Name: Inducción y evaluación de la recombinación de cambio de clase en las células murinas purificada B (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Aprende a inducir y evaluar la recombinación de cambio de clase en células B murinas purificadas usando separación magnética, tinción CFSE y citometría de flujo. Este método permite estudiar la función y regulación de las células B in vitro.

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Estamos agradecidos con el laboratorio de Martin útil para los debates. Esta publicación está apoyada por una subvención del Instituto Canadiense de Investigación en Salud (MOP-89783). AM es apoyado por una investigación de Canadá Premio Cátedra de Nivel II.

Paso I: Aislamiento de las células B del bazo a través de enriquecimiento magnética <ol><li> Ratones experimentales deben ser mayores de 8-12 semanas para asegurar plena maduración del sistema inmunológico. </li><li> Sacrificar al ratón por dislocación cervical y de inmersión en etanol al 70%. Extraer quirúrgicamente el bazo al realizar una incisión a través de la piel y el músculo del hipocondrio izquierdo del abdomen y lo cortó en tres trozos grandes en tampón fosfato salino (PBS). Asegúrese de que todas las herramientas y los reactivos son estériles. </li><li> Con el extremo de caucho de un émbolo de una jeringa ml, suavemente mezcla del bazo a través de un filtro de 70 micras de células en PBS. Asegúrese de utilizar un movimiento de empujar en lugar de un movimiento de trituración de molienda puede conducir a la ruptura de los más grandes (es decir, la proliferación) las células. </li><li> Centrifugar las células a no más de 350 g por 5 minutos y resuspender el precipitado en PBS. Contar las células se resuspendieron utilizando un hemocitómetro. </li><li> Preparar una suspensión de 1x10 8 células / ml en PBS con suero de rata 5% de lo normal en un tubo de poliestireno estériles de 5 ml con tapa (volumen máximo de 2 ml por tubo). </li><li> Añadir 50 l de EasySep ratón negativo selección de cócteles enriquecimiento de las células B por cada ml de células. Pipeta de la mezcla, la tapa de los tubos, y colocar en la nevera durante 15 minutos. </li><li> Añadir 100 ml EasySep Cocktail Selección biotina por cada ml de células. Pipeta de la mezcla, la tapa de los tubos, y colocar en la nevera durante 15 minutos. </li><li> Añadir 100 ml de EasySep nanopartículas magnéticas (garantizar las nanopartículas se mezclan bien y la solución es homogénea) por cada ml de células. Pipeta de la mezcla, la tapa de los tubos, y colocar en la nevera durante 5 minutos. </li><li> Parte superior de la solución a 2,5 ml con PBS y colocar en un imán EasySep durante 5 minutos. Invertir el imán y el tubo y se vierte rápidamente en un tubo de poliestireno de nuevo. No agite el tubo de las células negativamente seleccionados serán magnético unido a las paredes del tubo. </li><li> Para aumentar aún más la pureza de la suspensión celular, el tubo puede ser reinsertado en el polo de atracción para otros 5 minutos y se vierte en un tubo nuevo. Esto puede reducir la recuperación general de la célula. </li><li> La pureza de las células B puede ser evaluada por citometría de flujo de los marcadores de superficie de la célula B. Después del enriquecimiento, que constantemente ve una pureza de&gt; 95% de células positivas B220. </li></ol> Paso II: tinción de células CFSE <ol><li> Resuspender las células aisladas en caliente PBS suplementado con 0,1% de albúmina sérica bovina a una concentración final de 1 x 10 6 células por ml. </li><li> Preparar una solución de 5 mm de CFSE (diluido en dimetilsulfóxido estéril) y añadir 2μL por cada ml de células en el tubo. La concentración final de 10μM es óptimo para la tinción de las células B primario. </li><li> Se incuba a 37 ° C durante 10 minutos en la oscuridad (nota: la CFSE es sensible a la luz y se debe mantener en la oscuridad cuando es posible). </li><li> Apagar la mancha mediante la adición de un volumen igual de suero de ternera bovina a las células e incubar en hielo durante 5 minutos. </li><li> Lavar las células por añadir los tubos con medio de cultivo (véase el paso III de la receta) y centrifugado a 350 g. Tenga en cuenta que por lo menos 5 veces el equivalente del volumen de los medios de comunicación hay que añadir para contrarrestar la viscosidad del suero de ternera de vacuno y de las células para producir una pastilla. </li><li> Lavar las células dos veces más en medio de cultivo. Las células están listas para la estimulación. </li></ol> Paso III: la estimulación de células con LPS <ol><li> Prepare su medio de cultivo in vitro de células