Quiste Toxoplasma gondii Muro de Formación en Activado médula ósea procedentes de los macrófagos y Condiciones bradizoíto
12 de agosto de 2010
Toxoplasma gondii se convierte en una forma de quiste en respuesta al estrés ambiental, que puede ser imitado en los modelos de cultivo de tejidos. Este video muestra las técnicas para examinar la formación de la pared del quiste mediante la activación de médula ósea procedentes de los macrófagos o el cambio de pH de crecimiento medio en las células de fibroblastos.
El objetivo general de este procedimiento es inducir y visualizar la formación de la pared quística en Toxoplasma gondii in vitro. Esto se logra primero cultivando macrófagos y fibroblastos.
Luego, al infectar estas células huésped, se pueden inducir respuestas al estrés en el parásito en el ojo gde mediante el choque de los fibroblastos con pH o la activación de los macrófagos, lo que conducirá a la formación de la pared del quiste. Finalmente, se añade una lectina fluorescente a los cultivos, la cual se une a la pared del quiste, de modo que los quistes pueden visualizarse mediante microscopía de inmunofluorescencia. Hola, soy Crystal Tobin del laboratorio de la Dra. Laura Noel del Departamento de Microbiología Médica e Inmunología de la Universidad de Wisconsin Madison.
Soy Angela Pollard, también del No Lab. Hoy les mostraremos un procedimiento para la formación in vitro de la pared del quiste de Toxoplasma gondii. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar las respuestas del parásito a condiciones de estrés.
Así que comencemos. Comience colocando una cubreobjetos circular de vidrio estéril en el fondo de cada pocillo de una placa de cultivo celular de 24 pocillos para inducir la conversión de Toxoplasma gondii a bradizoítos en fibroblastos humanos de prepucio bajo condiciones de pH alto y privación de dióxido de carbono. Inicie con un frasco de 150 centímetros cuadrados confluentes de fibroblastos humanos de prepucio en una cabina de cultivo celular.
Lave el frasco confluente de fibroblastos de piel prepucial humana dos veces con un XPBS y luego agregue 2.5 mililitros de tripsina-EDTA al 0,025 %. Incube el frasco a 37 grados Celsius durante cinco a 10 minutos. Después de la incubación de cinco a 10 minutos, golpee el frasco varias veces para liberar las células de la superficie del plástico.
A continuación, agregue 150 mililitros de medio HFF o medio de Eagle modificado por Delcos suplementado. Utilice el medio para enjuagar el matraz y recoger las células. Dispense un mililitro de células en cada pocillo de la placa de 24 pocillos con cubreobjetos, y permita que las células alcancen confluencia a 37 grados Celsius en 5% de dióxido de carbono.
Las células estarán entonces listas para infectar con el parásito Toxoplasma Gandhi. Bajo la campana de cultivo de tejidos, infecte un frasco de cultivo de 25 centímetros cuadrados con una capa de fibroblastos humanos de cuatro pieles confluentes con dos veces 10 a la seis parásitos e incube a 37 grados Celsius hasta que las células comiencen a lisarse. Al cabo de aproximadamente dos o tres días, utilice un raspador celular para retirar la monocapa de fibroblastos de prepucio infectados del frasco de cultivo de tejidos.
Luego, libere los parásitos de las células huésped pasando la monocapa desprendida a través de una aguja de calibre 27. Utilice un hemocitómetro para determinar el número de parásitos en el medio y, a continuación, infecte de 10 a la quinta potencia de parásitos en cada uno de los 24 pocillos de fibroblastos de prepucio humano confluentes, previamente preparados.
Incube las células durante tres horas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono para permitir que los parásitos invadan las células huésped. Proceda a inducir la conversión de los parásitos a la etapa de Brady Zeolite. Retire el DMEM de los fibroblastos humanos de prepucio infectados.
Lávelos con un XPBS y luego añada un mililitro de medio de desarrollo. Un medio basado en RPMI sin bicarbonato, ajustado a un pH de ocho. Incube las células durante tres días a 37 grados Celsius en aire ambiente.
Las células ya están listas para analizar la presencia de Brady zos. La presencia de Brady ZOS se determina utilizando la lectina marcada con fluorescencia docos mediante glutenina fluorescente o DBA, que se une a la pared asistencial de Toxoplasma Gandhi para preparar las células infectadas para la imagenología fluorescente. Enjuague los pozos tres veces con un XPBS.
A continuación, fije las monocapas celulares con 200 microlitros de formaldehído al 3% durante 20 minutos. Retire el fijador y enjuague los pocillos con un XPBS. Añada 200 microlitros de glicina 0,1 molar a los pocillos y déjelos reposar durante cinco minutos.
Elimine la glicina y enjuague los pocillos con un XPBS para bloquear y permeabilizar las células. Añada 250 microlitros de solución de bloqueo. Incube las células durante 30 minutos.
