Name: Generación de ADN / ARN híbridos en el ADN genómico de transformación utilizando oligonucleótidos de ARN que contiene (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-24T18:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 42 s
Description: Aprende a generar híbridos ARN/ADN en cromosomas de levaduras vivas mediante transformación con oligonucleótidos que contienen ARN. Este método permite estudiar la transferencia de información genética del ARN al ADN genómico y evaluar la estabilidad de estos híbridos in vivo.

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Este trabajo fue apoyado por la Coalición de Georgia Cancer donaciones R9028.

Razón fundamental Explotar el uso de Thermo Scientific Dharmacon oligos, del 50 al 80-mers, aquí se presenta un procedimiento, basado en un ensayo de la corrección de genes, por lo que oligos puede transferir la información genética en el ADN genómico de células de levadura, después de recocido para la meta de ADN cromosómico. El éxito de la orientación por oligos se califica por la aparición de colonias de levaduras que muestra el fenotipo esperado. Si la modificación genética deseada se realiza en una o más ribonucleótidos incorporado en la secuencia oligo, la información genética fluye directamente de las vías de ARN para la meta de ADN cromosómico, por lo tanto, una forma de ARN / ADN híbrido en el nivel de los cromosomas durante el proceso de selección. La ribonucleótido / s de un Thermo Scientific Dharmacon contienen ARN oligo puede servir como plantilla para la orientación de genes a través de la síntesis de reparación del ADN o se puede integrar en el ADN y servir como plantilla durante la replicación del ADN. En estos experimentos se utiliza la levadura / Saccharomyces cerevisiae / modelo de sistema eucariota, sin embargo, un enfoque similar puede aplicarse también en otros organismos o tipos de células. En este vídeo, se utiliza un Thermo Scientific Dharmacon oligo diseñado con homología a un lugar de destino genómico de levadura y contiene un ribonucleótido en el medio para corregir una mutación en el gen diana. Después de la transformación con el oligo contiene ARN, se observa la corrección de la página dirigida a una determinada frecuencia, lo que indica que las vías de ARN del oligo podrían ser incorporados en el ADN cromosómico y servir como molde para la síntesis de ADN durante la replicación del ADN. La información genética dentro de la zona de ARN es estable transmitido a las generaciones siguientes de células. A continuación se describen los pasos de la transformación de células de levadura por la Thermo Scientific Dharmacon contienen ARN oligo y el enfoque para detectar la información de la transferencia de ARN en el ADN cromosómico. A. Diseño de la Oligo que contiene ARN utilizado en este experimento Hemos diseñado un oligo que contienen ARN para corregir un defecto genético en la levadura S. cerevisiae ADN cromosómico en el locus trp5. La cepa de levadura utilizada en el protocolo contiene un gen mutante trp5 con una deleción de dos bases y una mutación sin sentido (Figura 1). Cepa de levadura como es un mutante auxotróficos triptófano y no forma colonias en los medios de comunicación sin triptófano. La secuencia de ADN del gen TRP5 está disponible en la Saccharomyces Genome Database (http://www.yeastgenome.org/). El Thermo Scientific Dharmacon contienen ARN oligo utilizado en este protocolo es un 65-mer con una inserción de ADN de dos-base, diseñado para corregir la mutación por deleción y un ribonucleótido diseñado para corregir la mutación sin sentido del alelo trp5 (Figura 1). La secuencia del oligo está diseñado de la siguiente manera: 5'-AAAAGGGTTTTGATGAAGCTGTCG-CG-GATCCCACATTCTG-RG-GAAGACTTCAAATCCTTGTATTCT. Este oligo es sintetizada por Thermo Scientific Dharmacon (Lafayette, CO) en la escala de 200 nm, y