B, completándolo RPMI 1640 con suero bovino fetal al 10% y M 50 / β-mercaptoetanol. </li><li> Preparar el medio de la estimulación mediante la adición de LPS a una concentración final de 50μg/mL. Alícuota de 125 l del medio de la estimulación en cada pocillo de una placa de fondo plano de cultivo de tejidos de 96 pocillos. </li><li> Prepare su manchadas CFSE células B en el medio de cultivo sin LPS a una concentración final de 3,2 x 10 6 células / ml. Añadir 125 l de la suspensión celular a los pozos que contienen el medio de la estimulación y mezclar con la pipeta suavemente. </li><li> Cada bien ahora consta de 4 x 10 5 células en una concentración final de 25 LPS mg / ml. Esto proporciona un nivel óptimo de la proliferación celular y cambio de clase, a pesar de las alteraciones de estos valores se puede hacer a su gusto. </li><li> Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO2 durante 72 a 96 horas. Después de 48 horas, los grupos de grandes células B proliferan será claramente visible bajo el microscopio. </li></ol> Paso IV: Análisis de citometría de flujo de cambio de clase <ol><li> Cuando esté listo para ver el cambio de clase, eliminar las células de las condiciones de su cultura y lavar dos veces en 1 ml de buffer de tinción (PBS con 2% de suero bovino de ternera). </li><li> Para evitar tinción no específica de anticuerpos de las células, que sedimenten las células al girar hacia abajo a 350 g y incubaciónte en 100μL de buffer de tinción con suero de ratón normal y 5% de 1 g de FcBlock per106 las células durante 15 minutos en hielo. El bloqueo de celulares se debe realizar en el hielo. </li><li> Sin lavarse las células, añadir 1 g por cada 10 6 células de un ratón anti marcado con fluorescencia de anticuerpos IgG3 y permitir que las células se mancha durante 30 minutos en hielo. </li><li> Lavar las células dos veces por centrifugación y se resuspenden en 200 a 300 l de buffer de tinción. Las células están listas para la evaluación por citometría de flujo. </li><li> CFSE es óptima emocionado a 492 nm (por un láser de argón-ion) y emite a 517 nm. El espectro de excitación y emisión de los anticuerpos IgG3 depende de su tinte fluorescente conjugada. </li></ol> Resultados representante Después del enriquecimiento magnética, la suspensión celular debe verse como una población homogénea de células indistinguibles pequeña circular (fig. 1A). Después de 48-72 horas de estimulación, grupos aislados de agrandamiento de la proliferación de células será claramente visible (fig. 1B). Una gran proporción de las células no proliferantes aparecerán pequeñas y granulares, ya que la apoptosis. RSE puede ser detectada normalmente al más alto nivel entre 72 y 96 horas después de la estimulación antes de que la mayoría de las células comienzan a morir 7. En esta etapa, las células que han sufrido una serie de divisiones celulares con células cambió aparecen en la población de células hijas más tarde. Un diagrama de flujo de citometría de representante de la dilución CFSE y la expresión superficial de IgG3 después de 96 horas de estimulación con LPS se puede ver en la Figura 2. Tabla 1. Isotipo cócteles. Nota: Los valores de concentración de estimulantes son sólo recomendaciones. Titulaciones que sean necesarias. <table border="1"><tbody><tr><td> Isotipo deseado </td><td> Estimulación Cocktail </td></tr><tr><td> IgG1and IgE </td><td> LPS (25μg/mL) e IL-4 (10 ng / mL) </td></tr><tr><td> IgG1and IgE </td><td> Anti-CD40 (10μg/mL) e IL-4 (10 ng / mL) </td></tr><tr><td> IgG2a </td><td> LPS (25μg/mL) e IFN-γ (10 ng / mL) </td></tr><tr><td> IgG2b e IgG3 </td><td> LPS (25μg/mL) </td></tr><tr><td> IgA </td><td> LPS (25μg/mL), TGF-β (2 ng / ml) e IL-5 (1,5 ng / mL) </td></tr></tbody></table><img src="/files/ftp_upload/2130/2130fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Aislamiento y estimulación con LPS de células B del bazo. (A) magnéticamente enriquecido células del bazo B antes de la estimulación con LPS. (B) 48 horas después de la estimulación con 25 mg / ml de LPS. Proliferación de las células se ven como las agrupaciones en un fondo de células apoptóticas y voladuras. <img src="/files/ftp_upload/2130/2130fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Proliferación y la recombinación de cambio de clase después de 96 horas. (A) la dilución CFSE para LPS estimula las células después de 96 horas en la cultura. Cada pico independiente representa una dilución de la fluorescencia CFSE que corresponde a una división de las células independientes. (B) la expresión IgG3 que muestra el surgimiento de una población IgG3 positivo después de varias rondas de división celular.