Retire la solución bloqueante y enjuague los pocillos con un XPBS. Añada 50 microlitros de una dilución uno a 250 de DBA, que ha sido conjugada con rumina, a los pocillos. Cubra la placa y agite a temperatura ambiente durante una hora en un agitador de plataforma.
Después de la incubación, elimine la DBA marcada con fluorescencia lavando las laminillas tres veces con Triton X-100 al 0,2 % en PBS 1X durante cinco minutos cada vez en un agitador orbital, y finalmente monte las laminillas utilizando medio de montaje con escudo beta que contiene dpi. La tinción T Gandhi puede visualizarse mediante un microscopio de fluorescencia con un filtro adecuado para rot dominio a un aumento de 100x. Como método alternativo para inducir la formación de Brady ZO, se pueden activar macrófagos derivados de médula ósea infectados con interferón gamma y lipopolisacárido o LPS. Para comenzar, primero prepare el medio condicionado L 9 29 para este proceso.
L 9 29 es un linaje celular de fibrosarcoma aplicado que actúa como modelo, y que segrega factor estimulante de colonias de macrófagos tras largos períodos de cofluencia. Este medio condicionado puede utilizarse para diferenciar células de médula ósea de ratón en macrófagos en cultivo celular. Para preparar el medio condicionado, cultive un frasco de 150 centímetros cuadrados de células L 9 2 9 hasta alcanzar la cofluencia a 37 grados Celsius. A continuación, incúbelas durante siete a nueve días adicionales hasta que adquieran un aspecto esférico y comiencen a desprenderse de la superficie del frasco.
Recolecte el medio y cualquier célula desprendida en un tubo de 50 mililitros y centrifugue a 420 ×g durante 10 minutos. El sobrenadante resultante es el medio condicionado; un frasco de 150 centímetros cuadrados de células L 9 29 producirá 30 mililitros de medio condicionado, que es el volumen necesario para preparar 150 mililitros de medio BMC. Recuerde preparar el DMEM para BMC con el L 9 29 cm que se utilizará para el desarrollo de BMC.
Para ver protocolos en video detallados que ilustran el método para aislar células de la médula ósea. Para el fémur de ratón, consulte los siguientes protocolos en video después de que las CMO recolectadas hayan incubado durante cinco días. En placas de Petri bacteriológicas, agregue 10 mililitros de medio para CMO, que contendrá medio condicionado de células L 9 2 9, a cada placa e incube durante dos días adicionales, tras los cuales las células estarán completamente desarrolladas.
Los macrófagos derivados de médula ósea maduros o BMS se pueden pasar durante una a dos semanas después de que hayan madurado. Para dividir los BMS, retire el medio y agregue cinco mililitros de PBS 1X frío incubado a cuatro grados Celsius durante 30 minutos hasta que las células comiencen a desprenderse. Enjuague las células de la placa con una pipeta de transferencia estéril. Recupere los BMS en un tubo cónico de 50 mililitros y haga un pellet de las células a 420 ×g durante 10 minutos.
ReSuspender el precipitado en 10 mililitros de medio BMC y luego utilizar un citómetro hemático para determinar la densidad de siembra celular. Dos veces 10 a la quinta BMC por pozo. En una placa de 24 pozos que contiene cubreobjetos redondos en el fondo, dejar que las células se adhieran durante la noche antes de infectar con T. gondii.
Pueden conservarse células excedentes en placas de Petri para su uso posterior. Para activar el BMS, prepare el medio de activación y someta el LPS a ultrasonidos en un baño de agua durante dos minutos para deshacer cualquier agregado. Luego, al medio BMC, añada 100 nanogramos por mililitro de LPS y 100 unidades por mililitro de IFN gamma.
Finalmente, retire el medio BMC de los pocillos y reemplace con uno de los medios de activación. Incube a 37 grados Celsius, 5% dióxido de carbono durante tres días. Las BMC pueden teñirse como se ha mostrado previamente con fibroblastos de prepucio.
En estos ejemplos, Toxoplasma gondii en forma de bradizoítos se etiqueta con DBA fluorescente en fibroblastos de prepucio humano. Bajo estrés de pH. La pared del quiste se etiqueta fluorescentemente como se muestra en esta sección transversal de un quiste in vitro en DMS que ha sido activado con IFN gamma y L-P-S-D-V-A.
La tinción también está presente, como se muestra aquí en la superficie de la vacuola. Acabamos de mostrarle cómo teñir in vitro Toxoplasma Gandhi, quistes en fibroblastos y macrófagos activados. Al realizar este procedimiento, es importante recordar planificar para que los parásitos y las células huésped estén listos el mismo día.
Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.
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Descripción general
Este video demuestra técnicas para inducir y visualizar la formación de la pared del quiste en Toxoplasma gondii utilizando macrófagos y fibroblastos. El estudio se centra en cómo los estrés ambientales pueden desencadenar la formación de quistes, lo cual es observable mediante microscopía de inmunofluorescencia.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Microbiología
- Inmunología
- Biología celular
Antecedentes
- Toxoplasma gondii puede formar quistes como respuesta a estrés ambiental.