desalado es, desprotegido y utilizado sin purificación PÁGINA. B. Preparación del Oligo que contiene ARN para la Transformación de la levadura (modificado de Storici et al., 2007 1) <ol><li> Limpie los materiales que serán utilizados para el experimento, con tubos de oligo, pipetas, vórtice, bastidores, área experimental y guantes usados ​​por el investigador con la solución de descontaminación RNasa para eliminar la contaminación potencial de RNasa antes de que comience todo. Use agua libre de RNasa, reactivos químicos, tubos y pipetas de todos los pasos. Cada paso en este experimento debe ser libre de RNasa. </li><li> Resuspender el Thermo Scientific Dharmacon contienen ARN oligo recibido de la empresa a 250 pmoles / l de solución madre con agua libre de RNasa y agitar vigorosamente para disolver el precipitado. Almacenar a -80 ° C. </li><li> Inmediatamente antes de la transformación, descongelar el oligo contienen ARN en el hielo y se diluye a 50 pmoles / ml con agua libre de RNasa en RNasa libre de los tubos. Cada transformación requiere un nmol de los oligos que contienen ARN. </li><li> Desnaturalizar una cantidad elegida de los oligos que contienen ARN en el bloque 100 ° C de calor durante 2 minutos para eliminar las estructuras secundarias de los oligos. </li><li> Inmediatamente después de la desnaturalización se coloca el tubo en hielo. Mantener en hielo hasta la transformación. </li><li> Como el control en el experimento de un ADN único correspondiente oligo se utiliza. Este oligo se descongela de -20 ° C y se preparó para la transformación de los oligo-ARN que contienen, como se describió anteriormente. </li></ol> C. La transformación de células de levadura con el Oligo que contiene ARN <ol><li> Inocular 5 ml de medio rico líquido YPD con la trp5 células de levadura mutante y crecer a 30 ° C durante la noche (ver Materiales). </li><li> La transferencia de 1,5 ml del cultivo de una noche en 50 ml de medio líquido YPD. </li><li> Se incuban las células en un agitador de 30 ° C (225 rpm) durante 4 horas. </li><li> Prepare la solución de uny Solución 2 inmediatamente antes de la transformación en RNasa libre de los tubos (ver Materiales). </li><li> Transferir el cultivo de células a un 50 ml RNasa libre de tubo y giran a 3000 rpm, lo que corresponde a 1.562 g, durante 2 minutos. El pellet de células de la precipitación es de aprox. 0.3 cm 3. </li><li> Eliminar las células sobrenadante y lavar con 50 ml de agua libre de RNasa y giran a 3000 rpm durante 2 min. </li><li> Repita el paso 6 por 5 veces para deshacerse del medio de cultivo y RNasas que podrían estar presentes en el medio tanto como sea posible. </li><li> Retire el sobrenadante y resuspender las células en 5 ml de la solución 1 y giran a 3000 rpm durante 2 min. </li><li> Eliminar las células sobrenadante y resuspender en 250 l de Solución 1. Esta cantidad de células es suficiente para 7-8 transformaciones. </li><li> Alícuota de 50 l de la suspensión celular en tubos de microcentrífuga de RNasa libre, se añaden 20 l de ARN que contiene la solución oligo de trabajo (1 nmol), o 20 l de ADN oligo única solución de trabajo (1 nmol), o 20 l de agua estéril sin oligo para el control negativo. A continuación, añadir 300 l de solución de 2 por cada reacción de transformación. No hay necesidad de añadir ADN de esperma de salmón en el proceso de transformación, como la Ley de oligos como portador de sí mismos. </li><li> Agitar vigorosamente para mezclar componentes de forma homogénea. </li><li> Incubar las reacciones de transformación a 30 ° C durante 30 minutos en una coctelera. </li><li> De choque térmico a 42 ° C durante 15 min. </li><li> Centrifugar las células a 5000 rpm, lo que corresponde a 2.236 g, durante 4 minutos. </li><li> Eliminar las células sobrenadante y resuspender en 100 l de agua estéril. </li><li> Tomar una alícuota de esta suspensión celular y se diluye con agua estéril de 100.000 veces y células de la placa en una placa de YPD con aprox. 