Grabaciones de patch clamp de neuronas de ratón de retina en una rebanada preparación adaptada a la oscuridad

Nuestra experiencia visual comienza cuando el pigmento visual de los fotorreceptores de nuestra retina absorbe fotones de energía luminosa, lo que en última instancia conduce al cierre de los canales de nucleótidos cíclicos en la membrana celular. Esto suprime la liberación del neurotransmisor glutamato tanto de los bastones como de los conos. El glutamato liberado es detectado por las células de la retina aguas abajo para estudiar las señales aguas abajo.

Se extraen los ojos de un ratón sacrificado. Los S se aíslan, se incrustan en un bloque de agar y se cortan con un micrótomo vibratorio. A continuación, los cortes de retina se colocan bajo un microscopio y se estimulan con iluminación LED.

Mientras que los registros de pinza de parche se toman para medir las corrientes sinápticas o potenciales generados. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a las complejidades añadidas de trabajar en la oscuridad. Por lo tanto, ser capaz de visualizar todo el proceso proporcionará una sensación que de otro modo sería difícil de describir.

Comience este procedimiento recubriendo los electrodos de alambre de registro y referencia que se utilizarán con una capa de cloruro de plata. Sumerja los electrodos en cloruro de sodio molar. Luego, usando una fuente de alimentación de 15 voltios con una onda sinusoidal de un hercio, impulse 15 voltios entre ellos durante unos 20 segundos.

Con un microextractor de pipetas, prepare pipetas de parche a partir de vidrio de sílice BO pulido al fuego, eligiendo una resistencia de la punta de la pipeta basada en el tamaño de las células objetivo para cuerpos celulares de aproximadamente 20 micras de diámetro. Utilice una tubería PET con una resistencia de punta de cinco a 10 mega ohmios para cuerpos celulares. Después de aproximadamente cinco micras de diámetro, use una resistencia de punta de 12 a 15 mega ohmios.

Para preparar los electrodos de referencia a tierra, utilice una jeringa para llenar el tubo de polietileno con una solución de agar al 3,5% preparada en cloruro de sodio milimolar. A continuación, prepare las siguientes soluciones de acuerdo con las instrucciones del protocolo escrito adjunto. Solución de baño externo, solución de corte, solución interna de pipeta de aspartato de potasio y el tope de agar.

Almacene todas las soluciones a cuatro grados centígrados hasta que las necesite. El día del experimento, Thor administró alrededor de 1,5 mililitros de solución interna de aspartato de potasio. A continuación, añada flúor diluido.

Vierta unos 50 mililitros de medios que contengan bicarbonato de sodio en el recipiente de almacenamiento hermético y ligero. Conecte el tubo de plástico a un tanque de gas que contenga 5% de dióxido de carbono y 95% de oxígeno para equilibrar los medios de objetivos con el gas, y luego coloque el recipiente en un baño de agua de 30 a 32 grados Celsius. A continuación, llene una botella con 110 mililitros de puntas, medio que contenga guisantes y colóquela sobre hielo.

Iguale el medio burbujeando la solución con gas oxígeno al 100%. Coloque el medio aimes restante que contiene bicarbonato de sodio en un depósito calentado encima de la jaula de Faraday. Envuelva el paraform alrededor del tubo y la tapa de la botella para atrapar el gas en el espacio sobre la solución y equilibre con 5% de dióxido de carbono y 95% de gas oxígeno.

Usando un tubo de dispersión de aire de vidrio, prepare aros a baja temperatura de gelificación al 3% agregando 0,75 gramos a 25 mililitros de medio de puntas con mucho calor. La solución es de unos 115 grados centígrados mientras se revuelve. Cuando la solución se vuelva clara sin burbujas, coloque la solución de agar derretida en un baño de agua a 42 grados centígrados.

Configure la cámara de registro en el microscopio invertido. Deslice un puente de agar de cinco centímetros sobre el electrodo de referencia de plata, cloruro de plata y colóquelo en la cámara de registro. La resistencia de la punta de la pipeta se puede medir llenando una pipeta con solución interna, colocándola en el soporte de la pipeta, colocando el soporte de la pipeta en la etapa del cabezal del amplificador y bajando la pipeta a la solución para preservar el pigmento visual para los registros fisiológicos, todos los procedimientos deben realizarse bajo luz infrarroja usando gafas infrarrojas, pero todos los procedimientos se mostrarán aquí a la luz de la habitación.

Después de que el ratón haya sido sacrificado, use unas tijeras curvas para quitar rápidamente los ojos. Coloca los ojos en un trozo de papel de filtro para evitar que rueden. Luego, sostenga un ojo en su lugar con pinzas y use una cuchilla delgada de doble cara para hacer una hendidura en la córnea.