<ol><li>Hodgkin, P. D., Lee, J. H., Lyons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+differentiation+and+isotype+switching+is+related+to+division+cycle+number%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">B cell differentiation and isotype switching is related to division cycle number.</a> J Exp Med. 184, 277-281 (1996).</li>
<li>McCall, M. N., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switch+recombination+and+germ-line+transcription+are+division-regulated+events+in+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Switch recombination and germ-line transcription are division-regulated events in B lymphocytes.</a> Biochim Biophys Acta. 1447, 43-50 (1999).</li>
<li>Manis, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1+links+DNA+damage-response+pathways+to+immunoglobulin+heavy+chain+class-switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">53BP1 links DNA damage-response pathways to immunoglobulin heavy chain class-switch recombination.</a> Nat Immunol. 5, 481-487 (2004).</li>
<li>de Yebenes, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-181b+negatively+regulates+activation-induced+cytidine+deaminase+in+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">miR-181b negatively regulates activation-induced cytidine deaminase in B cells.</a> J Exp Med. 205, 2199-2206 (2008).</li>
<li>McBride, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+class+switch+recombination+and+somatic+mutation+by+AID+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation.</a> J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).</li>
<li>Ramachandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNF8%2FRNF168+ubiquitin+ligase+cascade+facilitates+class+switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The RNF8/RNF168 ubiquitin ligase cascade facilitates class switch recombination.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 809-8014 (2010).</li>
<li>Zaheen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AID+constrains+germinal+center+size+by+rendering+B+cells+susceptible+to+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">AID constrains germinal center size by rendering B cells susceptible to apoptosis.</a> Blood. 114, 547-554 (2009).</li>
<li>Chaudhuri, J., Alt, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class-switch+recombination%3A+interplay+of+transcription%2C+DNA+deamination+and+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Class-switch recombination: interplay of transcription, DNA deamination and DNA repair.</a> Nat Rev Immunol. 4, 541-552 (2004).</li>
<li>Kaminski, D. A., Stavnezer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimuli+that+enhance+IgA+class+switching+increase+histone+3+acetylation+at+S+alpha%2C+but+poorly+stimulate+sequential+switching+from+IgG2b%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stimuli that enhance IgA class switching increase histone 3 acetylation at S alpha, but poorly stimulate sequential switching from IgG2b.</a> Eur J Immunol. 37, 240-251 (2007).</li>
<li>Kaminski, D. A., Stavnezer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+class+switching+differs+among+SJL%2C+C57BL%2F6+and+129+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice.</a> Int Immunol. 19, 545-556 (2007).</li>
</ol>

El protocolo descrito anteriormente proporciona un estándar de ensayo para analizar la expresión de la AID y la función durante el cambio de clase de primaria de las células B murinas. Este protocolo utiliza bacteriana LPS para inducir el cambio de IgM a IgG3, a pesar de las modificaciones a los medios de estimulación se puede hacer para inducir el cambio a otros isotipos (que se resumen en la Tabla 1 8, 9). Hemos tomado nota de que, por razones aún desconocidas, suero bovino feta...