- La formación de quistes puede modelarse in vitro utilizando técnicas de cultivo de tejidos.
- Los macrófagos y los fibroblastos sirven como células huésped para el parásito.
- Se utilizan lectinas fluorescentes para visualizar las paredes de los quistes.
Objetivo del estudio
- Inducir la formación de la pared quística en Toxoplasma gondii.
- Visualizar los quistes mediante microscopía de inmunofluorescencia.
- Comprender las respuestas al estrés del parásito en las células huésped.
Métodos Utilizados
- Cultivo de macrófagos derivados de médula ósea y células de fibroblastos.
- Infección de células huésped con Toxoplasma gondii.
- Inducción de respuestas de estrés mediante la alteración del pH o la activación de macrófagos.
- Aplicación de lectinas fluorescentes para visualizar las paredes del quiste.
Resultados principales
- Se indujo con éxito la formación de la pared quística in vitro.
- La microscopía fluorescente permitió una visualización clara de los quistes.
- Tanto la alteración del pH como la activación de macrófagos condujeron a la formación de quistes.
- Las técnicas demostradas pueden aplicarse a estudios posteriores sobre Toxoplasma gondii.
Conclusiones
- El estudio proporciona un método confiable para inducir y visualizar quistes.
- Comprender la formación de quistes puede contribuir al estudio de la biología de Toxoplasma gondii.
- Estas técnicas pueden ser útiles para investigaciones futuras sobre interacciones huésped-parásito.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite la desactivación mecanicista de la conversión en bradizoítos de Toxoplasma gondii, un paso clave para comprender la infección crónica y el riesgo de reactivación. Al modelar la formación de quistes inducida por estrés in vitro, los investigadores pueden evaluar los efectos de compuestos sobre las vías de persistencia del parásito. El enfoque apoya la validación de dianas y el cribado fenotípico en las primeras etapas del descubrimiento de intervenciones antiparasitarias.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Examina hipótesis terapéuticas en torno a las vías de respuesta al estrés del parásito que regulan la diferenciación de taquizoítos a bradizoítos.
- Valor operativo: Proporciona un sistema reproducible para validar funcionalmente dianas implicadas en la formación de la pared del quiste y la persistencia del parásito.
Desarrollo de pruebas y cribado
- Valor científico: Genera formas de bradizoítos relevantes para la enfermedad con marcadores cuantificables de la pared del quiste para disponibilidad del ensayo.
- Valor operativo: Permite la selección estandarizada basada en lecturas fluorescentes de compuestos que inhiben o inducen la formación de quistes bajo condiciones controladas de pH o activación inmune.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Apoya el desarrollo de modelos preclínicos al vincular la formación de quistes in vitro con fenotipos de infección crónica relevantes para el tropismo en tejidos neuropáticos y musculares.
- Valor operativo: Facilita la evaluación alineada con biomarcadores de la carga de quistes como un indicador traslacional de la eficacia de fármacos en modelos de persistencia.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en flujos de trabajo de descubrimiento temprano hasta la identificación de compuestos líderes, proporcionando una plataforma de cribado fenotípico para compuestos que tienen como diana la conversión de etapas del parásito.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la prueba de hipótesis sobre vías de señalización del estrés en parásitos y la desactivación biológica de mecanismos de persistencia.
- Tamizaje: Proporciona estandarización de ensayos y salidas cuantitativas de fluorescencia para la evaluación confiable de compuestos en formatos de 24 pocillos.
- Analítica: Permite la medición de la formación de la pared del quiste como variable dependiente para comparar condiciones de estrés o tratamientos con compuestos.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica mediante la modelización de la formación de bradizoítos observada en tejidos del SNC y musculares.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para estudiar la conversión de estadios en parásitos apicomplejos en múltiples tipos de células huésped.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en el direccionamiento de las vías de diferenciación del parásito, reduciendo la ambigüedad mecanicista en modelos de infección crónica.
- Valor operativo: La estandarización de la inducción y visualización de quistes en sistemas de fibroblastos y macrófagos mejora la reproducibilidad.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de continuar o descartar compuestos al identificar aquellos que modulan la formación de bradizoítos, reduciendo el riesgo biológico en etapas avanzadas de los programas antiparasitarios.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos basada en sus efectos sobre la formación de la pared del quiste como biomarcador de persistencia.
Consideraciones de Implementación
- Se requiere experiencia en cultivo de parásitos, mantenimiento de células hospedadoras y microscopía de inmunofluorescencia.
- Es esencial el acceso a microscopía de fluorescencia con juegos de filtros adecuados para la detección de rodamina.
- La estandarización de los protocolos de activación con IFNγ y LPS garantiza la consistencia en experimentos basados en macrófagos.
- La adaptación a diferentes líneas celulares hospedadoras requiere la validación de la permeabilidad de la pared del quiste y la accesibilidad de lectinas.
- El control ambiental de los niveles de CO2 y del pH es fundamental para una inducción reproducible en sistemas de fibroblastos.
