Inducción y evaluación de la recombinación de cambio de clase en las células murinas purificada B

Durante la respuesta inmunitaria humoral, las células B activadas por el antígeno proliferan y secretan anticuerpos a medida que avanza la respuesta. El isotipo de anticuerpo I GM predeterminado se sustituye por los isotipos más diversos IgG iga o IgE para evaluar la proliferación y el cambio de clase. Las células B esplénicas se aíslan in vitro de un ratón experimental mediante separación magnética de células.

Las células se tiñen con el colorante fluorescente CFSE para monitorear la proliferación, la cual se estimula mediante el tratamiento con L-P-S bacteriano. L-P-S también induce el cambio de clase al isotipo IgG3, el cual, junto con la proliferación, puede monitorearse mediante citometría de flujo. Hoy les mostraré una técnica para el aislamiento y activación de linfocitos B esplénicos puros. Esta técnica puede utilizarse para analizar la recombinación por cambio de clase y la proliferación in vitro, y también puede emplearse para responder preguntas clave en el campo de la inmunidad de los linfocitos B, incluyendo la función y regulación de la citidina desaminasa inducida por activación.

Comience por sumergir un ratón sacrificado en etanol al 70 %. El ratón debe tener entre ocho y doce semanas de edad. Para asegurar la maduración completa del sistema inmunológico, utilice tijeras estériles para hacer una incisión a través de la piel y el músculo del hipocondrio izquierdo del abdomen. Use tijeras o pinzas para extraer el bazo del tejido adyacente.

A continuación, córtelo en tres trozos grandes en PBS. Luego, utilizando el extremo de goma del émbolo de una jeringa de un mililitro, machaque suavemente el bazo a través de un filtro celular de 70 micrones hacia el PBS. Asegúrese de usar un movimiento de empuje en lugar de un movimiento de molienda.

Debido a que la molienda puede provocar la ruptura de células proliferantes más grandes, centrifugar las células a no más de 350 G durante cinco minutos. Luego, resuspender el precipitado en PBS.

Cuente las células resuspendidas utilizando un hemocitómetro en un tubo estéril de poliestireno de cinco mililitros. Prepare una suspensión de uno por diez a la octava potencia de células por mililitro en PBS con 5% de suero normal de rata. Se puede agregar un máximo de dos mililitros a cada tubo.

A continuación, añada 50 microlitros de cóctel de enriquecimiento de linfocitos B EP para selección negativa por cada mililitro de células. Luego, tape los tubos y colóquelos en el refrigerador durante 15 minutos.

Añada 100 microlitros de cóctel de selección biotinilado EP por cada mililitro de células. Tape las tubos y colóquelos en el refrigerador durante 15 minutos tras la incubación con la mezcla de nanopartículas magnéticas EP del cóctel de selección biotinilado y añada 100 microlitros por cada mililitro de células. Pipetee la mezcla, tape los tubos y colóquelos en el refrigerador durante cinco minutos.

Lleve la solución a 2,5 mililitros con PBS y coloque en un imán cept durante cinco minutos. Invierta el imán en el tubo y vierta rápidamente en un nuevo tubo de poliestireno. No agite el tubo, ya que las células seleccionadas negativamente estarán unidas magnéticamente a las paredes del tubo. Para aumentar aún más la pureza de la suspensión celular, coloque el nuevo tubo de células en el imán durante cinco minutos y luego viértalas nuevamente en un tubo nuevo.

Este paso puede reducir la recuperación total de células. La pureza de las células B se puede evaluar mediante análisis citométrico de flujo de marcadores de superficie de células B. Después del enriquecimiento, más del 95 % de las células deben ser positivas para B dos 20.

Re suspendió las células aisladas en PBS tibio suplementado con BSA al 0,1 %, a una concentración final de un millón de células por mililitro, a partir de una solución stock de cinco milimolar de colorante CFSE diluida en sulfóxido de dimetilo estéril. Añada dos microlitros por cada mililitro de células en el tubo. El CFSE se utiliza para monitorear la división celular de las células estimuladas.

Un proceso crucial para el cambio de isotipo. Una concentración final de 10 micromolar es óptima para la tinción de linfocitos B primarios. Incubar a 37 grados Celsius durante 10 minutos en la oscuridad.

Tenga en cuenta que el CFSE es sensible a la luz y debe mantenerse en la oscuridad tanto como sea posible. Tras la incubación, detenga la tinción añadiendo un volumen igual de suero de ternera a sus células e incube en hielo durante cinco minutos. Para lavar las células, complete los tubos con medio de cultivo; se debe añadir al menos cinco veces el volumen equivalente de medio para contrarrestar la viscosidad del suero de ternera y permitir que las células formen un precipitado, luego centrifugue a 350 G. Lave las células dos veces más con medio de cultivo; ahora las células están listas para la estimulación.

Prepare el medio de cultivo de linfocitos B in vitro suplementando el RPMI 1640 con 10% de suero bovino fetal y 50 micromolar de etanol Beto me capita. A continuación, prepare el medio de estimulación añadiendo LPS a una concentración final de 50 microgramos por mililitro. Alicote 125 microlitros del medio de estimulación en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos con fondo plano.

Prepare las células B teñidas con E CFS en medio de cultivo sin LPS a una concentración final de 3,2 × 10⁶ células por mililitro. Añada 125 microlitros de la suspensión celular a los pozos que contienen su medio de estimulación y mezcle pipeteando suavemente. Cada pozo contiene ahora 400 000 células en una concentración final de LPS de 25 microgramos por mililitro.

Esto proporciona niveles óptimos de proliferación celular y conmutación de clase. Aunque se pueden realizar alteraciones en estos valores según se desee, incubar las células a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 72 a 96 horas. Después de 48 horas, los grupos de grandes células B en proliferación serán claramente visibles bajo un microscopio para observar la conmutación de clase.

Retire las células del incubador y lávelas dos veces con un mililitro de tampón de tinción para evitar la tinción inespecífica de anticuerpos. Pelote las células centrifugándolas a 350 G. A continuación, re suspenda las células en 100 microlitros de tampón de tinción con 5 % de suero normal de ratón y un microgramo de bloqueador FC por millón de células, e incube durante 15 minutos en hielo sin lavar. Añada un anticuerpo secundario anti-IgG de US marcado con fluoróforo a una concentración de un microgramo por millón de células, incube durante 30 minutos en hielo, lave las células dos veces y re suspenda en doscientos a 300 microlitros de tampón de tinción.

Las células ya están listas para su evaluación mediante citometría de flujo. El CFSE se excita óptimamente a 492 nanómetros mediante un láser de ion argón y emite a 517 nanómetros. El espectro de excitación y emisión del anticuerpo IgG tres depende del colorante fluorescente al que esté conjugado.

Tras el enriquecimiento magnético, la suspensión celular debe presentar un aspecto homogéneo de una población de células pequeñas y circulares indistinguibles. Después de 48 a 72 horas de estimulación, se observarán claramente agrupaciones aisladas de células proliferantes agrandadas. Una gran parte de las células no proliferantes aparecerán pequeñas y granulares mientras experimentan apoptosis.

La RSC normalmente se puede detectar a los niveles más altos entre 72 y 96 horas después de la estimulación, antes de que la mayoría de las células comiencen a morir. En esta etapa, las células deberían haber experimentado varias divisiones celulares, con células conmutadas que aparecen en la población de células hijas posteriores. Tras seguir estos protocolos, otras técnicas como ARN, la inhibición génica mediada por AI pueden utilizarse para estudiar el efecto de cualquier gen sobre la función de un ID y el proceso de recombinación de conmutación de clase.