Reacción en cadena de la polimerasa de microesferas para amplificar el ADN monocatenario

La PCR de microesferas utiliza una esfera de tamaño micro acoplada a oligonucleótidos en su superficie, lo que permite la amplificación preferencial de ADN monocatenario.

Para comenzar la PCR de microesferas, tome una mezcla de reacción que contenga hebras de ADN monocatenarias, cebadores directos con una etiqueta de nucleótidos adicional, ADN polimerasa termoestable, dNTP y microesferas que muestren sondas de oligonucleótidos monocatenarios.

Coloque el tubo en un termociclador y hágalo funcionar en las condiciones definidas.

En el primer ciclo, a la temperatura de recocido, el ADN molde se une a la sonda en la superficie de la microesfera de modo que el ADN molde funciona como la hebra de detección. Durante la extensión, la polimerasa extiende el ADN y el dúplex permanece unido a la microesfera.

En el siguiente ciclo, durante la desnaturalización, el ADN molde se separa de la microesfera, dejando la hebra de la sonda unida a la superficie, sirviendo como molde para una nueva hebra.

Durante el recocido, el cebador marcado se une a la hebra antisentido. Más tarde, la polimerasa lo extiende para sintetizar la hebra de sentido con la etiqueta de nucleótidos.

Repita el ciclo varias veces para generar múltiples copias de ADN monocatenario detectado, que entran en la solución, mientras que los contaminantes bicatenarios permanecen unidos.

Transfiera los productos de PCR a un tubo que contenga un tampón de carga. Cargue el producto y los marcadores en diferentes pocillos del gel y sepárelos mediante electroforesis en gel de agarosa.

Los ADN molde forman una banda tenue de bajo peso molecular, mientras que una banda intensa de alto peso molecular confirma la amplificación del ADN monocatenario.