Name: En el útero de electroporación seguido por cultivos neuronales primarias para estudiar la función génica en el subconjunto de neuronas corticales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-08T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Aprende electroporación in utero para estudiar la función génica en neuronas corticales de embriones de rata. Este método permite analizar el crecimiento y ramificación de neuritas con alta especificidad celular.

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Los autores desean agradecer a José LoTurco y Dennis Selkoe útil para los debates sobre esta técnica. Los autores agradecen a los donantes de la Fundación de Asistencia para la Salud de América, para el apoyo de esta investigación.

El protocolo básico para la electroporación en el útero ha sido descrito en detalle en otro artículo Jove de laboratorio Kriegstein 1, 2. Esta técnica fue descrita originalmente en el 3 Osumi de laboratorio y el protocolo se basa en la desarrollada en el laboratorio LoTurco 4. Vamos a ofrecer una visión general del nuestro protocolo de electroporación en el útero de embriones de rata, centrándose en los detalles más importantes, seguido de una descripción de nuestro protocolo que se aplica en la electroporación in utero al estudio de la función de genes en consecuencia el proceso neuronal. 1. En electroporación in utero <ol><li> Preparación de las agujas del ADN y de carga El primer paso en el electroporations útero es el diseño de su experimento para determinar qué construcciones de ADN que desee inyectar. Este método es útil tanto para misexpressing o derribar los genes de interés. Si usted está planeando en misexpressing o sobreexpresión de un gen, asegúrese de usar un promotor que se activa en las células precursoras neuronales. Recomendamos el promotor CAGGS, que consiste en el pollo beta-actina promotor y potenciador de CMV 5. Ya que sólo un pequeño subconjunto de las células se transfectaron usando electroporación en el útero, es importante incluir un plásmido que codifica una proteína fluorescente GFP, como para que pueda seguir las células que se electroporated con éxito. Para el plásmido que codifica GFP, se recomienda preparar el ADN a una concentración de 0,5 microgramos por microlitro. Para las construcciones shRNA, hemos encontrado que 0,5-1,0 mg por l de resultados eficientes derribar de su gen de interés. Para la sobreexpresión o misexpression, se utiliza entre 1,0 y 3,0 microgramos por microlitro, dependiendo del tamaño del gen y el nivel de expresión de que el experimento requiere. ADN se preparan utilizando una Qiagen libre de endotoxinas kit de preparación, y se diluye en 1 x PBS. Se inyecta aproximadamente 0,5-1,0 l por el cerebro embrionario, por lo que, por una camada de animales que preparar 10 l de mezcla de ADN para la inyección. Añadimos una L de Fast Green en el ADN para que podamos seguir el ADN inyectado. Tirar las agujas de la forma correcta es un paso crítico. Walantus et al. Utiliza un sistema diferente para la entrega de los ADN y por lo que su preparación para la aguja es 1,2 entonces nuestra ligeramente diferente. La configuración que se utiliza para tirar de las agujas dependerá de la marca de la aguja de extractor que usted tiene. Utilizamos el modelo 750 de David Kopf. La configuración que utilizamos son: Heat 1: 9,0, Heat 2: 0, Soleniod: 0, el tamaño de filamento de 3,0 mm, proximidad del calentador: 3 mm, Tiempo: 10 seg. Una vez que sacó, nos cortamos las agujas con una hoja de afeitar en un ángulo de ~ 45 grados de tal manera que la distancia de la mayor parte de la apertura a la punta es de 11 mm. A continuación, cargar el ADN de la parte de atrás de la aguja. A continuación, llenar el espacio que queda en la aguja con el aceite de maíz. Para la inyección de ADN, se utiliza un Picospritzer III. Dependiendo del bisel exacto en que se corta para cada aguja, se establece el Picospritzer 4,0 a 6,0. Nosotros usamos un pedal de pie para entregar el aire comprimido que expulsa el ADN de la aguja. </li><li> La preparación de animales para la cirugía Usamos libres de patógenos ratas Sprague Dawley, exclusivamente para estas operaciones. Varios otros laboratorios utilizan ratones de diferentes genotipos también. A continuación, describimos mostrar nuestro protocolo de electroporación de embriones de rata E15, pero en el útero de la electroporación se realiza rutinariamente en las ratas entre las edades de E13 y E18. Mientras que las primeras etapas de la electroporación objetivos capas profundas de la corteza, más tarde electroporations fase de destino capas más superficiales. Los animales se les administró una dosis preoperatoria de la buprenorfina (0.05 a 0.1 mg / kg) antes de la cirugía se inicia. Hay múltiples opciones para anestesiar al animal. Walantus et al. Isofuorane utiliza la inhalación, mientras que nosotros usamos la inyección intraperitoneal de ketamina (40-80 mg / kg) y xilazina (5-10 mg / kg) 1,2. Una pizca pies siempre deben ser efectuados para garantizar que los animales son completamente anestesiados y no responde. Los animales se mantienen en un cojín de calefacción durante todo el procedimiento quirúrgico. El pelaje del animal se afeita en la región de la incisión, y se lavan tres veces con etanol seguido por tres veces con el yodo. Se hace una incisión en la piel, justo lateral a la línea media, seguido por una incisión en el músculo. Los cuernos uterinos están expuestos con mucho cuidado. Son suavemente extraer de la cavidad del cuerpo con los dedos. Manténgase hidratado embriones con