La visualización de larvas Nervios segmentarios en 3 ^Rd Instar Drosophila Preparación de larvas

El transporte axonal puede estudiarse mediante la visualización de los nervios segmentarios larvales. Una drosófila de tercer estadio. Primero se disecciona la larva, exponiendo el SNC sin dañar los lóbulos ópticos, el ganglio ventral ni los nervios segmentarios.

El segundo paso del procedimiento consiste en fijar la larva en formaldehído antes de incubarla con el anticuerpo primario durante la noche y luego con el anticuerpo secundario durante una hora en la oscuridad. A continuación, la larva se monta sobre un portaobjetos y se examinan los defectos en el transporte axonal. La localización y distribución de proteínas pueden analizarse mediante microscopía de inmunofluorescencia.

Aunque este método puede proporcionar información sobre el transporte axonal, también puede aplicarse a otros sistemas, como la morfología de sinapsis y músculos. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque inicialmente es difícil realizar esta disección permitida, especialmente para mantener intactos los nervios segmentarios cerebrales y los músculos. Para comenzar este procedimiento, prepare una solución fijadora de tampón de disección al 1×, PBT al 1× y una solución de BSA al 5 %.

Como se detalló en la tabla mostrada antes de la disección, reúna un par limpio de tijeras número cinco para bíceps, un par limpio de tijeras rectas en abanico y alfileres para comenzar la disección; utilice una cucharilla micro para recolectar larvas errantes en estadio de tercer ínstar con un genotipo específico y colóquelas en una placa de Petri. Luego, lave las larvas enjuagándolas en una placa de Petri llena con agua desionizada para eliminar toda la comida.

A continuación, coloque una larva en el platillo S guard con el lado dorsal hacia arriba. Sujeccione la larva en su extremo anterior y posterior. Coloque una gota del tampón de disección de un solo uso sobre la larva sujeta utilizando tijeras finas.

Pinche la larva en la línea media dorsal cerca del extremo posterior. Con las tijeras, corte la cutícula de la larva desde el extremo posterior hasta el extremo anterior. Coloque una gota de nuevo tampón de disección al uno por ciento sobre la larva diseccionada.

Usando una aguja, tome un borde lateral de la cutícula cerca de la mitad de la larva y sujete la cutícula con otra aguja. Utilice una segunda aguja en el otro borde lateral de la cutícula; se emplean dos agujas en cada lado lateral, como se muestra en el diagrama. Ahora, retire cuidadosamente el intestino, los cuerpos grasos y el cordón nervioso, dejando únicamente el cerebro con los dos lóbulos ópticos y los ganglios ventrales.

Con los nervios segmentarios fijados, se realiza a continuación la fijación y la tinción con anticuerpos manteniendo las larvas adheridas al plato de guardia. Incube las larvas diseccionadas en 50 microlitros de fijador durante 30 minutos. Después de la fijación, sustituya el fijador cada 15 minutos y lave las larvas en PBT 1X durante 30 minutos.

Al reemplazar el tampón cada 10 minutos, es importante tener en cuenta que las larvas siempre deben estar sumergidas en tampón. Prepare la solución de anticuerpo primario diluyéndolo a la concentración adecuada en la solución de BSA al 5%. Las concentraciones óptimas varían según el anticuerpo.

Construya una cámara húmeda forrando un recipiente de plástico con papel Kim. Empapado en agua. Reemplace el último con PBT varias veces.

Lave con la solución de anticuerpo primario preparada e incube en la cámara húmeda a cuatro grados Celsius durante la noche el día siguiente. Lave las larvas diseccionadas en PBT 1X durante 30 minutos, reemplazando el tampón cada 10 minutos. Prepare el anticuerpo secundario diluyéndolo a la concentración adecuada en la solución de BSA al 5%.

Y envuelva la cámara húmeda con papel de aluminio, ya que algunos anticuerpos secundarios son sensibles a la luz. Incube las larvas con la solución de anticuerpo secundario a 25 grados Celsius durante una hora. Una vez finalizada la incubación con el anticuerpo secundario, enjuague las larvas en PBT 1X durante 30 minutos, reemplazando el tampón cada 10 minutos, y proceda a montar y visualizar las larvas diseccionadas antes de montar la larva en el portaobjetos.

Prepare el portaobjetos extendiendo dos líneas verticales de esmalte de uñas en el centro, dejando un espacio suficientemente grande para que quepa una laminilla tal como se muestra en el diagrama. Deje que el esmalte de uñas se seque completamente una vez que haya terminado de aplicarlo. Coloque una gota de tampón de montaje en el espacio entre las líneas verticales de esmalte de uñas sobre el portaobjetos, tal como se muestra en esta imagen.

El portaobjetos ya está listo para su montaje. Recupere las larvas después del último lavado con PBT. Enjuague y retire suavemente las agujas laterales de una larva.

Tenga cuidado de no rasgar la cutícula cuidadosamente. Retire los dos alfileres restantes y tome la larva con pinzas, colocándola sobre el portaobjetos preparado. Asegúrese de que la larva no esté volteada y esté orientada ventralmente.

Coloque suavemente una lámina de cubierta encima con el lado adecuado hacia arriba y selle los bordes con esmalte de uñas como se ilustra aquí. Las larvas ya están listas para su visualización bajo un microscopio fluorescente. Esta imagen representativa corresponde a una larva de tipo silvestre teñida con anticuerpos contra la proteína de la vesícula sináptica, proteína de cadena de cistina.

Los nervios segmentarios de lava están teñidos de manera uniforme aquí. Un mutante de proteína motora lava fue teñido con anticuerpos contra CSP. Los nervios segmentarios muestran acumulaciones masivas que se tiñen intensamente para CSP.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar conservar los nervios segmentarios unidos al cerebro y mantener los músculos intactos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la disección. Fije una inmunotinción en tercer lugar e inicie el estudio de los nervios segmentarios larvales para analizar el transporte axonal mediante un microscopio fluorescente.