Diferencial de imágenes de las estructuras biológicas con doblemente resonante coherente anti-Stokes Raman Scattering (CARS)

Este video demuestra un procedimiento para realizar imágenes diferenciales de dos resonancias Raman asociadas con estructuras biológicas mediante señales de dispersión Raman coherente. Primero, tres láseres de pulsos cortos sincronizados se superponen en el tiempo y en el espacio. A continuación, los pulsos superpuestos se envían a un microscopio invertido estándar, lo que permite la generación de señales Raman coherentes a partir de objetos microscópicos.

Las señales se convierten en imágenes utilizando software comercial para comparar las diferentes señales de rayos Raman que se producen. Los resultados indican que la diferencia entre las imágenes obtenidas a partir de señales de rayos Raman doblemente y simplemente resonantes proporciona una sensibilidad mejorada para señales de rayos Raman débiles. Hola, soy Tyler Weeks del Centro de Biofotónica de la Universidad de California en Davis.

Soy Thomas ER del Centro de Biofotónica y del Departamento de Medicina Interna de la Universidad de California en Davis. Hoy les mostraremos un procedimiento para utilizar la dispersión Raman coherente anti-Stokes doblemente resonante con el fin de producir imágenes químicamente específicas de células. Utilizamos este procedimiento para detectar señales de moléculas que son demasiado débiles para ser detectadas directamente mediante espectroscopía coherente anti-Stokes Raman por sí sola.

Así que comencemos. Para generar señales de CAR y DR-CAR simultáneamente, se requieren tres fuentes láser de pulsos cortos ajustables y sincronizadas. Para obtener estos pulsos sincronizados, comience con un único láser de pulsos cortos con una potencia de salida de 10 vatios, una longitud de onda fija de 1064 nanómetros, una duración de pulso fija de siete picosegundos y una frecuencia de repetición fija de 76 megahercios.

Mediante una serie de placas de media onda y cubos divisores de haz polarizantes, el haz se divide en tres partes. Una placa de media onda combinada con un cubo divisor de haz polarizante permite ajustar la cantidad de potencia en cada componente del haz sin cambiar su dirección. Típicamente, dos haces se ajustan a aproximadamente 4,5 vatios cada uno, y el tercer haz contiene el vatio restante.

Los dos haces de alta potencia se dirigen luego a dos osciladores ópticos paramétricos independientes u OPO. Los OPO utilizan generación de frecuencias diferentes para convertir un fotón de alta energía en dos fotones de menor energía con longitudes de onda distintas. Al controlar la temperatura del cristal utilizado para lograr este efecto, se puede controlar la longitud de onda de los fotones resultantes con una precisión de 0,1 nanómetros.

Al duplicar la frecuencia de estas señales, un láser con una longitud de onda fija de 1064 nanómetros puede transformarse ahora en un haz láser que se puede sintonizar en cualquier punto entre 780 nanómetros y 910 nanómetros, al bombardear dos OPO independientes con la misma fuente de 1064 nanómetros. Se obtienen dos fuentes láser sintonizables independientemente que están automáticamente sincronizadas con nuestro láser de bombeo original. El tercer haz del láser de bombeo de 1064 nanómetros se dirige alrededor de los OPO mediante una combinación de espejos dieléctricos, de modo que los tres haces puedan combinarse nuevamente más adelante.

Para producir de forma eficiente fotones de señal de ramen coherentes, los pulsos recombinados deben superponerse tanto temporal como espacialmente, ya que los OPO contienen cavidades en anillo que permiten que cada pulso láser atraviese el cristal múltiples veces; el haz enviado a través de los OPO recorre una distancia adicional, lo que provoca un retraso considerable respecto al haz de bombeo original. Esta distancia debe compensarse con un tercer haz introduciendo espejos adicionales que obliguen a este haz a recorrer la misma distancia que los otros dos antes de que se recombinen mediante espejos dicróicos, con el fin de ajustar finamente la longitud del recorrido. Cada haz se envía a través de etapas de retardo ajustables, que permiten ajustar la superposición temporal de los diferentes pulsos láser.