PBS estéril mientras están fuera de la cavidad del cuerpo. </li><li> ADN por vía intravenosa y la electroporación Al empezar la realización de estas cirugías, la parte más difícil es familiarizarse con el lugar donde tiene que inyectar el ADN de manera que usted llena los ventrículos laterales, y acostumbrarse a la profundidad que se inyecte la aguja con el fin de golpear la región correcta. Los embriones son manipulados con cuidado con los dedos para que pueda identify donde está la cabeza, y si te fijas bien podrás ver la sutura línea media. Esto sirve como un punto de referencia general que puede utilizar para determinar dónde está el ventrículo lateral se encuentra. Se inyecta el ADN a través de la pared uterina y en el ventrículo lateral. Nosotros usamos un pedal para controlar la inyección del ADN - múltiples pulsos de ADN se realizan hasta el ventrículo lateral se llena con el ADN / mezcla de colorantes. A continuación, colocar los electrodos remo a cada lado de la cabeza del embrión y el uso de otro pedal para entregar el pulso en la cabeza del embrión. La colocación de los electrodos es fundamental para determinar a qué región de la corteza es electroporación. Dado que el ADN está cargado negativamente, el ADN se desplazará hacia el electrodo positivo cuando una carga se disipa a través de las paletas. Dependiendo de la ubicación exacta de los electrodos, los diferentes subconjuntos de células se destinará. En forma rutinaria colocar el electrodo positivo cerca de las posiciones dorsal-medial a través del cerebro. Sin embargo, el laboratorio LoTurco maravillosamente demostró que si se colocan los electrodos en las regiones más ventral lateral del cerebro puede dirigirse a las células de las células de la corteza-estriado límite y éxito de la corriente lateral cortical 6. Cada embrión puede ser electroporación, y diferentes combinaciones de construcciones de ADN se pueden utilizar en cada embrión. </li><li> Sutura y el cuidado post-operatorio Después de la electroporación de todos los embriones, los cuernos uterinos son cuidadosamente dentro de la cavidad del cuerpo, y tanto la capa muscular y la piel se suturan. La técnica para esto es descrito en Walantus et al 1,2. Los animales son controlados continuamente hasta que se recupere de la anestesia y el analgésico buprenorfina (0,05 a 0,1 mg / kg) se administra cada 8-12 horas. </li></ol> 2. Cultivo electroporated neuronas corticales <ol><li> La recolección y la disección de los cerebros de electroporación región electroporated Para los análisis in vivo después de la electroporación en el útero, los animales pueden ser cosechadas en cualquier punto de tiempo de 24 horas después de la electroporación a poco después de nacer a la edad adulta. Sin embargo, cuando las neuronas de cultivo primario que cosecha 24 horas después de la electroporación en E16. En este momento, los embriones electroporated expresan niveles detectables de BPA. Los animales son sacrificados con inhalación de dióxido de carbono y la decapitación rápida. Los embriones son diseccionados en el útero y se coloca en HBSS con cationes bivalentes, no perder de vista que los embriones fueron electroporated con la que los plásmidos de ADN. Es muy importante utilizar HBSS filtrado, tubos estériles y platos y herramientas en autoclave para la disección. Las cortezas son diseccionados y las meninges retirado usando un microscopio en una campana. Estas cortezas continuación se observan en un microscopio con la capacidad de visualizar las buenas prácticas agrarias. GFP positivos regiones de la corteza se identifican, y ue un par de tijeras para cortar Vanna las regiones GFP positivos de la corteza. Estas piezas se colocan en HBSS sin cationes bivalentes en un tubo cónico de 15 ml. </li><li> Disociación y las planchas de las neuronas Una vez que todas las regiones GFP positivos son disecados, HBSS se sustituye con tripsina 0,25% y se incubaron a 37 grados durante 5 minutos. Tripsina se elimina, sustituido por los medios de comunicación de chapado (DMEM + 5% de SFB + Penn / estreptomicina glutamina +), y se trituró 5-7 veces a disociar las células. Volúmenes utilizados dependen de la cantidad presente de los tejidos. Las células disociadas se está chapada en CC2 cámara de diapositivas recubiertos. Durante dos portaobjetos de cámara, que la placa de 200,000-350,000 células por la cámara en un volumen de 1,5 ml de los medios de recubrimiento. Después de 4 horas, los medios de recubrimiento se aspira y se sustituye con 1,5 ml de medio de cultivo neuronal (Neurobasal los medios de comunicación + B27 + suplemento glutamax + gentamicina) por cámara. </li></ol> 3. Analizar consecuencia del proceso neuronal <ol><li> Fijación y tinción culturas A fin de medir a corto plazo effecs de la manipulación genética de estas células, las neuronas de la cosecha principal, después de tres días in vitro. Si las neuronas primarias se cultivaron más tiempo para análisis adicionales, la mitad de los medios de comunicación debe ser reemplazado cada tres días. Para la fijación de las culturas, que aspiran los medios de comunicación de las cámaras y la solución de las neuronas en el 4% paraformaldhyde durante 15 minutos. Después de la fijación, se lavan las células dos veces en PBS y luego poner en solución de bloqueo (2% de suero de burro con 0,1% Triton X-100 en PBS) durante una hora. Células se incubaron en anticuerpo primario durante 1 hora. Para el análisis de un proceso neuronal consecuencia, utilizamos anticuerpos anti-beta tubululin para identificar las neuronas - beta tubulina inmunotinción II