Name: RNAi detección de los factores del huésped implicados en Vaccinia Infección del virus utilizando Drosophila Celdas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-25T17:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Aprende a realizar un cribado de ARN de alto rendimiento para identificar factores del huésped implicados en la infección viral usando células de Drosophila. Este método permite descubrir nuevos factores celulares mediante microscopía de inmunofluorescencia.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIAID (R01AI074951, U54AI057168) y el Penn Genoma Fronteras Instituto de Carolina del Sur, de los NIH T32HG000046 de TSM, de los NIH y T32GM07229 T32AI007324 a LRS.

Parte 1: RNAi en 384 placas <ol><li> La estandarización de los reactivos utilizados para la investigación es esencial. Probamos lotes individuales de los medios de comunicación de Schneider, suero fetal bovino, y reactivos de coloración. Luego alícuota y el uso del mismo lote de toda la pantalla. </li><li> Para cualquier ensayo, lo mejor es probar varias líneas celulares diferentes para determinar cuál es más susceptible a la biológica de lectura. Por lo general el uso de la línea S2-DRSC. </li><li> Se cultivan las células Drosophila a 25 ° C en los medios de comunicación completa de Schneider. <ol class="lalpha"><li> Schneider medios de comunicación </li><li> 10% de SFB inactivado por calor </li><li> 1X L-glutamina </li><li> 1X penicilina / estreptomicina los antibióticos </li></ol></li><li> Las células de Drosophila son semi-adherente y se pasan sin tripsinización cada cuatro días con la pipeta las células de los frascos y la dilución de las células de 1:10 en un matraz fresco. Las células deben estar en fase de registro para los experimentos. </li><li> Placa a placa y la variabilidad del día a día se reducen al mínimo mediante el uso de manejo de líquidos automatizados para todas las adiciones a varios líquidos y placas. Utilizamos un WellMate (Matrix). </li><li> Preparar tubos WellMate. <ol class="lalpha"><li> Spray campana y WellMate con etanol al 70%. </li><li> Remueva el tubo de empaque y rociado con etanol al 70%. </li><li> Inserte un cassette tubería en la dispensación de la posición en la WellMate. </li><li> El primer tubo con 25 ml de etanol al 70%. </li><li> Esterilice los tubos en etanol durante 15 minutos, el entonces primer con otro de 25 ml de etanol. </li><li> Enjuague la tubería de la preparación con 50 ml de PBS estéril. </li></ol></li><li> Separar las células del frasco y el recuento. Precipitar las células para que tenga un 25% más de lo necesario (300xg, 5 min). El número de células sembradas por pocillo debe ser optimizada de acuerdo a la longitud de ensayo. Al llevar a cabo análisis automatizado de imágenes, una sola monocapa sin grumos de células es ideal para la segmentación de la imagen. </li><li> Volver a suspender las células sedimentadas en el suero libre de Schneider en los medios de comunicación 1.7x10 6 células / ml. </li><li> Realizamos la pantalla en 384 placas pre-alícuotas con una biblioteca disponible en el mercado de dsRNA a una concentración de 250ng/well. Varios pozos de cada placa se deja en blanco para los controles, que se añaden manualmente. Usamos dsRNA a luciferasa como control negativo. Usamos dsRNA contra Thread (DIAP) como control de sólidos RNAi. Derribar los resultados de este factor anti-apoptóticos de la muerte celular dramático y es una manera rápida visual para evaluar la calidad de la derribarlo. Por último, se utiliza un dsRNA viral contra el periodista, en este caso de beta-galacosidase, como un control positivo para validar que pueden inhibir la infección viral con nuestro ensayo de lectura. Si el goteo dsRNA en el plato en el momento de la siembra de células, una alícuota de dsRNA l en la esquina del pozo para permitir una mejor visualización, centrifugar dsRNA contra el fondo del pozo (300xg, 1 min) antes de añadir las células. </li><li> Use WellMate añadir 10 celdas l preparada anteriormente a cada pocillo. </li><li> Girar las células en las placas mediante la centrifugación de 300xg, 1 min. </li><li> Incubar en 25 ° C incubadora durante 45 minutos. </li><li> Añadir 20 l completo de Schneider medios de comunicación y centrifugar 300xg, 1 min. </li><li> Coloque las placas en humidificado recipientes Tupperware cubierto con