aisladas de la región de la huella dactilar, que es la región de los picos densamente empaquetados, lo que los convierte en marcadores ideales para imágenes coherentes de ramen. Este es un espectro típico de señales de ramen coherentes generadas cuando tres láseres de pulso corto se superponen dentro de la muestra. Las flechas señalan los procesos responsables de cada señal, representados por diagramas de energía.

Estos son los resultados típicos de la obtención de imágenes de los gusanos de C Elgin utilizando coches y coches DR. La fila superior utilizó las tres señales que se acaban de mostrar para obtener imágenes de un gusano en una solución de glucosa disminuida. En la segunda fila, las imágenes se normalizaron adecuadamente y en la tercera fila se produjeron las imágenes de diferencia Al restar cada una de las imágenes del automóvil de la imagen del automóvil DR, acabamos de mostrarle cómo realizar imágenes de diferencia Raman basadas en microscopía antis Raman coherente doblemente resonante.

Al realizar este procedimiento, recuerde que es importante asegurarse de que las vigas estén superpuestas y sincronizadas correctamente. Además, cuando cambie entre diferentes señales coherentes, asegúrese de no golpear ni mover la muestra, ya que esto afectará el análisis. Así que eso es todo.

Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.