etiquetas neruonal célula del cuerpo, las dendritas y los axones. Las células se lavan tres veces en PBS durante cinco minutos, y luego incubadas en Cy3 anti-ratón durante 1 hora, seguido por otros tres lavados con PBS, contratinción núcleos con DAPI y montaje. </li><li> Medición de neurite longitud Imágenes de la GFP positivas las neuronas, la tubulina beta-III positivo se adquieren en un Axioskop Zeiss con un sistema de cámara MC100. Varias variables puede ser examinada en estas células GFP positivos, incluida la duración de todas las neuritas, la longitud de las más largas neuritas, la ramificación de las neuritas, el tamaño del soma celular, etc Hemos utilizado este método para analizar el proceso neuronal a consecuencia derribar o sobreexpresión de genes relacionados con el neurodesarrollo y la neurodegeneración, con un enfoque en la longitud proceso neuronal. A fin de medir consecuencia los procesos neuronales, usamos Axiovision LE 4.4 del software (de Zeiss). Dentro de este software, hay una opción para seleccionar el "perfil" de la herramienta. Con esta herramienta, usted puede usar el ratón del ordenador para rastrear la longitud de cada proceso neuronal. Es fundamental definir el objetivo que está utilizando con el fin de obtener una medida exacta de sus neuritas. Para estos análisis, que suelen utilizar un objetivo de 20x. </li></ol> 4. Resultados representante Hemos encontrado que Sprague Dawley tamaño de la camada oscila entre 6 y 14 embriones. Por lo general, electroporar todos los embriones. Cada embrión puede ser electroporación con una combinación diferente de AND. Sin embargo, por lo general electroporar por lo menos cuatro cerebros con la misma condición y la piscina antes de disociar estos cerebros y de las planchas. Hemos encontrado que con esta técnica un 75% de los cerebros de electroporación se dirigen a la región deseada de la corteza, ya sea corteza dorsal lateral medial o ventral (Figura 1). Además, hemos encontrado electroporations temprano en E13-14 neuronas profunda capa de destino, tales como la capa de neuronas positivas Tbr1 VI, mientras que más tarde electroporations objetivo positivo Ctip2, TBR1 células negativas V capa, y más tarde objetivo electroporations Brn2 positivo capa II / III células. Una excelente descripción de los diferentes marcadores y la explicación de la especificación de subtipo neuronal en la corteza de encontrar un artículo de Moleneaux et al 7. La figura 2 muestra las secciones coronal del cerebro de electroporación, ya sea en el día embrionario 15.5 o 17.5 y cosechadas en el día postnatal 5. Muestra en rojo es la inmunotinción para Oct6. Puede inmunotinción para marcadores de la cultura para confirmar lo que las poblaciones de células de capa que está orientado. Hemos encontrado que se puede esperar a centrarse en la población de células misma capa de células en cada embrión de la misma camada (en otras palabras, la selección depende del punto de tiempo en lugar de embriones en otras variantes técnicas). En la cultura, el porcentaje de células que son positivas las buenas prácticas agrarias pueden variar ampliamente dependiendo de lo conservadora que es cuando la disección de la región GFP positivos (Figura 3). Sin embargo, incluso cuando son muy conservadores y diseccionar sólo el parche GFP positivos de las células, el porcentaje más alto que se observa es del 5-10% - a pesar de que son la disección de la región de la corteza que se electroporación, las células en una sola capa ser atacados. Este effciency transfección de baja es de gran ayuda en la identificación de los procesos de pertenecer a la célula electoporated que se está analizando. Las células de placas en esta densidad superior contribuye a que heathier culturas, sin embargo, es difícil discernir qué proceso pertenece a cada cuerpo celular en las células GFP negativas (Figura 3). Si tiene problemas para ver todos los procesos finos de las células por electroporación, puede aumentar la concentración de ADN que son las buenas prácticas agrarias electroporating para aumentar la expresión de la GFP, o puede inmunotinción de las células disociadas utilizando un anticuerpo anti-GFP (de Invitrogen ) junto con un anticuerpo Cy2 secundaria. <img src="/files/ftp_upload/2103/2103fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. E15.5 ratas Sprague-Dawley fueron electroporated con el plásmido GFP y se cosecha tres días después. Sobre la base de la colocación de los electrodos, las diferentes regiones de la corteza se destinará. AF muestran la fluorescencia de GFP en el cerebro de todo. <img src="/files/ftp_upload/2103/2103fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. E15.5 (A) o E17.5 (B) ratas Sprague-Dawley fueron electroporación con el plásmido GFP y la cosecha en el día postnatal 5. Los cerebros fueron fijados, seccionados coronalmente con una vibratome (100 secciones micras), y immunostained para Oct6 (rojo). A y B muestran imágenes de confocal de las secciones de inmuno-. <img src="/files/ftp_upload/2103/2103fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. E15.5 ratas Sprague-Dawley fueron electroporated con el plásmido GFP. 24 horas después de la electroporación, los cerebros fueron cosechadas y las buenas prácticas agrarias-positivas, las regiones electroporación fueron disecados y disociar, como se describe en el vídeo. Después de 3 días in vitro, las células fueron fijadas y immunostained para BIII-tubulina (rojo) y la tinción de los núcleos con DAPI (azul) (A, C). La longitud de las más largas neuritas se midió utilizando Axiovision software(B, D).