toallas de papel empapado en agua. El volumen de un 384 y es pequeña, por lo tanto, la evaporación puede tener grandes efectos en la biología, que a su vez puede conducir a cambios de artefactos en las salidas de lectura de los pozos de borde. Para superar esto, las placas deben mantenerse en condiciones de humedad alta. </li><li> Incubar durante tres días para permitir la caída fuerte. No hay necesidad de cambiar los medios de comunicación o de abrir los contenedores humidificado durante este tiempo. </li></ol> Parte 2: Infección con el virus vaccinia <ol><li> Esterilizar multi-canal de aspiración en Quatricide durante 15 minutos, luego enjuague con etanol al 70%. </li><li> Prepare WellMate como se describió anteriormente. </li><li> Prepare los medios de comunicación de Schneider con FBS al 2% para la infección mediante la dilución de 1:05 completar medios de comunicación en medio libre de suero. </li><li> Acciones filtro de virus crudo a través de una jeringa 0,8 um filtro para eliminar los desechos celulares o el uso de virus purificado. </li><li> Diluir el virus vaccinia en el suero de Schneider 2% los medios de comunicación para obtener la multiplicidad de infección (MOI), de 2. </li><li> Quitar de la tubería WellMate PBS, e imprima con virus diluido hasta que el tubo esté libre de burbujas de aire. </li><li> Use esterilizados multi-canal de aspiración y colector de vacío para extraer con cuidado los medios de comunicación de las placas de dsRNA tratados con células de Drosophila. </li><li> Prescindir de 30 virus por pocillo en placas con el WellMate. </li><li> Centrifugar las placas 1 minuto a 300xg. </li><li> Esterilizar tubos WellMate. Primer con 25 ml de 10% bleach, espere 10 minutos, y la primera con otro de 25 ml de lejía al 10%. </li><li> El primer tubo con 50 ml de agua, seguido de 50 ml de etanol al 70%. Volver a la tubería de su embalaje. </li><li> Volver a las placas humidificado recipiente Tupperware. Se incuba a 25 ° C durante 48 horas. </li></ol> Parte 3: Placas de tinción <ol><li> Fijar placas en 15 l de formaldehído al 4% / PBS durante 10 minutos. Líquido se elimina con un aspirador de multi-canal y colector de vacío a cada paso. Una vez que las placas se han fijado, equipos y reactivos estériles ya no son necesarios. </li><li> Quitar reparar y utilizar WellMate añadir 30 l PBST (PBS + 0,1% Triton-X). Incubar 10 minutos y repita. Operar WellMate como se describió anteriormente, excepto el tubo no necesita ser esterilizado. </li><li> Para detectar la infección por vaccinia se utiliza un reportero β-galactosidasa impulsado por un promotor temprano / tardío vaccinia. </li><li> Eliminar las células de líquido y se incuba en el bloque (PBST con un 2% BSA) durante 10 minutos. </li><li> Diluir el anticuerpo primario en el bloque, eliminar el líquido y añadir 15 l de anticuerpos a cada pipeta repetir así el uso de múltiples canales (Matrix). </li><li> Girar las placas (300xg, 1 min), cubierta con una etiqueta clara, e incubar a 4 ° C durante la noche. </li><li> Eliminar el anticuerpo primario, y el uso de la WellMate para lavar los pocillos 3 veces con PBST, a 10 minutos cada uno. </li><li> Diluir el anticuerpo secundario marcado con fluorescencia (FITC) y la tinción nuclear en el bloque, y añadir 15 l de pozos utilizando una pipeta multicanal repetir. </li><li> Incubar las placas 1 hora a temperatura ambiente, protegido de la luz. </li><li> Lave los pozos en PBST 3 veces, 10 minutos cada uno con el WellMate. </li><li> Selle la placa con la etiqueta engomada transparente, tapar y guardar a 4 ° C hasta tres semanas. </li></ol> Parte 4: Imágenes y Análisis de Imágenes <ol><li> Utilizar un microscopio automatizado a 20X a las placas de la imagen. </li><li> Capturar imágenes de los núcleos total (DAPI) y las células infectadas (FITC). Optimizar el tiempo de exposición para cada canal por separado con el fin de maximizar el rango dinámico. </li><li> Ajustar la función de enfoque automático mediante la adopción de una pila Z de imágenes, 1um separados, que abarcan los aviones por encima y por debajo del plano de espera de atención. Una vez que el plano focal óptima se encuentra, ajustar la configuración de enfoque automático en consecuencia. </li><li> La imagen de toda la placa, la captura de al menos tres imágenes por bien tanto en el canal de Hoechst (DAPI) y el canal de virus (FITC). Elegir los sitios de distintas regiones dentro de un pozo con el fin de capturar las imágenes que representan el bien en su conjunto. </li><li> Use MetaXpress software para escribir un diario para segmentar la imagen y el uso de módulos de Conde núcleos para calcular el número total de células positivas para la tinción nuclear (el total de células) y la infección (FITC) para cada plato. </li><li> Calcular la infección por ciento (100 * Las células FITC positivos / total) y el registro de transformar. </li><li> Para identificar a los candidatos que utilizan un sólido puntaje Z basada en la mediana y rango intercuartil de cada plato. Este método no es sensible a los valores atípicos y los datos no simétrica, y por lo tanto proporciona una mayor potencia en la identificación de éxitos, incluso débil o moderada 10. Para cada plato, la mediana se resta de los datos de transformación logarítmica. A continuación, los valores resultantes se dividen por 0,74 veces el rango intercuartil (la diferencia entre los valores de la percentil 75 y el percentil 25). El factor 0,74 se utiliza para aproximar una distribución normal estándar. </li><li> El robusto puntaje Z es una medida de la distancia en desviaciones estándar de la mediana de la placa. Por ejemplo, un robusto Z-score de 2 indica que la infección% del pozo es de ~ 2 desviaciones estándar de la mediana o la placa de p &lt;0,05. </li><li> Analizar el número de células para identificar a los candidatos citotóxicos. Calcular el puntaje Z de robusta cuenta nucleares. Los candidatos con una sólida Z &lt;-2 en pantallas duplicadas son consideradas citotóxicos. </li><li> Los pozos que tienen un sólido puntaje Z para la infección por ciento de&gt; 2 o &lt;-2 en pantallas duplicadas (p &lt;0,0025), sin citotoxicidad se consideran candidatos potenciales de la pantalla principal. </li><li> Candidatos positivos son validados utilizando reactivos independientes. dsRNAs se generan en contra de los genes de interés de otra región del ARNm y probado que el anterior. </li><li> Los genes de los cuales dos dsRNAs independientes tienen el mismo fenotipo puede ser considerado para el estudio adicional. </li></ol> Parte 5: Imágenes Representante e interpretación de las tasas de infección <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Los pozos de la figura 1. Infectadas no muestran manchas de proteínas de virus de la vacuna, mientras que un representante de infectados y contiene células con tinción positiva para la vacuna-expresó beta-galactosidasa (βgal) de proteínas, medida por microscopía de inmunofluorescencia.Virus = verde, azul = núcleos. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Software automatizado de análisis de imágenes cuantifica la infección en cada imagen con los parámetros establecidos por el usuario. En una imagen representativa, el número total de núcleos celulares y el número de células que expresan el antígeno viral se contabilizan en función del tamaño y la intensidad de la tinción por encima de la tinción de fondo local. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Derribo de hilo (DIAP) sirve como un control positivo para el agotamiento de RNAi robusta de los genes diana. Caída de este factor anti-apoptóticos conduce a la muerte celular dramático. Núcleos = azul. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Derribo Figura 4. De la luciferasa sirve como control negativo para el efecto de la doble cadena de ARN en el tratamiento de la infección. El agotamiento de la luciferasa no tiene ningún efecto sobre la infección en relación con las células no se tratan. Virus = verde, azul = núcleos. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Derribo de la proteína βgal sirve como un control positivo de una reducción de la infección, ya que el ensayo utiliza los niveles de proteína βgal como una lectura de la infección. El agotamiento de los resultados βgal en una disminución en el porcentaje de células infectadas. Virus = verde, azul = núcleos. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Derribo de celulares factor de Rab5 resulta en una disminución en el porcentaje de células infectadas. Desde Rab5 se sabe que participan en la endocitosis, este factor probablemente contribuye a la entrada del virus vaccinia. Esto representa un valor atípico ejemplo de la pantalla. Virus = verde, azul = núcleos.