15 perlas de vidrio estéril y se incuba a 30 ° C durante 2 días. </li><li> Placa de todas las células se resuspendieron en cada reacción de transformación de una placa de Petri de medio completo sintético sólido sin triptófano (SC-Trp) con aprox. 15 perlas de vidrio estéril y se incuba a 30 ° C durante 4-5 días (Figura 2). </li></ol> D. Análisis de la corrección de genes por el ARN que contienen Oligo <ol><li> Cuente el número de colonias crecidas en el medio selectivo (Figura 2), así como en medio YPD para calcular la frecuencia de corrección de genes para la oligo contienen ARN, el ADN oligo-y sólo para el control de no-oligo. Compare el número obtenido. La tasa de reversión espontánea de la trp5 alelos con la supresión de dos bases y la mutación sin sentido es inferior a 9.10 en la cepa de levadura que se usa, por lo tanto no esperamos la formación de colonias en el medio selectivo cuando no oligos se añaden a las células. </li><li> Racha de varias colonias transformantes seleccionados al azar en medio YPD para obtener aislados de una sola colonia. Esperar dos días para el crecimiento de la colonia, luego tomar varias (al menos 5) colonias aisladas y hacer parches en YPD y en medio selectivo. </li><li> Diseño de un par de cebadores para amplificar la región (250-1,000 pb) dirigido por el oligo contienen ARN por PCR colonia (fig. 1B). El procedimiento para la colonia PCR es la siguiente (modificado de Storici y Resnick, 2006 2). <ol><li> Suspender las células (aproximadamente 1 mm3) tomadas de los parches individuales en 50 l de agua y añadir una unidad de liticasa. Incube a temperatura ambiente durante 10 minutos, seguido de incubación en un bloque térmico a 100 º C durante 5 minutos para romper las células y el ADN genómico de la liberación en la solución. </li><li> Las condiciones de PCR: La reacción de PCR incluye 10 l de la solución de resuspensión celular, 50 pmoles de cada uno de adelante y atrás, 1 l de 10 mM dNTPs, 1 unidad de Taq polimerasa, 5 l de tampón 10x y se ajusta con agua estéril a una volumen final de 50 ul. El programa de PCR es de 3 min a 95 ° C, 30 ciclos de 30 s a 95 ° C, 30 s, a 55 ° C y 1 min a 72 ° C, un tiempo de extensión final de 7 min a 72 ° C, a continuación, las muestras se mantienen a 4 ° C. Una ampliación de tiempo de 1 min / kb se supone para esta reacción. </li><li> Tras la PCR, las muestras se ejecutan en un 1% o 2% (dependiendo del tamaño esperado del producto de PCR) en gel de agarosa para la observación del producto de PCR (Figura 3). </li></ol></li><li> Si la información genética transferida por el oligo contienen ARN genera un nuevo sitio de restricción en la región de la levadura objetivo genómica (fig. 1B), es posible verificar la correcta transferencia de información por parte de la digestión del producto de PCR con la enzima de restricción apropiada. Si no hay ningún sitio de restricción es generado por el oligo contiene ARN, vaya al paso 6. Digerir los productos PCR utilizando una enzima de restricción específica. La reacción de digestión con 6 l de producto de PCR, buffer, BSA (puede no ser necesario para algunas enzimas, consulte las instrucciones de la enzima que se utiliza), 0,5 l de enzima de restricción, y agua estéril a 15 microlitros. Las muestras se incuban durante 1 hora a la temperatura específica de la enzima utilizada. </li><li> Ejecutar una muestra no digerida, junto con las muestras digeridas en la misma fila de un 2% en gel de agarosa alobservar la modificación genética transferida por las vías de ARN del oligo que contienen ARN (Figura 3). </li><li> Purificar productos de PCR utilizando un kit de purificación de PCR y prepararlos para la secuenciación del ADN. Enviar muestras para secuenciar con los mismos