<ol><li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E16+rat+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70 (4-5), 155-1562 (2002).</li>
<li>Bai, J., Ramos, R. L., Ackman, J. B., Thomas, A. M., Lee, R. V., LoTurco, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+reveals+doublecortin+is+required+for+radial+migration+in+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex.</a> Nat Neurosci. , 1277-1283 (2003).</li>
<li>Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cells+in+the+developing+nervous+system+with+retrovirus+expressing+modified+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein.</a> Exp Neurol. 156 (2), 394-406 (1999).</li>
<li>Bai, J., Ramos, R. L., Paramasivam, M., Siddiqi, F., Ackman, J. B., LoTurco, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+DCX+and+LIS1+in+migration+through+the+lateral+cortical+stream+of+developing+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of DCX and LIS1 in migration through the lateral cortical stream of developing forebrain.</a> Dev Neurosci. , 144-156 (2008).</li>
<li>Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+subtype+specification+in+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal subtype specification in the cerebral cortex.</a> Nat Rev Neurosci. , 427-437 (2007).</li>
<li>Young-Pearse, T. L., Bai, J., Chang, R., Zheng, J. B., Loturco, J. J., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Critical+Function+for+-Amyloid+Precursor+Protein+in+Neuronal+Migration+Revealed+by+In+Utero+RNA+Interference%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Critical Function for -Amyloid Precursor Protein in Neuronal Migration Revealed by In Utero RNA Interference.</a> J Neurosci. 27, 14459-14469 (2007).</li>
<li>Young-Pearse, T. L., Chen, A. C., Chang, R., Marquez, C., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+APP+regulates+the+function+of+full-length+APP+in+neurite+outgrowth+through+interaction+with+integrin+beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Develop%22%5BJournal%5D)">Secreted APP regulates the function of full-length APP in neurite outgrowth through interaction with integrin beta1.</a> Neural Develop. 3, 15-15 (2008).</li>
</ol>