<ol><li>Ramadan, N., Flockhart, I., Booker, M., Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+implementation+of+high-throughput+RNAi+screens+in+cultured+Drosophila+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Design and implementation of high-throughput RNAi screens in cultured Drosophila cells.</a> Nat Protoc. 2, 2245-2264 (2007).</li>
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<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Echeverri, C. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+RNAi+screening+in+cultured+cells%3A+a+user%27s+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide.</a> Nat Rev Genet. 7, 373-384 (2006).</li>
</ol>

Todo el genoma de Drosophila RNAi de detección proporciona un método robusto y eficiente para el examen de los componentes celulares de la infección viral. Un número de virus que infectan a las células de mamíferos Drosophila, que puede ser utilizado para identificar los componentes de la respuesta inmune del huésped intrínseco, y los factores del huésped proteínas necesarias para la replicación viral que puede representar nuevas dianas terapéuticas. Antes de realizar una pantalla, el ensayo debe ser cuidadosamente optimizado para el tipo de células, el número de células, y el nivel de infección, y debe estar bien controlado, tanto positivos como negativos virales y dianas celulares 11. Es importante garantizar una separación suficiente entre los controles positivos y negativos previos a la selección para maximizar el rango dinámico de la prueba. Una vez que la pantalla se ha realizado, los candidatos se pueden dividir en categorías funcionales para determinar qué mecanismos de acogida contribuyen a la infección. De virus de mamíferos, tales como la vacuna, la contribución de los homólogos mamíferos de RNAi se debe determinar como parte del análisis secundario. En conjunto, estos métodos de detección robusta nos permitirá comprender mejor los complejos mecanismos por los cuales los virus interactúan con las células de su huésped.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Cultivo celular&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medio Schneider&amp;rsquo;s</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>11720</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 100X</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina (pen/estrept)</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Suero bovino fetal (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6178</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tamizaje&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biblioteca de ARNds a nivel del genoma</td><td>Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de 384 pocillos, negras con fondo transparente</td><td>Corning</td><td>3712</td><td></td></tr><tr><td>Selladores de aluminio</td><td>Corning</td><td>6569</td><td></td></tr><tr><td>Selladores transparentes</td><td>Denville Scientific</td><td>B1212-4</td><td></td></tr><tr><td>Well Mate</td><td>Matlab</td><td>201-10001</td><td></td></tr><tr><td>Manifold de 24 pasadores</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-101</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio automatizado ImageXpressMicro</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de análisis de imágenes MetaXpress</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rnai detección de los factores del huésped implicados en vaccinia infección del virus utilizando drosophila celdas

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Patógenos virales representan una amenaza para la salud pública, no sólo puede causar epidemias de virus natural de la enfermedad humana, pero su uso potencial en bioterrorismo es también una preocupación. Una mejor comprensión de los factores celulares que la infección por el impacto que faciliten el desarrollo de la muy necesaria la terapéutica. Los avances recientes en el ARN de interferencia (RNAi), junto con la tecnología de secuenciación completa del genoma de varios organismos ha llevado a la optimización de las pantallas de todo el genoma, a base de células de pérdida de función. Células de Drosophila son particularmente susceptibles a las pantallas a escala del genoma debido a la facilidad y eficacia de RNAi en este sistema 1. Es importante destacar que una amplia variedad de virus que pueden infectar a las células Drosophila, incluyendo un número de virus de mamíferos de importancia médica y agrícola 2,3,4. Anterior pantallas de RNAi en Drosophila se han identificado los factores del huésped que se requieren para diversas etapas de la infección por virus, incluida la entrada, la traducción y la replicación del ARN 5. Por otra parte, muchos de los factores celulares necesarios para la replicación viral en cultivo de células de Drosophila también son limitantes en las células humanas infectadas con estos virus 4,6,7,8, 9. Por lo tanto, la identificación de los factores del huésped cooptado durante la infección viral se presentan nuevos objetivos para la terapia antiviral. Aquí se presenta un protocolo generalizado de una pantalla de alto rendimiento RNAi para identificar los factores celulares implicados en la infección viral, utilizando virus vaccinia como un ejemplo.