<table><tbody><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Kit de enriquecimiento de células B de ratón EasySep</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>19754</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de poliestireno</td><td>BD Biosciences</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Kit de proliferación celular CellTrace CFSE</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Suero de becerro bovino</td><td>Hyclone</td><td>SH30072.03</td><td></td></tr><tr><td>Medio de cultivo RPMI 1640</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacáridos de &lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6529</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-mercapto&amp;#8211;etanol</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21985</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>Suero de ratón normal</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>011-000</td><td></td></tr><tr><td>Ratón purificado anti-ratón CD16/CD32 (Bloqueador de Fc de ratón BD)</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal de rata anti-IgG3 de ratón</td><td>BD Biosciences</td><td>553401</td><td></td></tr></tbody></table>

inducción y evaluación de la recombinación de cambio de clase en las células murinas purificada b

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

La inmunidad humoral es la rama del sistema inmune que mantiene las células B y mediado a través de la secreción de anticuerpos. Tras la activación de células B, el locus de la inmunoglobulina se somete a una serie de modificaciones genéticas para alterar la capacidad de unión y función efectora de los anticuerpos secretados. Este proceso se destaca por un evento de recombinación genómica conocida como recombinación de cambio de clase (CSR) en el que se sustituye el isotipo IgM por defecto para un anticuerpo de IgG, IgA o IgE. Cada isotipo posee distintas funciones efectoras con lo que la RSC crucial para el mantenimiento de la inmunidad. Diversificación de la locus de la inmunoglobulina es mediada por la enzima citidina deaminasa inducida por activación (AID). Un vídeo esquema que describe este proceso en detalle está disponible en línea (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). La actividad de la AID y la vía de RSC son comúnmente estudiados en la evaluación de la función de las células B y la inmunidad humoral en ratones. El protocolo se describe en este informe se presenta un método de aislamiento de células B del bazo murino y posterior estimulación con lipopolisacárido bacteriano (LPS) para inducir el cambio a la clase IgG3 (para otros isotipos de anticuerpos ver Tabla 1). Además, la tinción de células fluorescentes de tinte carboxifluoresceína succinimidil ester (CFSE) se utiliza para controlar la división celular de las células estimuladas, un proceso crucial para el cambio de isotipo 1, 2. La regulación de la AID y el mecanismo por el que la RSE se produce aún no están claros y por lo tanto en ensayos in vitro de cambio de clase proporcionan un método confiable para las pruebas de estos procesos en modelos de ratones diferentes. Estos ensayos se han utilizado anteriormente en el contexto de la deficiencia de genes utilizando ratones knockout 3. Además, in vitro el cambio de las células B puede estar precedido por la transducción viral para modular la expresión génica mediante ARN derribo o la expresión del transgén 4-6. Los datos de este tipo de experimentos han impactado a nuestra comprensión de la actividad de AID, la resolución de la reacción de la RSE, y la inmunidad mediada por anticuerpos en los ratones.

Después de la exposición al antígeno, las subpoblaciones de linfocitos B activados sufren un proceso conocido como recombinación de cambio de clase (CSR) para producir isotipos de anticuerpos con diferentes funciones efectoras. El protocolo se describe en este informe se explica cómo la RSE puede ser inducida y analizados<em&gt; In vitro</em&gt; A los efectos de estudiar la función de las células B.

Inducción y evaluación de la recombinación de cambio de clase en las células murinas purificada B

La inmunidad humoral es la rama del sistema inmunitario mantenida por los linfocitos B y mediada a través de la secreción de anticuerpos. Tras la activación de los linfocitos B, el...

Durante la respuesta inmunitaria humoral, las células B activadas por el antígeno proliferan y secretan anticuerpos a medida que avanza la respuesta. El isotipo de anticuerpo I GM predeterminado se sustituye por los isotipos más diversos IgG iga o IgE para evaluar la proliferación y el cambio de clase. Las células B esplénicas se aíslan in vitro de un ratón experimental mediante separación magnética de células.Las células se tiñen con el colorante fluorescente CFSE para monitorear la proliferación, la cual se estimula mediante el tratamiento con L-P-S bacteriano. L-P-S también induce el cambio de clase al isotipo IgG3, el cual, junto con la proliferación, puede monitorearse mediante citometría de flujo. Hoy les mostraré una técnica para el aislamiento y activación de linfocitos B esplénicos puros. Esta técnica puede utilizarse para analizar la recombinación por cambio de clase y la proliferación in vitro, y también puede emplearse para responder preguntas clave en el campo de la inmunidad de los linfocitos B, incluyendo la función y regulación de la citidina desaminasa inducida por activación.Comience por sumergir un ratón sacrificado en etanol al 70 %. El ratón debe tener entre oc

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Se describe cómo realizar las infecciones por retrovirus o lentivirus de la sobreexpresión o siRNA que contienen las construcciones en la línea de Ramos humanos de células B y la forma de medir la hipermutación somática en estas células.