En el estudio in vitro de cultivos neuronales primarios permiten análisis cuantitativos de crecimiento de las neuritas. Con el fin de estudiar cómo las alteraciones genéticas afectan a consecuencia proceso neuronal, las construcciones del shRNA o misexpression se pueden introducir en las neuronas primarias a través de la transfección químicos o transducción viral. Sin embargo, con células de la corteza primaria, un grupo heterogéneo de tipos de células (neuronas glutamatérgicas de diferentes capas, las...

<table><tbody><tr><td>10X Hanks&amp;rsquo; Solución salina equilibrada (HBSS) (Ca&lt;sup&gt;+2&lt;/sup&gt; /Mg &lt;sup&gt;+2&lt;/sup&gt; libre</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>10X Hanks&amp;rsquo; Solución salina equilibrada (HBSS) (con Ca&lt;sup&gt;+2&lt;/sup&gt; /Mg &lt;sup&gt;+2&lt;/sup&gt; )</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M, pH 7,4</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de 100 x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de 60 x 15 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>vial cónico de 15 mL</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>62-547-205</td><td></td></tr><tr><td>Vial cónico de 50 mL</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>62-554-205</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras </td><td>Fine Science Tools</td><td>91402-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas estándar</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas curvas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11273-20</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas finas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de Vannas </td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>.25% Tripsina-EDTA</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitómetro Reichert Bright-Line</td><td>Hausser Scientific</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Contador manual</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z169021</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;Medio de Eagle modificado (D-MEM)</td><td>GIBCO, de Life Technologies</td><td>11960-051</td><td></td></tr><tr><td>Suero bovino fetal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estrepomicina</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>GIBCO, de Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Medio NEUROBASAL </td><td>GIBCO, de Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento libre de suero B-27 </td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento GlutaMAX-I</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Solución de reactivo de gentamicina </td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Suero de asno</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo contra beta-III tubulina</td><td>Chemicon International</td><td>MAB1637</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo anti-MAP2</td><td>Chemicon International</td><td>AB15452</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-ratón Cy3 de burro</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-166-151</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-polin de cebú Cy2 de burro</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-226-155</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>GIBCO, de Life Technologies</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Diapositivas con recubrimiento de CC2 y dos cámaras </td><td>Lab-Tek</td><td>154852</td><td></td></tr><tr><td>Medios de montaje fluorescentes</td><td>KPL Inc</td><td>71-00-16</td><td></td></tr><tr><td>Cubos de microscopía de 24 x 60 mm</td><td>VWR international</td><td>48393-106</td><td></td></tr><tr><td>Esmalte de uñas transparente</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Henry Schein</td><td>995-2949</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>Henry Schein</td><td>4015809TV</td><td></td></tr><tr><td>buprenorfina</td><td>Henry Schein</td><td>1118217</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electroporador de onda cuadrada BTX</td><td>Fisher Scientific</td><td>BTXECM830</td><td></td></tr><tr><td>Tweezertrodos, 7 mm, platino</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450488</td><td></td></tr></tbody></table>