Nuevos factores de acogida implicados en la infección viral puede ser identificado a través de celulares basados ​​en el genoma pérdida de la función de detección de RNAi. A<em&gt; Drosophila</emCelular&gt; modelo de cultivo es particularmente susceptible a este enfoque debido a la facilidad y la eficiencia de RNAi. Aquí se demuestra que esta técnica con<em&gt; Vaccinia</em&gt; Virus como un ejemplo.

RNAi detección de los factores del huésped implicados en Vaccinia Infección del virus utilizando Drosophila Celdas

Los patógenos virales representan una amenaza significativa para la salud pública; los virus no solo pueden causar epidemias naturales de enfermedades humanas, sino que su uso potencial en ...

El objetivo general de este procedimiento es utilizar un cribado de ARNi de alto rendimiento para identificar factores del huésped implicados en la infección viral. Esto se logra primero agotando los genes de interés mediante ARNi en placas de 384 pocillos. A continuación, las células se exponen al virus de interés, se tiñen para detectar proteínas virales y se analizan para medir la infección viral mediante microscopía de inmunofluorescencia. Finalmente, se realiza un análisis automatizado de imágenes para identificar genes candidatos para su validación y estudio posterior. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren cambios en la infección mediante la cuantificación del porcentaje de células infectadas utilizando microscopía de inmunofluorescencia. Esto permite el descubrimiento de nuevos factores celulares implicados en la infección viral.Aunque este método puede proporcionar información sobre las interacciones entre virus y hospedadores, también puede aplicarse al estudio de cualquier sistema que se beneficie del uso de una lectura visual del proceso celular de interés. Las personas nuevas en este método deben esperar una curva de aprendizaje pronunciada, ya que lograr infecciones reproducibles mientras se minimiza la variabilidad requiere una optimización considerable. Para garantizar la reproducibilidad de los resultados, es esencial utilizar un único número de lote para cada reactivo empleado en toda la pantalla. Cultive células de Drosophila S2DRSC en medio Schneider completo a 25 grados Celsius; las células deben estar en fase logarítmica.Para experimentos en una cabina de flujo laminar, desprenda las células semiadherentes del frasco mediante pipeteo vigoroso. Cuente en un hemocitómetro, transfiera el 125 % de las células necesarias para el experimento a un tubo cónico de 50 mililitros y centrifugue a 300 ×g durante cinco minutos. Aspire el sobrenadante y re suspenda el sedimento a una concentración final de 1,7 × 10⁶ células por mililitro en medio de Schneider sin suero.Utilice un sistema automatizado de manipulación de líquidos esterilizado y cebado. Aquí, la matriz de pocillos se empareja para minimizar la variabilidad entre placas. Añada 10 microlitros de suspensión celular a cada pocillo de una placa de 384 pocillos previamente revestida con 250 nanogramos por pocillo de ARN bicatenario. Centrifugue las células sobre las placas a 300 ×g durante un minuto.Incube las placas a 25 grados Celsius durante 45 minutos. Añada 20 microlitros de medio de Schneider completo a cada uno. Centrifugue brevemente el medio a 300 G durante un minuto para minimizar los efectos de la evaporación.Guarde las placas y los recipientes sellados humedecidos forrados con toallas de papel empapadas en agua. Incube a 25 grados Celsius durante tres días para permitir efectos robustos de silenciamiento en un gabinete de bioseguridad de nivel dos. Antes de infectar las células, filtre el stock crudo del virus vaccinia a través de un filtro de jeringa de 0,8 micrones.Para eliminar los restos celulares. Diluya el virus en medio Schneider con suero al 2% para obtener una multiplicidad de infección, abreviada como MOI de dos prima.El pozo esterilizado se combina con el virus diluido hasta que el tubo esté libre de burbujas de aire. Utilizando un aspirador multicanal esterilizado con un manifold de vacío, retire suavemente el medio de las placas de células de Drosophila tratadas con ARN de doble cadena. Añada 30 microlitros de virus diluido en cada placa.Centrifugar bien las placas a 300 G durante un minuto. Devolver las