Name: La visualización de larvas Nervios segmentarios en 3 Rd Instar Drosophila Preparación de larvas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Aprende a visualizar nervios segmentarios en larvas de Drosophila de tercer estadio mediante inmunofluorescencia. Este método permite estudiar defectos en el transporte axonal y localización de proteínas en neurociencia.

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SG es apoyado por fondos de la Universidad Estatal de Nueva York en Buffalo y de John R. Oishei Fundación.

1. Preparación de los reactivos <ol><li> Prepare 1x Buffer disección de 128 mM NaCl, 4 mM CaCl 2, 4 mM MgCl 2, 2 mM KCl, HEPES 5 mM y sacarosa 36 mm. PH de la solución al 7,2 y el filtro de esterilización. </li><li> Preparar el fijador con una dilución 1:01 del 16% de formaldehído y el tampón de disección 1x. </li><li> Prepare 1x 1x PBT con tampón fosfato salino (PBS) a un pH de 7.2 y Triton X-100 en una proporción de 1:100. </li><li> Prepare un 5% albúmina de suero bovino (BSA) con 0,01% de azida Na en 1x PBS. </li></ol> 2. Preparación para la disección <ol><li> Sylgard platos se utilizan para la disección. Prepare los platos a base de verter Sylgard 184 elastómero de silicona y curado mezcla de agente en una placa de Petri. Dejar que la mezcla se solidifique por completo y seco antes de usar. </li><li> Antes de la disección, se reúnen un par limpio de # 5 pinzas, un par limpio de hoja recta Vannas tijeras y alfileres. </li></ol> 3. La disección de 3 º estadio las larvas <ol><li> Recoger vagando 3 º estadio las larvas de un genotipo específico en una placa de Petri. </li><li> Lavado de las larvas en agua desionizada para deshacerse de la comida. </li><li> Colocar una larva en el plato Sylgard, con el lado dorsal. Pin de la larva en sus extremos anterior y posterior. </li><li> Coloque una gota de tampón 1x disección de las larvas puestas. Usando tijeras finas cortar la larva en la línea media dorsal cerca del extremo posterior. Con las tijeras, corte la cutícula larval desde el extremo posterior hasta el final anterior. </li><li> Coloque una gota de tampón 1x nueva disección en la larva disecada. El uso de un PIN, elige uno de los bordes laterales de la cutícula, cerca de la mitad de la larva y el pin de la cutícula. El uso de otro pin, pin el segundo borde lateral de la cutícula como se muestra en el diagrama. Dos pines se utilizan en cada lado lateral. Vea el diagrama a continuación. </li><li> Retire con cuidado los intestinos, los órganos de la grasa, y la tráquea, dejando sólo el cerebro con los dos lóbulos ópticos y los ganglios ventrales de los nervios segmentarios adjunto. El resto del procedimiento se hace en el plato Sylgard. </li></ol> 4. La fijación de la larva disecados <ol><li> Incubar la larva disecados en solución durante 30 minutos, mediante la sustitución de la solución cada 15 minutos. </li><li> Después de la fijación, enjuague la larva en 1x PBT durante 30 minutos, sustituyendo el tampón cada 10 minutos. Es importante señalar que la larva debe estar siempre en un búfer. </li></ol> 5. La tinción de anticuerpos de la larva disecados <ol><li> Prepare el anticuerpo primario mediante la dilución a la concentración adecuada en el 5% BSA con Na azida en 1x PBT. Las concentraciones óptimas serán diferentes para diferentes anticuerpos. </li><li> Vuelva a colocar la última PBT 1x enjuague con la solución de anticuerpo primario preparado, y se incuba en una cámara húmeda a 4 ° C durante la noche. La cámara húmeda se construye por el forro un plato de plástico con kim-paños empapados en agua. </li><li> Al día siguiente, enjuagar la larva disecado en 1x PBT durante 30 minutos, sustituyendo el tampón cada 10 minutos. </li><li> Prepare la secundaria de anticuerpos mediante la dilución a la concentración adecuada en el 5% BSA con Na azida en 1x PBT, e incubar la larva con la solución de anticuerpo secundario a 25 ° C durante una hora. Envuelva la cámara húmeda en papel de aluminio para evitar que la luz, como anticuerpos secundarios son sensibles a la luz. </li><li> Después de la incubación, lavar la larva en 1x PBT durante 30 minutos, sustituyendo el tampón cada 10 minutos. </li></ol> 6. De montaje y visualización de la larva disecados <ol><li> Antes de montar la larva de la diapositiva, preparar la diapositiva mediante la difusión de dos líneas verticales de esmalte de uñas en el medio, con un espacio suficiente para una hoja de cubierta para sentarse (ver diagrama). Deja que el esmalte de uñas se seque por completo. </li><li> Coloque una gota de tampón de montaje en el espacio entre las líneas verticales pulir las uñas en la diapositiva (ver diagrama). La diapositiva está listo para el montaje. <img src="/files/ftp_upload/2128/2128.6.2.1.jpg" alt="Figura 1 paso 6.2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1 paso 6.2"> <img src="/files/ftp_upload/2128/2128.6.2.2.jpg" alt="Figura 2 paso 6.2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2 Paso 6.2"></li><li> Después del último enjuague PBT 1x, retire con cuidado las clavijas laterales. Tenga cuidado de no romper la cutícula. </li><li> Retire con cuidado las dos patillas restantes y recoger las larvas con pinzas y colocar la larva en posición horizontal sobre la diapositiva preparada. Asegúrese de que la larva no se dio la vuelta y es la parte ventral orientada hacia arriba. </li><li> Con cuidado, coloque una hoja de cubierta en la parte superior y selle los bordes con esmalte de uñas (ver diagrama). La larva ya está listo para la visualización en un microscopio de fluorescencia. <img src="/files/ftp_upload/2128/2128.6.5.jpg" alt="Figura 1 paso 6.5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1 paso 6.5"></li></ol> 7. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2128/2128fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: Una imagen representativa de las larvas de los nervios segmentarios de un tipo salvaje LARVun uso de anticuerpos contra la proteína de vesículas sinápticas proteínas cadena cisteína (CSP, Zinsmaier et al. 1994). Tenga en cuenta que los nervios segmentarios están suavemente manchado. Bar = 20μm <img src="/files/ftp_upload/2128/2128fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: Una imagen representativa de las larvas de los nervios segmentarios de una larva de la proteína mutante motor usando anticuerpos contra la proteína de la vesícula sináptica proteína cadena cisteína (CSP). Tenga en cuenta que los nervios segmentarios muestran acumulaciones masivas que se tiñen intensamente para CSP (flechas).