cebadores utilizados para amplificar el producto. </li><li> Analizar los resultados de la secuenciación del ADN mediante un software que permite la alineación de secuencias múltiples con una secuencia de referencia elegido (Figura 4). </li></ol> E. alcalinos Tratamiento de la oligo que contienen ARN (Figura 5) <ol><li> Para cada reacción, se añade 1 nmol (4 l de 250 pmoles / l de solución madre) de los oligo contienen ARN o ADN oligo-en un tubo de 1.5 ml. </li><li> Agregar 4 l de NaOH 1 M para la hidrólisis, o bien añadir 4 l H 2 O como control negativo, y se incuba a 65 ° C en un baño de agua durante 1 h. A continuación, pasar de un baño de agua a hielo. </li><li> Neutralizar con 2 l de 1,2 M de HCl, 4 l de 1 l M Tris-HCl, y 4 de H 2 O, o, alternativamente, 6 l de H 2 O y 4 l de 1 M Tris-HCl de control negativo. Mantener en hielo hasta la transformación. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Diagrama esquemático de la defectuosa trp5 gen y del alelo TRP5 corregido por el oligo contienen ARN. A) El gen mutante trp5 contiene una deleción de dos-base (triángulos en negro) y una base de mutación sin sentido (asterisco). La única cadena de ARN que contiene oligo con la inserción de dos-base (azul bucle) y 1-ARN sustitución de base (rectángulo rojo) que genera un sitio Van91 I enzima de restricción (mostrado por el soporte) se transforma en células de levadura para corregir los defectos genéticos del gen trp5. B) Después de que el gen TRP5 es reparado por el oligo que contienen ARN (bases corregido se indican como rectángulos azules), el sitio Van91 que se genera en el gen TRP5. Un fragmento de 278 pb incluyendo sólo una Van91 sitio de restricción que en TRP5 gen está amplificado por PCR con un par de primers (P1 y P2). El 177 pb y 101 pb fragmentos generados tras la digestión de la P1 y P2 de productos PCR por Van91 que también se muestran. <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Resultado de la transformación con el oligo contienen ARN. A) Las células de levadura transformadas sin oligo no forman colonias en el medio SC-Trp, ver las placas AB. B) Las placas cg colonias de levadura muestran cada vez mayor en SC-Trp después que las células se transforman con un nmol de la oligo contienen ARN. C) Las placas hl colonias de levadura muestran cada vez mayor en SC-Trp después que las células se transforman con un nmol de la ADN-sólo oligo correspondiente control. <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. La detección de la transferencia de información genética del ARN que contiene oligo de ADN cromosómico de levadura por restricción de la digestión del producto de PCR amplifica la región genómica específica. 2% electroforesis en gel de agarosa de las muestras de PCR amplificado por P1 y P2 y se digiere con enzimas de restricción que Van91. Las calles 1, 8 y 15, escalera de ADN con tamaños de 100, 200, 300, 400 y 500 pb indica a la izquierda, calle 2, producto de PCR de trp5 lugar amplificado a partir del ADN genómico de la cepa mutante trp5, calle 3, PCR producto amplificado de ADN genómico derivados de una colonia Trp + dirigida por el oligo de ADN de sólo carril de 7.4, los productos de amplificación de PCR de ADN genómico derivados de Trp + colonias dirigidas por el oligo contiene ARN, calle 9 y 14 años, Van91 I restricción de la digestión de los productos PCR de los carriles de 2 a 7. La presencia de las bandas de los productos en bruto de PCR en los carriles de 10 a 14 se puede explicar por digestión parcial por Van91 I en el locus TRP5 (CCACATTCTGG). Teniendo en cuenta que el sitio de corte para Van91 I (CCANNNN NTGG) puede tener varias secuencias, el sitio genera en TRP5 no puede ser el objetivo más óptimo para la enzima. De hecho, el ADN después de la secuenciación de todo lo anterior, los productos de PCR se detecta ningún cambio adicional más allá de las realizadas por los oligos (ver Figura 4). Los 278 puntos básicos la banda de amplificación de PCR por P1 y P2 cebadores y las bandas de producto de digestión por Van91 I de 177 pb y 101 se muestran las flechas a la derecha. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2152/2152fig4.jpg"><img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig4tmb.jpg" border="0" alt="Figura 4Pulgar" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4Thumb"></a> Figura 4. Resultados de la secuenciación de ADN que muestran la corrección de genes por el ARN oligo-que contiene. A electroferograma ADN) de la región genómica orientada por el oligo contienen ARN. El G en la secuencia de ADN (en azul en caja) se deriva de la RG en el oligo contienen ARN. También en caja es la inserción de las bases CG. Resultados de la secuenciación de todos los demás productos de la PCR son también como CLEar como éste, con señales fluorescentes muy por encima del fondo. B) Las secuencias de la región TRP5 del Trp + transformantes dirigido por el oligo de ADN sólo (T1) y el oligo que contienen ARN (T2-T5) coinciden en la secuencia de consenso en la parte superior y se comparan con el de la trp5 células mutantes antes de la orientación por los oligos (ADN genómico, de color rojo con fondo gris). La reparación de ARN que contiene oligo en la parte inferior tiene dos base de la inserción del ADN y una base (G) la sustitución de ARN marcados en rojo. Las regiones en caja de color azul con la demostración de que el tono amarillo que contienen ARN oligo, así como el oligo de ADN sólo se corrige con precisión la mutación y la eliminación de mutación sin sentido en todas las muestras analizadas. Las líneas de puntos marcan la posición de la secuencia de ARN que contiene oligo. <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Tratamiento alcalino impide la corrección de genes por el ARN oligo-que contiene. La frecuencia de transformación por el oligo que contienen ARN (R) se muestra en la barra roja y que por el oligo de ADN sólo (D) se muestra en las barras azules. Las barras de error representan el error estándar de la media de tres transformaciones independientes para cada oligo. El ADN sólo se muestra la frecuencia oligo transformación similar con y sin tratamiento con NaOH. De otra manera, la frecuencia de transformación por el oligo contienen ARN cae a 0 tras el tratamiento con NaOH. Por lo tanto, la preparación con el oligo contienen ARN no está contaminado con ADN de sólo oligo, por lo tanto, la frecuencia de la transformación observada es específica para el oligo contienen ARN.

<ol><li>Storici, F., Bebenek, K., Kunkel, T. A., Gordenin, D. A., Resnick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-templated+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA-templated DNA repair.</a> Nature. 447, 338-3341 (2007).</li>
<li>Storici, F., Resnick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+delitto+perfetto+approach+to+in+vivo+site-directed+mutagenesis+and+chromosome+rearrangements+with+synthetic+oligonucleotides+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast.</a> Methods Enzymol. 409, 329-345 (2006).</li>
<li>Storici, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-mediated+DNA+modifications+and+RNA-templated+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">RNA-mediated DNA modifications and RNA-templated DNA repair.</a> Curr Opin Mol Ther. 10, 224-230 (2008).</li>
<li>Cerritelli, S. M., Crouch, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonuclease+H%3A+the+enzymes+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Ribonuclease H: the enzymes in eukaryotes.</a> FEBS J. 276, 1494-1505 (2009).</li>
</ol>

La producción de video para este artículo fue patrocinado por Thermo Fisher Scientific, que produce los reactivos e instrumentos utilizados en esta publicación.