Se añade otro conjunto de placas semirreflectantes y cubos divisores de haz polarizantes a cada haz para permitir el ajuste independiente de la potencia láser de cada uno. Se utilizan espejos dicróicos para combinar primero los haces provenientes de los dos OPO, y luego el haz de 1064 nanómetros; es necesario tener cuidado para asegurar que los haces estén perfectamente superpuestos en el espacio. Esto puede verificarse comparando el solapamiento de los haces a unos pocos centímetros del espejo dicróico con el de los haces a aproximadamente un metro del espejo dicróico.

Dado que la exposición a haces láser de alta potencia promedio puede dañar la muestra, los tres haces combinados se envían a través de un modulador electroóptico que funciona como un selector de impulsos, lo que permite ajustar la frecuencia de repetición de los pulsos que llegan a la muestra y, por lo tanto, la potencia promedio. Luego, los haces láser combinados se acoplan a un microscopio invertido con una lente objetiva de alta apertura numérica o na. La focalización estrecha generada por la lente objetiva de alta na permite la generación más eficiente de señales coherentes de ramen a escalas microscópicas.

El objetivo del microscopio está montado sobre una plataforma piezoeléctrica en X, Y, Z, que permite obtener imágenes mediante un escaneo en raster de los haces a través de la muestra, de forma similar a los microscopios confocales comerciales con escaneo de haces. Ahora veamos cómo generar señales CARS y D-R-F-W-M: la interacción de tres haces láser de pulsos cortos en la muestra da lugar a la generación de varias señales de mezcla de cuatro ondas, tales como CARS provenientes de las distintas combinaciones de dos láseres, así como señales CARS de tres colores y señales DR-CARS provenientes de la combinación de los tres láseres. Cuando las señales están relativamente cercanas en longitud de onda, puede ser difícil separarlas para su análisis.

Por esta razón, las señales se introducen en un espectrómetro de imágenes que también funciona como un monocromador o filtro de paso de banda, para separar espacialmente las señales a diferentes longitudes de onda. Un espejo basculante accionado electrónicamente dentro del espectrómetro, en posición baja, dirige la señal hacia una cámara CCD (dispositivo de carga acoplada) de agotamiento profundo e iluminación posterior, que proporciona información espectroscópica a lo largo de todo el rango de la señal y nos permite identificar y optimizar las distintas señales coherentes de robin para seleccionar la señal que se desea imaginar. Simplemente gire la rejilla dentro del espectrómetro utilizando el software de control y adquisición de datos suministrado por el fabricante para centrar el pico de interés en la cámara CCD.

Luego cambie la posición del espejo basculante para desviar la señal hacia un segundo puerto de salida, al cual está conectado un fotodetector de avalancha contador de fotones individuales DDE o un PD. Escanee en forma de raster el objetivo y luego utilice las señales registradas en el PD-A para generar una imagen mostrando la tasa de conteo de fotones para cada píxel con el software de adquisición de datos. Repita este procedimiento de imagen para cada señal de Raman coherente deseada de modo que las señales puedan compararse durante el procesamiento posterior.

Ahora veamos cómo preparar adecuadamente una muestra para obtener imágenes nítidas y reproducibles. Es necesario tener cierto cuidado al preparar las muestras. Por lo general, las muestras se preparan sobre cubreobjetos de vidrio de aproximadamente 150 micrones de espesor.

Estas cubreobjetos son lo suficientemente delgadas como para permitir imágenes de alta resolución con objetivos de inmersión en agua o aceite de alta NA utilizados en estos experimentos. Para demostrar la preparación de una muestra típica, preparamos secciones de aproximadamente 20 micrones de grosor de tejido muscular de ratón que se fijan a un portaobjetos. Se añade una gota de 20 microlitros de solución de glucosa deuterada cinco molar a la muestra.

La solución de glucosa deuterada proporciona una firma única y fuerte en el espectro de Raman. Se coloca un cubreobjetos de vidrio encima de la muestra y se fija con esmalte de uñas para células y cultivos. Se pueden utilizar placas de cultivo con fondo de vidrio que permiten la obturación de imágenes sin necesidad de separar las células de sus placas de crecimiento para cultivo celular.

Ahora veamos cómo determinar los picos adecuados de rayas para los automóviles del Dr. Para aprovechar adecuadamente el efecto de realce doblemente resonante, deben conocerse los espectros Raman de ambas sustancias resonantes Raman. Típicamente, estos son 2.845 centímetros inversos asociados con lípidos y 2.121 centímetros inversos para el modo de estiramiento CD asociado con la glucosa deuterada.