Tan pronto como se perfora el globo ocular. Transfiera el ojo a una placa de Petri de 60 milímetros llena de medio de puntería. Usando la hendidura en la córnea como punto de entrada, use unas tijeras pequeñas para cortar las partes restantes de la córnea.

A continuación, retire el cristalino y el humor vítreo, asegurándose de que la retina permanezca unida a la copa del ojo. Colócalo en un recipiente ligero y hermético lleno de objetivos. Medio equilibrado con 5% de dióxido de carbono en 95% de oxígeno a 32 grados centígrados.

A continuación, hemis sec. Una de las copas oculares con una hoja de bisturí número 10. Separa la retina del epitelio pigmentario de la retina.

Retire los bordes de la retina para permitir que el tejido quede plano. Use una pequeña pipeta de pasta de vidrio con un bulbo de látex para llenar una placa de Petri de 35 milímetros con agar gelificado derretido a baja temperatura y arrastre las pinzas a través del agar para probar su consistencia. Una vez que el agar comience a solidificarse, transfiera la retina a la parte superior del agar.

Luego, sin tocar la retina, use un trozo retorcido de toallita Kim para absorber el exceso de solución a su alrededor. Coloque dos o tres gotas adicionales de agar directamente sobre la retina y coloque rápidamente un cilindro de plástico para formar una pared a su alrededor mientras mantiene la retina cerca del centro del cilindro gotea en agar derretido adicional, transfiera la placa de Petri a un baño de agua helada para enfriar. Después de 30 segundos, retire el tejido y use un émbolo para extruir el bloque de agar, empujando desde el lado más alejado de la retina.

Use una hoja de afeitar de un solo lado para cortar un pequeño bloque de agar que contenga la retina y pegue el bloque en su lugar contra el tope de agar en el disco de muestra. Transfiera el disco de muestra al árbol de micrótomo vibrador y vierta montones de puntas heladas en el árbol, permitiendo que el bloque con la retina se sumerja por completo. Corte cortes de retina con un grosor de aproximadamente 200 micras utilizando la velocidad máxima de vibración de la hoja con una velocidad de avance de la hoja establecida de tal manera que se tarda de cuatro a cinco segundos en cortar a través de la retina. Una vez.

Use una hoja de bisturí número 11 para cortar cada rebanada utilizable del bloque una a la vez. Coloque los cortes que contienen la retina en cámaras de grabación y manténgalas presionadas. Uso de anclajes de rebanada: los hilos de nailon cruzan el anclaje de rebanada.

Sostenga el agar que rodea la retina, dejando la retina sin obstrucciones. Para grabaciones. Transfiera la cámara de registro a la platina del microscopio vertical.

Cierre la cortina y encienda la fuente de luz infrarroja para ver la rebanada en una cámara sensible a los infrarrojos. Bajo el microscopio, identifique un corte de retina con fotorreceptores intactos en el ángulo de corte apropiado. Algunos daños en la superficie pueden ser evidentes debido al proceso de corte.

Con una pipeta con una punta rota, succione suavemente los cuerpos de células muertas Para eliminar esta fina capa de células, una vez que se haya revelado una capa sana de células vivas, identifique un cuerpo celular cuya posición se encuentre en los estratos de interés. Mueva la punta de la pipeta de manera que haga hoyuelos en la membrana celular y aplique una presión suave, negativa o hacia adentro para hacer un sello de alta resistencia. El modo de celda completa se puede lograr aplicando presión negativa al electrodo para romper la celda.

A continuación, estimule el tejido de la retina con luz utilizando LED para evocar respuestas. Al final de la grabación, capture una imagen utilizando la luz de excitación adecuada para el flúor que se dializó en la célula desde la solución interna de la pipeta. Aquí, se muestran los potenciales evocados por la luz de una neurona retiniana adaptada a la oscuridad a destellos de luz de intensidad creciente.

Esta figura es una imagen de fluorescencia tomada de un corte de retina donde las células se han llenado con el amarillo fluorescente de Lucifer flúor, la fluorescencia evocada muestra la morfología de las células a partir de las cuales se hicieron los registros de parches. Después de ver este video, debería tener una mejor comprensión de algunas de las complejidades de hacer grabaciones de pinzas de parche a partir de cortes de retina oscuros adaptados. El objetivo de este procedimiento es medir las respuestas evocadas por la luz bajo iluminación controlada.

Para ello, primero tenemos que aislar la retina, incrustarla en una barrena y, a continuación, preparar cortes de retina a partir de los cuales podemos hacer grabaciones de una sola célula.