El hecho de que el ARN puede transferir la información genética directamente al ADN genómico de las células fue descubierto explotar el uso de sintéticos que contienen ARN oligos (oligos Dharmacon sintetizado) 1. Era la prueba de principio de que las células pueden utilizar el ARN que contienen moléculas o secuencias de ARN-sólo como plantillas para la síntesis de ADN. El uso de ARN que contienen oligos no sólo condujo a la demostración de que la información genética se pueden transferir directamente a partir de ARN a ADN genómico sin la necesidad de una transcripción reversa de copias de ADN intermedios, sino también a la prueba de que el ARN puede ser utilizado como homóloga plantilla en la reparación de un daño en el ADN 1,3. Los oligos se puede hacer de ARN o de sólo contienen sólo un ribonucleótido único incrustado en una secuencia de ADN, como en el ejemplo que presentamos aquí. El oligo contienen ARN tiene un ribonucleótido código diseñado para corregir la mutación sin sentido en el genoma defectuoso trp5 alelo. La transferencia de información genética de la ribonucleótido en el ADN genómico se pone de manifiesto por un cambio en el fenotipo (células que crecen en el medio carecen de triptófano) de las células afectadas. La frecuencia de la corrección de genes obtenidos con el oligo que contienen ARN se mide y compara con la de un ADN de sólo el control oligo. Mediante la realización de este ensayo la corrección de genes en células diferentes orígenes, en la que mutan los genes de diferentes hongos, que puede detectar qué factor / s afectan específicamente a la orientación por los oligos que contienen ARN. Por lo tanto, puede revelar los mecanismos de cómo las células regulan la estabilidad del ADN / ARN de los híbridos. Simplemente el diseño de las diferentes variantes de los oligos que contienen ARN se puede determinar la probabilidad de una determinada zona de ARN para servir como modelo en la modificación del ADN y podemos determinar la estabilidad de las secuencias específicas de ARN incrustado en el ADN. Por otra parte, podemos identificar cuáles son las preferidas en los sustratos in vivo de factores que interactúan con el RNA / híbridos de ADN. Mientras que varios estudios in vitro, sobre todo la utilización de ARN corto oligos que contienen, se han realizado para caracterizar la función de los factores que pueden reconocer el ARN en un híbrido con el ADN, como las enzimas RNasa H 4, en funciones in vivo de RNasas H, así como la identidad de otras proteínas que podrían afectar ADN / ARN estabilidad híbridos siguen siendo en su mayoría desconocidos. La posibilidad de utilizar que contiene ARN oligos de una longitud considerable (50 a 80-meros) y una calidad óptima (por ejemplo, Thermo Scientific Dharmacon contienen ARN oligos) ha abierto el camino para examinar una amplia gama de procesos moleculares in vivo directamente en el las células de interés. Como se muestra en este video, con la transformación que contienen ARN oligos requiere esencialmente a sólo unos pasos adicionales en comparación con la transformación con las moléculas de ADN, para evitar la degradación por ARNasas. Por lo tanto, la transformación utilizando ARN que contienen oligos no se limita al sistema de la levadura, pero se puede aplicar a cualquier organismo o tipo de célula donde la transformación de ADN oligos es competente. En conclusión, por atacar a las células que contienen ARN oligos ofrece la oportunidad de generar híbridos de ADN / ARN y ribonucleótidos incrustado en el ADN in vivo en las células. La estabilidad, la función y sus consecuencias en vivo genera ARN / ADN híbridos pueden ser analizadas y caracterizadas, lo que podría revelar mecanismos desconocidos de reparación del ADN y revelando nuevas estrategias para la manipulación genética.