La evaluación de la hipermutación somática en Ramos células B después de sobreexpresión o derribo de genes específicos

El análisis in vitro de la recombinación de interruptores de clase en ratones es un desafío debido a las moléculas citofílicas de IgE unidas a los receptores Fc en la superficie de las células B.  Describimos un método para la detección de IgE utilizando la escisión mediada por tripsina de IgE unida a la superficie antes de la fijación y permeabilización para la tinción con fluorescencia citoplasmática.

Detección de True IgE que expresan las células del linaje B de ratón

La transferencia de linfocitos bm12 a un receptor C57BL/6 es un modelo establecido de lupus eritematoso sistémico. Aquí describimos cómo iniciar la enfermedad utilizando este modelo y cómo caracterizar las células T foliculares auxiliares, las células B del centro germinal y las células plasmáticas mediante citometría de flujo.

El inducible Modelo BM12 del lupus eritematoso sistémico (LES) en ratones C57BL / 6 ratones

Los linfocitos son los principales actores en las respuestas inmunitarias adaptativas. En este trabajo se presenta un protocolo de purificación de linfocitos para determinar las funciones fisiológicas de las moléculas deseadas en la activación de linfocitos in vitro e in vivo. Los procedimientos experimentales descritos son adecuados para comparar las capacidades funcionales entre linfocitos control y modificados genéticamente.

Aislamiento y activación de los linfocitos murinos

Factores epigenéticos pueden interactuar con programas genéticos que modulan la expresión génica y regulan la función de la célula de B. Mediante la combinación de la estimulación in vitro de células B, qRT-PCR y alto rendimiento microARN-secuencia y secuencia de ARNm enfoques, podemos analizar la modulación epigenética de miRNA y expresión genética en las células de B.

Genoma-ancha análisis de inhibidor de HDAC mediada por modulación de microRNAs y mRNAs en células B inducida por recombinación del ADN someterse a interruptor de clase y diferenciación de células plasmáticas

En este artículo se describe un protocolo para caracterizar las respuestas de isotipo de inmunoglobulina (Ig) T dependientes y T independientes en ratones usando ELISA. Este método se usa solo o en combinación con el flujo cytometry permitirá a los investigadores identificar las diferencias en las respuestas de isotipo de Ig mediada por células B en ratones después de la inmunización de antígenos T dependientes y T independientes.

Caracterización de las respuestas de isotipo de inmunoglobulina dependiente del timo y timo-independiente en ratones usando el análisis enzima-ligado del inmunosorbente

Aquí describimos un método para la sobreexpresión retroviral y la transferencia adoptiva de células murinas B-1a para examinar la migración celular in vivo B-1a y la localización. Este protocolo puede ampliarse para diversos ensayos funcionales posteriores, incluida la cuantificación de la localización celular del donante B-1a o el análisis de factores secretos derivados de células de donantes después de la transferencia adoptiva.

Sobreexpresión retroviral de CXCR4 en células murinas B-1a y transferencia adoptiva para la migración celular B-1a dirigida a la médula ósea y la producción de IgM

Aquí se presenta un ensayo para cuantificar la hipermutación somática dentro del locus genético de cadena pesada de inmunoglobulina utilizando células del centro germinal B de los parches del ratón Peyer.

Análisis de la hipermutación somática en el intron JH4 de células germinales del centro B de parches de Mouse Peyer

Describimos aquí un análisis simple de la heterogeneidad del compartimento de células B inmunes murinas en el peritoneo, el bazo y los tejidos de la médula ósea por citometría de flujo. El protocolo se puede adaptar y extender a otros tejidos de ratón.

Caracterización citométrica de flujo del desarrollo de células B murinas

En este protocolo, se describe un modelo de colitis por transferencia adoptiva de células T específicas de antígeno de la microbiota intestinal. Las células T CD4+ se aíslan de ratones transgénicos CBir1 TCR. Estos son específicos para un antígeno inmunodominante de la microbiota intestinal CBir1 flagelina, que se transfiere a los ratones Rag1-/- receptores, lo que lleva a la inflamación intestinal.

Inducción de la inflamación intestinal por transferencia adoptiva de células T CD4+ transgénicas CBir1 TCR a ratones inmunodeficientes

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Inducción y evaluación de la recombinación de cambio de clase en las células murinas purificada B

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