La dispersión Raman coherente se logra cuando la diferencia de frecuencia entre dos láseres coincide con la frecuencia de una vibración molecular. Al sintonizar un OPO a 817 nanómetros, este sondeará el modo C de 2.845 centímetros inversos al combinarse con el haz láser de 1064 nanómetros, y al sintonizar el otro OPO a 868 nanómetros, este sondeará los 2.121 centímetros inversos al combinarse con el haz de 1064 nanómetros. En el modo espectroscópico, el microscopio CARS nos permite observar tres señales Raman coherentes de interés: una señal CARS que sonda la vibración de estiramiento de CH, una señal CARS que sonda el modo de estiramiento de CD, y una señal CARS-DR que sonda ambos; en el diagrama mostrado aquí, las flechas punteadas indican fotones provenientes de los láseres en los OPOs y las flechas continuas indican la señal resultante.

Las líneas horizontales continuas indican la energía de la vibración de ramen y ofrecen una representación visual de que, en los automóviles DR, la mezcla simultánea de los mismos tres fotones de entrada sonda dos vibraciones de ramen diferentes. La intensidad de la señal de cada pico deberá optimizarse ajustando en pasos finos alrededor de estas posiciones de pico. Aquí seleccionamos cada pico y tomamos imágenes de gusanos de mar elgan en una solución de glucosa desactivada, y la extracción de información adicional basada en estas tres imágenes obtenidas individualmente requiere un procesamiento de imágenes bastante sencillo.

Primero, las imágenes deben normalizarse. Un método práctico para la normalización se basa en el hecho de que los lípidos son hidrofóbicos. Esto significa que en regiones con alta densidad de lípidos, la resonancia CD de la glucosa debería contribuir muy poco a la señal de doble resonancia.

Por el contrario, en regiones de solución de glucosa pura, las resonancias CH de los lípidos también deberían contribuir muy poco. Con esto en mente, normalice la imagen del automóvil DR y la imagen del automóvil obtenida en la resonancia CD de la solución de glucosa deuterada a una región bien fuera del gusano CL egan que no debería exhibir resonancia CH. A continuación, identifique una región dentro del gusano en la imagen del automóvil resonante CH que sea rica en lípidos y normalícela a la región correspondiente dentro de la imagen del automóvil DR normalizada.

Para que este método funcione correctamente, suponga que en lo profundo de esta región no hay glucosa deuterada presente. Esta es una suposición segura, ya que los lípidos son hidrofóbicos y no se mezclarán con la solución. Ahora, al restar la imagen normalizada de resonancia CH de la imagen normalizada de resonancia DR, solo queda la señal de resonancia CD amplificada, de manera similar a como se obtiene restando la imagen normalizada de resonancia CD de la imagen normalizada de Dr.FWM.

Solo permanece la señal resonante de CH amplificada. Aquí se muestra el espectro Raman de un ácido oleico modificado que incluye una modificación alquílica: los fuertes picos de resonancia de CH a 2.845 cm⁻¹ y la resonancia alquílica a 2.121 cm⁻¹ están ambos bien aislados de la región de huella digital, que es la zona con picos densamente empaquetados, lo que los convierte en marcadores ideales para la imagenología Raman coherente. Este es un espectro típico de señales Raman coherentes generadas cuando tres láseres de pulsos cortos se superponen dentro de la muestra. Las flechas indican los procesos responsables de cada señal, tal como se representa mediante diagramas de energía.

Estos son resultados típicos del análisis por imagen de gusanos de C. Elgin utilizando coches DR y coches. La fila superior utilizó las tres señales mostradas anteriormente para obtener imágenes de un gusano en una solución de glucosa desactivada. En la segunda fila, las imágenes se normalizaron adecuadamente y, en la tercera fila, se generaron las imágenes diferenciales restando cada imagen del coche de la imagen del coche DR. Acabamos de mostrarle cómo realizar un análisis por imagen diferencial Raman basado en microscopía coherente anti-Stokes Raman doblemente resonante.

Al realizar este procedimiento, recuerde que es importante asegurarse de que los haces estén superpuestos y sincronizados correctamente. Además, al cambiar entre diferentes señales coherentes, asegúrese de no golpear ni mover la muestra, ya que esto afectará el análisis. Eso es todo.

Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.