A. Transformación de los reactivos y los medios de comunicación (modificado de Storici y Resnick, 2006 <ol><li> YPD (levadura peptona dextrosa): Para 1 litro, 10 g de extracto de levadura, 20 g de soja peptona, 20 g de dextrosa. Agregar 15 g de agar YPD para los medios sólidos. Autoclave antes de su uso. Conservar a temperatura ambiente. </li><li> Solución 1: 0,1 M de acetato de litio. Preparar inmediatamente antes de la transformación. Una solución es una solución de trabajo, por lo que se prepara directamente a partir del polvo. No hay solución de reserva se hace. Mantener a temperatura ambiente. LiAc aumenta la permeabilidad de la pared celular de la levadura en el ADN. </li><li> Solución 2: 0,1 M de acetato de litio y el 50% de polietilenglicol 4000. También la solución 2 es una solución de trabajo y se hace directamente desde el polvo. No existe una solución madre se prepara. Mantener a temperatura ambiente. Depósitos PEG oligos en células de levadura. </li><li> Que contienen ARN oligos (Thermo Scientific Dharmacon), 50-80-mers, desalado, se desprotegió y no purificada. Volver a suspender a 250 pmoles / l. Almacenar a -80 ° C. </li><li> Sólo oligos de ADN, 50-80-mers, desalado y no purificada. Resuspender a 50 pmoles / l. Almacenar a -20 ° C. </li><li> SC-Trp (Synthetic medios completos carecen de triptófano) medio sólido. </li><li> 0,5 cm de diámetro perlas de vidrio, esterilizados en autoclave. </li><li> RNasa-off: la solución de RNasa de descontaminación. </li><li> DNasa / RNasa libre, tubos de centrífuga estéril. </li><li> DNasa / RNasa libre, tubos cónicos estériles. </li><li> DNasa / RNasa libre, estéril consejos aerosol con una pipeta ZAP: 100-200 ml, 100-1000 ml. </li></ol> B. Colonia PCR materiales. <ol><li> Cartilla de ADN, desalado y no purificada. Disolver en agua destilada a 50 pmoles / l. Almacenar a -20 ° C. </li><li> Taq ADN polimerasa, buffer, dNTPs. </li><li> Tubos para PCR. </li></ol> C. de purificación de PCR. <ol><li> PCR kit de purificación. </li></ol> D. electroforesis en gel. <ol><li> Agarosa. </li><li> 1 x TBE funcionamiento (45 mM mM Tris-borato y un tetraacetato etilendiamina) diluido de TBE 10x. </li><li> Prestained marcador de peso molecular. </li><li> ADN colorante de carga. </li></ol> E. restricción de la digestión. <ol><li> Las enzimas de restricción, los tampones de 10x, la BSA. </li></ol> F. álcali tratamiento para la oligo contienen ARN. <ol><li> 1 M de NaOH. </li><li> 1,2 M de solución de HCl. </li><li> 1 M de Tris-HCl, pH 7,4, solución. </li></ol>

generación de adn / arn híbridos en el adn genómico de transformación utilizando oligonucleótidos de arn que contiene

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Polímeros sintéticos cortos de ácidos nucleicos, oligonucleótidos (oligos), son las herramientas más funcionales y generalizada de la biología molecular. Oligos se puede producir para contener ADN o ARN deseado secuencia y se puede preparar para incluir una amplia variedad de base y las modificaciones de azúcar. Por otra parte, oligos pueden ser diseñados para imitar las alteraciones específicas de ácidos nucleicos y por lo tanto, puede servir como una herramienta importante para investigar los efectos de daño en el ADN y los mecanismos de reparación. Hemos encontrado que Thermo Scientific Dharmacon contienen ARN oligos con una longitud de entre 50 y 80 nucleótidos pueden ser particularmente adecuado para estudiar, en vivo, funciones y consecuencias de ARN cromosómico / híbridos de ADN y de ribonucleótidos incrustado en el ADN. ADN / ARN de los híbridos puede formar fácilmente durante la replicación del ADN, la reparación y transcripción, sin embargo, se sabe muy poco sobre la estabilidad del ADN / ARN de los híbridos en las células y en qué medida estos híbridos pueden afectar a la integridad genética de las células. Que contienen ARN oligos, por lo tanto, representan un vector ideal para introducir ribonucleótidos en el ADN cromosómico y generar ADN / ARN de los híbridos de longitud elegida y la composición de bases. Aquí se presenta el protocolo para la incorporación de ribonucleótidos en el genoma de la levadura modelo de sistema eucariota / Saccharomyces cerevisiae /. Sin embargo, nuestro laboratorio ha utilizado Thermo Scientific Dharmacon contienen ARN oligos para generar ADN / ARN de los híbridos a nivel cromosómico en los sistemas de células diferentes, desde las bacterias a las células humanas.