placas al recipiente humedecido e incubar a 25 grados Celsius durante 48 horas. En una cabina de seguridad biológica de nivel BSL-2, aspirar el medio de la placa.Luego, use una pipeta multicanal para agregar 15 microlitros de fijador de formaldehído al 4 % a cada pocillo. Incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Retire el líquido con un aspirador multicanal.Utilice el WELLMADE para agregar 30 microlitros de PBST a cada pozo. Incube los pocillos a temperatura ambiente durante 10 minutos. Realice un segundo lavado con PBST de 10 minutos de la misma manera.Elimine el líquido tras el bloque de incubación y agregue 30 microlitros de solución de bloqueo PBST con VSA al 2%. Incube a temperatura ambiente durante 10 minutos. Utilice una pipeta repetidora multicanal para añadir 15 microlitros de anticuerpo primario diluido en la solución de bloqueo a cada pozo.Centrifugar bien las placas a 300 G durante un minuto. Sellar cada placa con película adhesiva transparente e incubar a cuatro grados Celsius durante la noche. Utilizar el sellador de pocillos y el aspirador multicanal para lavar las células en PBST tres veces, durante 10 minutos cada lavado.Utilice un pipetador multicanal para agregar 15 microlitros de anticuerpo secundario marcado con fluorescencia y tinción nuclear a cada pozo. Cubra con papel de aluminio para proteger de la luz e incube las placas a temperatura ambiente durante una hora. Lave las células con PBST tres veces como antes, durante 10 minutos cada lavado.Añada 30 microlitros de PBST a las células y selle con una lámina transparente. Cubra con papel de aluminio. Almacene las placas selladas a cuatro grados Celsius durante hasta tres semanas antes de la imagenología en un microscopio automatizado.Los pocillos no infectados no muestran ninguna tinción para proteínas del virus vaccinia, mientras que un pocillo infectado representativo contiene células teñidas positivas para la proteína beta GCSEs expresada por vaccinia, según se mide mediante microscopía de inmunofluorescencia. Un software de análisis automatizado de imágenes cuantifica la infección en cada imagen utilizando parámetros establecidos por el usuario.En una imagen representativa, se cuenta el número total de núcleos celulares y el número de células que expresan el antígeno viral en función del tamaño y la intensidad de la tinción por encima del fondo local. La reducción de la tinción de thread sirve como control positivo para un agotamiento eficaz por ARNi de los genes diana. La inhibición de este factor antiapoptótico conduce a una muerte celular drástica.La inhibición de la luciferasa sirve como control negativo para el efecto del ARN bicatenario. El tratamiento con ARN no afecta la infección en comparación con las células no tratadas. La inhibición de la proteína beta-galactosídica sirve como control positivo para una reducción en la infección.Dado que el ensayo utiliza los niveles de la proteína beta galacto como indicador de la infección, la disminución de beta galacto provoca una reducción en el porcentaje de células infectadas. La inhibición del factor celular RAB cinco resulta en una disminución del porcentaje de células infectadas. Dado que se sabe que RAB cinco participa en la endocitosis, este factor probablemente contribuye a la entrada del virus vaccinia.Después de ver este video, debería tener una comprensión clara de cómo utilizar el cribado por ARNi en Drosophila para identificar factores del huésped que contribuyen a la infección viral, incluyendo la realización de ARNi, la infección con el virus vaccinia, la tinción, el análisis de imágenes y la evaluación de placas de 384 pocillos. No olvide que trabajar con el virus DIA puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como usar bata de laboratorio y gafas protectoras, durante la realización de este procedimiento. El virus vivo solo debe manipularse dentro de una cabina de seguridad biológica BSL-2, y todo material que haya estado en contacto con el virus vivo debe esterilizarse con lejía al 10 % antes de su eliminación.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

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Se describe un método sensible para identificar a los reguladores postembrionario de expresión de la proteína y su localización...