<ol><li>Gunawardena, S., Goldstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Axonal+Transport+and+Neuronal+Viability+by+Amyoid+Precursor+Protein+Mutations+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disruption of Axonal Transport and Neuronal Viability by Amyoid Precursor Protein Mutations in Drosophila.</a> Neuron. 32 (2), 389-401 (2001).</li>
<li>Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+axonal+transport+by+loss+of+huntingtin+or+expression+of+pathogenic+polyQ+proteins+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila.</a> Neuron. 40 (1), 1-2 (2003).</li>
<li>Hurd, D. D., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+mutations+cause+motor+neuron+disease+phenotypes+by+disrupting+fast+axonal+transport+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila.</a> Genetics. 144 (3), 1075-1085 (1996).</li>
<li>Zinsmaier, K. E., Eberle, K. K., Buchner, E., Walter, N., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paralysis+and+early+death+in+cysteine+string+protein+mutants+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Paralysis and early death in cysteine string protein mutants of Drosophila.</a> Science. 263, 977-980 (1994).</li>
</ol>

Los nervios larvas de Drosophila segmentaria es un poderoso sistema para estudiar los mecanismos en el transporte axonal. Si el 3 º estadio larval disección se realiza correctamente, todos los componentes del sistema nervioso central, sistema nervioso periférico, y los tejidos asociados, como los músculos y NMJs, puede ser examinado dentro de una sola larva. Hemos adaptado el protocolo a partir de la publicada por Hurd y Saxton (1996). Este protocolo también se puede adaptar a otra prueba de anticuer...