en el útero de electroporación seguido por cultivos neuronales primarias para estudiar la función génica en el subconjunto de neuronas corticales

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

Estudio in vitro de cultivos primarios de neuronas permite un análisis cuantitativo de crecimiento de las neuritas. Con el fin de estudiar cómo las alteraciones genéticas afectan a consecuencia proceso neuronal, shRNA o construcciones de ADNc se pueden introducir en las neuronas primarias a través de la transfección químicos o transducción viral. Sin embargo, con células de la corteza primaria, un grupo heterogéneo de tipos de células (neuronas glutamatérgicas de diferentes capas, las neuronas inhibidoras, las células gliales) se transfectaron usando estos métodos. El uso de la electroporación en el útero para introducir construcciones de ADN en la corteza roedores embrionarias permite ciertos subconjuntos de células para ser específicos: mientras que la electroporación de los primeros objetivos de embriones corteza capas profundas de la corteza, la electroporación a finales de los puntos de tiempo embrionarias objetivos de las capas más superficiales. Además, la colocación de electrodos diferenciales a través de las cabezas de los resultados de embriones individuales en la focalización de las regiones dorsal-ventral medial frente al lateral de la corteza. Después de la electroporación, las células transfectadas se disecaron, disociados, y se colocaron in vitro para el análisis cuantitativo de crecimiento de las neuritas. Aquí, ofrecemos un método paso a paso para medir cuantitativamente consecuencia proceso neuronal en los subconjuntos de células corticales. El protocolo básico para la electroporación en el útero ha sido descrito en detalle en dos artículos JoVe otros del laboratorio Kriegstein 1, 2. Vamos a ofrecer una visión general de nuestro protocolo de electroporación en el útero, se centra en los detalles más importantes, seguido de una descripción de nuestro protocolo que se aplica en la electroporación in utero al estudio de la función de genes en consecuencia el proceso neuronal.

En la electroporación in utero es un método valioso para la transfección de células progenitoras neuronales in vivo. Dependiendo de la colocación de los electrodos y el punto de tiempo en el desarrollo de la electroporación, ciertos subconjuntos de células corticales pueden ser atacadas. Células afectadas puede ser analizada en vivo o in vitro para los efectos de la alteración genética.

En el útero de electroporación seguido por cultivos neuronales primarias para estudiar la función génica en el subconjunto de neuronas corticales

El estudio in vitro de cultivos neuronales primarios permite realizar análisis cuantitativos del crecimiento neurítico. Con el fin de estudiar cómo las alteraciones genéticas afectan...

El objetivo general del siguiente experimento es examinar los efectos del desarrollo tras la reducción o sobreexpresión de genes en subconjuntos específicos de células progenitoras neuronales en la neocorteza. Esto se logra mediante la electroforesis in vivo de ADN en embriones de rata para transfectar células progenitoras neocorticales. Como segundo paso, se disecciona la región electroforizada con el fin de enriquecer las células transfectadas.A continuación, estas células se disocian y se siembran en cámaras portaobjeto y se cultivan. Con el fin de examinar los efectos de la alteración genética intrínseca y la aplicación de factores exógenos, se obtuvieron resultados que muestran efectos sobre el crecimiento y la ramificación de neuritas, basados en mediciones cuantitativas mediante software avision. La principal ventaja de esta técnica frente a otras, como la transfección basada en lípidos de cultivos neuronales primarios, es que podemos dirigirnos a subpoblaciones específicas de células progenitoras neuronales.Por ejemplo, solo se transfectarán neuronas glutamatérgicas utilizando este método. Además, podemos realizar la electroforesis en etapas embrionarias tempranas y dirigir

in-utero-electroporation-followed-primary-neuronal-culture-for

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

En la inyección intraventricular Utero y electroporación de embriones de ratón E15

