Silenciamiento génico in vitro basado en transfección inversa de siRNA: un procedimiento para administrar pequeño ARN interferente en células cultivadas para inactivar la expresión génica diana

Para la transfección inversa de ARN interferente pequeño, o siRNA, una clase de ARN bicatenario, en adipocitos no adherentes o células grasas, prepare una suspensión de siRNA dirigida a un gen codificante de proteínas específico en los adipocitos. Añadir un reactivo de transfección a base de lípidos catiónicos adecuado. Incubar la mezcla para formar complejos de transfección a través de interacciones electrostáticas.

Transfiera la mezcla a pocillos recubiertos de colágeno de una placa de pocillos múltiples. Los complejos de transfección se inmovilizan en el recubrimiento de la placa mediante interacciones inespecíficas. Pipetear una suspensión de adipocitos en pocillos que contienen complejos de transfección inmovilizados. Los adipocitos se adhieren libremente al recubrimiento de la placa, lo que aumenta el contacto físico entre las células y los complejos.

El complejo de transfección se fusiona con la membrana celular y entrega el siRNA al citoplasma. El siRNA, que comprende una hebra antisentido con una secuencia complementaria al ARNm diana y una hebra sense, es reconocido por el complejo silenciador inductor de ARN multiproteico, o RISC. El siRNA se une al RISC y las hebras se separan, y la hebra antisentido permanece unida al complejo.

El complejo siRNA-RISC activado reconoce y se une a los sitios complementarios del ARNm diana. Esto conduce a la escisión específica de la secuencia del ARNm por la proteína argonauta del complejo RISC. El ARNm escindido es degradado aún más por la maquinaria celular, silenciando así la expresión génica diana.