<table><tbody><tr><td>Pinzas Dumont n.º 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Alfileres Minutien, acero inoxidable</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras rectas Mcpherson-Vannas, 8 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>50822236</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield, medio de montaje</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Elastómero de silicona Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>4026148</td><td></td></tr><tr><td>formaldehído, 16%</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>dCSP3</td><td>Banco de Hibridomas para Estudios del Desarrollo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 de cabra anti-IgG de ratón</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004</td><td></td></tr></tbody></table>

la visualización de larvas nervios segmentarios en 3 rd instar drosophila preparación de larvas

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster se está convirtiendo en un modelo de sistema de gran alcance para el estudio del desarrollo y la función del sistema nervioso, sobre todo por su genética y conveniente genoma secuenciado en su totalidad. Además, el sistema nervioso de larvas es un sistema modelo ideal para estudiar los mecanismos de transporte axonal de los nervios segmentarios larvas contienen haces de axones con sus cuerpos celulares situados en el cerebro y sus terminales de las terminaciones nerviosas a lo largo de la longitud del cuerpo. A continuación se describe el procedimiento para la visualización de proteínas de vesículas sinápticas en las larvas nervios segmentarios. Si se hace correctamente, todos los componentes del sistema nervioso, junto con los tejidos correspondientes, tales como los músculos y NMJs, permanecen intactos y en buen estado y listo para ser visualizado. 3 º estadio las larvas portadoras de mutaciones diferentes se disecan, fijo, se incubaron con anticuerpos vesículas sinápticas, visualizar y en comparación con las larvas de tipo salvaje. Este procedimiento se puede adaptar a varios anticuerpos diferentes sináptica o neuronal y los cambios en la distribución de una variedad de proteínas pueden ser fácilmente observado en larvas de los nervios segmentarios.

Drosophila melanogaster larvas de disponer de un sistema modelo ideal para investigar los mecanismos de transporte axonal en larvas de los nervios segmentarios. El uso de este procedimiento, 3 de larvas portadoras de mutaciones diferentes pueden ser comparados a las larvas de tipo salvaje.

La visualización de larvas Nervios segmentarios en 3 Rd Instar Drosophila Preparación de larvas

*Drosophila melanogaster* está emergiendo como un potente sistema modelo para estudiar el desarrollo y la función del sistema nervioso, particularmente debido a...