Este protocolo describe los pasos necesarios para analizar, a través de la electroporación y transfectar neuronas del hipocampo del ratón y la cultura cortical. Corto plazo, las culturas pueden ser utilizados para los estudios del axón y la orientación, mientras que a largo plazo las culturas pueden ser utilizados para estudios de la sinaptogénesis y el análisis espina dendrítica.

Nucleofection y cultivos primarios de neuronas del hipocampo de embriones de ratón y corticales

En el útero de la electroporación permite la entrega rápida de genes en un espacio-temporal y controlado de manera en el desarrollo del sistema nervioso central (SNC). Aquí se describe una muy adaptable en el protocolo de electroporación in utero que puede ser utilizado para entregar las construcciones de expresión en múltiples dominios del SNC embrionario, incluyendo el telencéfalo, diencéfalo y la retina.

Entrega génica eficaz en los territorios del SNC múltiples utilizando In Utero La electroporación

Un método de transferencia de genes en el cerebro del ratón en desarrollo se describe mediante el uso de un método único quirúrgica y la forma especial de los electrodos. Esta técnica única permite la transfección de ADN de plásmido temporal y espacialmente, lo que ayudará a muchos neurocientíficos en el estudio de desarrollo del cerebro.

Del ratón en el útero de electroporación: Transefection controlada Gene espacio-temporal

Para llevar a cabo una evaluación rápida de la función de los genes en el desarrollo de la corteza cerebral, se describen procedimientos que implican...

Métodos de estudio de la morfogénesis neuronal:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi electroporación en la corteza cerebral embrionario murino

Este protocolo describe un procedimiento de explante mejorada que...

Ex utero electroporación y explantes enteros hemisferio: un método simple Experimental de Estudios del Desarrollo Cortical Temprana

Este procedimiento muestra cómo dirigirse a las interneuronas en el prosencéfalo del ratón en desarrollo mediante electroporación en el útero. Esta técnica fue particularmente eficiente para lograr la expresión génica selectiva en subtipos de interneuronas destinadas a las capas superficiales de la corteza.

-Subtipo selectivo electroporación de interneuronas corticales

Este manuscrito ofrece protocolos que utilizan en el útero de electroporación (IUE) para describir la conectividad estructural de las neuronas en el nivel de una sola célula y la excitabilidad de las neuronas marcadas con fluorescencia. Histología se utiliza para caracterizar dendríticas y proyecciones axonales. células enteras de grabación en rodajas agudas se utiliza para investigar la excitabilidad.

La electroporación en el útero métodos para estudiar la excitabilidad de las subpoblaciones neuronales y Conectividad Una sola célula

Aquí, nos proporcionan un método confiable y de bajo costo para generar culturas de electroporated cerebro organotypic rebanada de embriones de ratón adecuados para microscopía confocal y técnicas de imagen en vivo.

Ex útero Electroporación y culturas Organotypic rebanada de cerebros embrionarios de ratón para vivir-la proyección de imagen de interneuronas GABAérgicas de migrando

La electroporación doble en el útero permite apuntar a las poblaciones celulares que están separadas espacial y temporalmente. Esta técnica es útil para visualizar las interacciones entre las poblaciones celulares que utilizan proteínas fluorescentes en condiciones normales, pero también después de experimentos funcionales para perturbar los genes de interés.

Doble en electroporación de utero para apuntar a poblaciones celulares separadas temporal y espacialmente

Aprende electroporación in utero para estudiar la función génica en neuronas corticales de embriones de rata. Este método permite analizar el crecimiento y ramificación de neuritas con alta especificidad celular.

En el útero de electroporación seguido por cultivos neuronales primarias para estudiar la función génica en el subconjunto de neuronas corticales (Video) | JoVE Journal

En el útero de electroporación seguido por cultivos neuronales primarias para estudiar la función génica en el subconjunto de neuronas corticales

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