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En este video, describimos un procedimiento para realizar una nanoinyección de un virus de ARN monocatenario de sentido positivo en moscas Drosophila macho adultas y posteriormente estudiar las respuestas antivirales iniciadas debido a la infección. El análisis de la reacción en cadena de la polimerasa identifica la regulación positiva de genes específicos en las moscas infectadas que indican la activación de vías de respuesta inmunitaria, incluida la interferencia de ARN y la señalización...

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El objetivo de esta publicación es visualizar y discutir los pasos operativos de un protocolo de transferencia Northern mejorada en el ARN extraído de Drosophila melanogaster embriones, células y tejidos. Este protocolo es particularmente útil para la detección eficiente de pequeñas especies de ARN.

Mejorada del Norte Blot Detección de los Pequeños ARN Especies en Drosophila melanogaster

Aquí se describe un protocolo para el empleo de proyección de ARNi de alto rendimiento para descubrir destinos host que se pueden manipular para mejorar la terapia de virus oncolíticos, específicamente rhabodvirus y vaccinia virus terapia, pero puede adaptarse fácilmente a otros oncolíticos plataformas de virus o para descubrir genes de host que modulan generalmente replicación del virus.

Detección del genoma-ancha de RNAi para identificar los Host factores que modulan la terapia de Virus oncolíticos

Este método muestra cómo visualizar la invasión del patógeno en las células de los insectos con modelos tridimensionales (3D). Hemocitos de larvas de Drosophila estaban infectadas con patógenos virales o bacterianos, o ex vivo o en vivo. Hemocitos infectados luego fijados y teñidos para la proyección de imagen con un microscopio confocal y la posterior reconstrucción celular 3D.

Extracción de hemocitos de larvas de Drosophila melanogaster para infección microbiana y análisis

Aquí, presentamos los protocolos para identificar inmunomoduladores 1) virus-codificado que promueven la replicación de arbovirus y host 2) eucariotas factores que limitan la replicación de arbovirus. Estos métodos basados en fluorescencia y luminiscencia permiten a los investigadores obtener rápidamente lecturas cuantitativas de la replicación de arbovirus en análisis simplistas con proporciones bajas de señal a ruido.

Infecciones del arbovirus como herramientas de detección para la identificación de factores antivirales inmunomoduladores y anfitrión Viral

Este protocolo describe una metodología de microinyección que hemos estandarizado y utilizado durante varios años a entregar cantidades específicas de ácidos nucleicos directamente a la hemolinfa de los mosquitos y las moscas de casa. Este protocolo da lugar a mortalidad mínima inyección y permite dosis correlacionadas medidas de fecundidad.

DsRNA reproducible microinyección y bioensayo de oviposición de mosquitos y moscas de la casa

Este protocolo describe cómo establecer infección viral en vivo de Drosophila melanogaster utilizando el método de inyección de nano y técnicas básicas para analizar interacción virus-huésped.

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Este protocolo describe un ensayo de fagocitosis in vivo en adultos de Drosophila melanogaster para cuantificar fagocito reconocimiento y liquidación de las infecciones microbianas.

Evaluar el Cellular la respuesta inmune de la mosca de la fruta, Drosophila melanogasterutilizando un ensayo de fagocitosis en Vivo

Presentamos un protocolo utilizando un enfoque genético directo para la detección de mutantes que exhiben neurodegeneración en Drosophila melanogaster. Incorpora un ensayo de escalada, análisis histológico, mapeo genético y secuenciación de ADN para identificar en última instancia nuevos genes relacionados con el proceso de neuroprotección.

En Vivo Forward Genetic Screen para Identificar Nuevos Genes Neuroprotectores en Drosophila melanogaster

Aprende a realizar un cribado de ARN de alto rendimiento para identificar factores del huésped implicados en la infección viral usando células de Drosophila. Este método permite descubrir nuevos factores celulares mediante microscopía de inmunofluorescencia.

RNAi detección de los factores del huésped implicados en Vaccinia Infección del virus utilizando Drosophila Celdas

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