El transporte axonal puede estudiarse mediante la visualización de los nervios segmentarios larvales. Una drosófila de tercer estadio. Primero se disecciona la larva, exponiendo el SNC sin dañar los lóbulos ópticos, el ganglio ventral ni los nervios segmentarios.El segundo paso del procedimiento consiste en fijar la larva en formaldehído antes de incubarla con el anticuerpo primario durante la noche y con el anticuerpo secundario durante una hora en la oscuridad. Luego, la larva se monta sobre un portaobjetos y se analizan los defectos en el transporte axonal. La localización y distribución de proteínas pueden examinarse mediante microscopía de inmunofluorescencia.Aunque este método puede proporcionar información sobre el transporte axonal, también puede aplicarse a otros sistemas, como la morfología de sinapsis y músculos. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque inicialmente es difícil realizar esta disección permisible, especialmente para mantener intactos los nervios segmentarios cerebrales y los músculos. Para comenzar este procedimiento, prepare una solución fijadora de tampón de disección al 1x, PBT al 1x y una solución de BSA al 5 %.Como se detalló en la tabla mostrada antes de la disección, reúna un par limpio de tijeras número cinco para bíceps, un par limpio de tijeras rectas en abanico y alfileres para comenzar la disección; utilice una cucharilla micro para recolectar larvas errantes en estadio de tercer instar con un genotipo específico y colóquelas en una placa de Petri. Luego, lave las larvas enjuagándolas en una placa de Petri llena con agua desionizada para eliminar toda la comida.A continuación, coloque una larva en el platillo del guardia S con el lado dorsal hacia arriba. Sujeccione la larva en su extremo anterior y posterior. Coloque una gota del tampón de disección de un solo uso sobre la larva sujeta utilizando tijeras finas.Pinche la larva en la línea media dorsal cerca del extremo posterior. Con las tijeras, corte la cutícula de la larva desde el extremo posterior hasta el extremo anterior. Coloque una gota de nuevo tampón de disección al uno por ciento sobre la larva diseccionada.Con un alfiler, tome un borde lateral de la cutícula cerca del centro de la larva y sujete la cutícula utilizando otro alfiler. Para el segundo borde lateral de la cutícula, se utilizan dos alfileres en cada lado lateral, como se muestra en el diagrama. Ahora, retire cuidadosamente el intestino, los cuerpos grasos y el cordón nervioso, dejando únicamente el cerebro con los dos lóbulos ópticos y los ganglios ventrales.Con los nervios segmentarios fijados, se realiza a continuación la fijación y la tinción con anticuerpos manteniendo las larvas adheridas al platillo de protección. Incube las larvas diseccionadas en 50 microlitros de fijador durante 30 minutos. Después de la fijación, reemplace el fijador cada 15 minutos y lave las larvas en PBT 1X durante 30 minutos.Al reemplazar el tampón cada 10 minutos, es importante tener en cuenta que las larvas siempre deben estar sumergidas en tampón. Prepare la solución de anticuerpo primario diluyéndolo a la concentración adecuada en la solución de BSA al 5%. Las concentraciones óptimas varían según el anticuerpo.Construya una cámara húmeda forrando un recipiente de plástico con Kim. Wipe empapado en agua. Reemplace la última vez PBT.Lave con la solución de anticuerpo primario preparada e incube en la cámara húmeda a cuatro grados Celsius durante la noche del día siguiente. Lave las larvas diseccionadas en PBT 1x durante 30 minutos, reemplazando el tampón cada 10 minutos. Prepare el anticuerpo secundario diluyéndolo a la concentración adecuada en la solución de BSA al 5 %.Y envuelva la cámara húmeda con papel de aluminio, ya que algunos anticuerpos secundarios son sensibles a la luz. Incube las larvas con la solución de anticuerpo secundario a 25 grados Celsius durante una hora. Una vez finalizada la incubación con el anticuerpo secundario, enjuague las larvas en PBT 1X durante 30 minutos, reemplazando el tampón cada 10 minutos, y proceda a montar y visualizar las larvas disecadas antes de montar la larva en el portaobjetos.Prepare el portaobjetos extendiendo dos líneas verticales de esmalte de uñas en el centro, dejando un espacio suficientemente grande para que una laminilla pueda reposar encima, como se muestra en el diagrama. Deje que el esmalte de uñas se seque completamente. Coloque una gota de medio de montaje en el espacio entre las líneas verticales de esmalte de uñas sobre el portaobjetos, como se muestra en esta imagen.El portaobjetos ya está listo para su montaje. Recupere las larvas después del último lavado con PBT. Enjuague y retire suavemente las agujas laterales de una larva.Tenga cuidado de no romper la cutícula con cuidado. Retire los dos alfileres restantes y tome la larva con pinzas, colocándola sobre la laminilla preparada. Asegúrese de que la larva no esté volteada y esté orientada de forma ventral.Coloque suavemente un cubreobjetos en posición vertical y selle los bordes con esmalte de uñas como se ilustra aquí. Las larvas ya están listas para su visualización bajo un microscopio fluorescente. Esta imagen representativa corresponde a una larva de tipo silvestre teñida con anticuerpos contra la proteína de la vesícula sináptica, proteína de cadena de cistina.Los nervios segmentarios de lava están teñidos de manera uniforme aquí. Un mutante de proteína motora lava fue teñido con anticuerpos contra CSP. Los nervios segmentarios muestran acumulaciones masivas que se tiñen intensamente para CSP.Al realizar este procedimiento, es importante recordar conservar los nervios segmentarios unidos al cerebro y mantener los músculos intactos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la disección. Fije una inmunotinción en tercer lugar e inicie los nervios segmentarios larvales para estudiar el transporte axonal utilizando un microscopio fluorescente.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Se describe el procedimiento para preparar...

Visualización del sistema nervioso embrionario en Todo el montaje Drosophila Los embriones

Este protocolo describe la disección en vivo...

Visualización en vivo de las vesículas sinápticas En Drosophila segmentaria axones larvas

Aquí se presenta un protocolo de montaje para...

Imagen de la posición vertical Drosophila Los embriones

Este protocolo describe un método fiable para la anestesia y la imagen intacta...

Imágenes in vivo de larvas de Drosophila intactos a nivel sub-celular Resolución

Un método para inmunoteñir y visualizar los órganos chordotonal en larvas y pupas...

Visualización de los propioceptores<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas y pupas

Este video describe la glándula anular de Drosophila, una compleja estructura endocrina importante para la biosíntesis y secreción de ecdisteroides y otras hormonas. El protocolo presentado demuestra su disección, fijación e inmunotinción.

Disección de glándulas anulares larvariales: aislamiento de órganos endocrinos en desarrollo de Drosophila

Fuente: Jeong, S. Visualización del patrón de proyección axonal de las neuronas motoras embrionarias en Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)Este video demuestra la visualización de proyecciones axonales en embriones de Drosophila. El inmunomarcaje de las neuronas motoras, la disección precisa para exponer las estructuras neuronales y la microscopía de contraste de interferencia diferencial revelan colectivamente una arquitectura neuronal detallada, enfatizando los patrones de proyección axonal.

Visualización de los patrones de proyección axonal de las neuronas motoras embrionarias en Drosophila

Este protocolo detalla un método simplificado utilizado para llevar a cabo imágenes de células vivas en el contexto de un cerebro de larvas intacta. Enfoques imágenes de células vivas tienen un valor incalculable para el estudio de las divisiones asimétricas de células madre neuronales, así como otros procesos neurogénicos y de desarrollo, descubriendo constantemente los mecanismos que se pasaron por alto anteriormente.

Imágenes en vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larvales neuroblastos

Se describe un protocolo para la disección, la fijación y la inmunotinción de órganos androgénica en Drosophila larvas y adultos hembras para estudiar la biosíntesis de hormonas esteroideas y su mecanismo de regulación. Además de los órganos androgénica, visualizamos la inervación de los órganos androgénica, así como células diana androgénica, tales como las células madre de línea germinal.

Protocolos para la visualización androgénica, órganos y sus órganos interactivos con inmunotinción en la mosca de la fruta<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Este trabajo detalla un método de inmunohistoquímica estándar para visualizar las proyecciones de neuronas motoras de los embriones de Drosophila melanogaster de etapa tardía-16. La preparación en filetes de embriones fijos teñidos con anticuerpos FasII proporciona una potente herramienta para caracterizar los genes necesarios para la búsqueda de axones motores y el reconocimiento de dianas durante el desarrollo neural.

Visualización del patrón de proyección axonal de las neuronas motrices embrionarias<em&gt; Drosophila</em

Aquí, discutimos un flujo de trabajo para preparar, diseccionar, montar y obtener imágenes de cerebros de explante vivos de larvas del tercer estadio de Drosophila melanogaster para observar la dinámica celular y subcelular en condiciones fisiológicas.

Imágenes de células vivas de cerebros larvales del tercer estadio de Drosophila melanogaster

Aprende a visualizar nervios segmentarios en larvas de Drosophila de tercer estadio mediante inmunofluorescencia. Este método permite estudiar defectos en el transporte axonal y localización de proteínas en neurociencia.

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