Este trabajo muestra cómo se forma un híbrido ADN / ARN a nivel cromosómico y revelar la transferencia de información genética de ARN a ADN genómico en células de levadura.

Generación de ADN / ARN híbridos en el ADN genómico de transformación utilizando oligonucleótidos de ARN que contiene

Los polímeros sintéticos cortos de ácidos nucleicos, los oligonucleótidos (oligos), son las herramientas más funcionales y extendidas de la biología molecular. Los oligos pueden ser...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en generar híbridos de R-N-A-D-N-A a nivel cromosómico en células de levadura vivas mediante la transformación de las células de levadura con oligos que contienen ARN. Esto se logra introduciendo un oligo de cadena sencilla que contiene ARN en células de levadura en división. A continuación, el oligo se apareará con la región complementaria de un gen marcador mutado ubicado en un cromosoma de levadura para formar un híbrido de R-N-A-D-N-A; en un segundo paso, las células transformadas mediante el oligo que contiene ARN se siembran en medios selectivos.Esto permite el crecimiento de células en las cuales la porción de ARN del oligonucleótido sirve como molde para la corrección del gen marcador mutado. A continuación, se cuentan las colonias de levadura que crecen en medios selectivos para determinar la frecuencia de corrección génica mediante el oligonucleótido que contiene ARN, obteniéndose resultados que revelan la transferencia de información genética desde la región de ARN del oligonucleótido hacia el gen marcador mutado en el genoma de la levadura. Esto es evidente a partir del análisis por digestión con enzimas de restricción, análisis de secuencia y el ensayo de labilidad alcalina.Hola, soy HIN fundador, el laboratorio de la Dra. Francesca en la escuela de biología del Instituto de Tecnología de Georgia. Hoy les mostraremos un procedimiento para generar híbridos de ARN-ADN a nivel cromosómico en células de levadura vivas. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar cómo las células toleran la presencia de ARN integrado en el ADN genómico y para determinar qué factores afectan la estabilidad de los híbridos de ARN-ADN in vivo.Así que comencemos. Antes de iniciar este procedimiento, limpie todos los materiales que se utilizarán en el experimento, incluyendo los tubos de oligonucleótidos, pipetas, gradillas para vórtex, el área experimental y los guantes usados por el investigador, con una solución de descontaminación para ARN. Para eliminar cualquier posible contaminación con ARN, utilice agua libre de ARN, reactivos químicos, tubos y puntas de pipeta libres de ARN durante todo el procedimiento.Obtenga un oligómero que contenga ARN para transferir información genética al ADN genómico de células de levadura. La cepa de levadura utilizada aquí contiene un gen trip cinco mutante con una deleción de dos pares de bases y una mutación sin sentido. Dicha cepa de levadura es un mutante atrófico de triptófano y no forma colonias en medios sin triptófano.El oligo que contiene ARN es un 65 MER con una inserción de dos bases de ADN diseñada para corregir la mutación por deleción. Además, el oligo tiene un ribonucleótido para corregir la mutación sin sentido del alelo trip cinco. Una vez obtenido, prepare el oligo que contiene ARN hasta una solución stock de 250 micromoles por litro según se describe en el protocolo escrito. Inocule 16 horas antes de la transformación con el oligo que contiene ARN.Cinco mililitros de medio líquido rico en levadura, péptido y dextrosa, o medio YPD, con las células de levadura mutantes trip cinco, y cultivar las células a 30 grados Celsius durante la noche. Tras la incubación nocturna, transferir 1,5 mililitros de la cultura nocturna a 50 mililitros de medio líquido YPD. Incubar las células en un agitador a 30 grados Celsius a 225 rotaciones por minuto durante cuatro horas inmediatamente antes de la transformación por descongelación.Los oligos que contienen ARN y los oligos correspondientes de solo ADN sobre hielo. Los oligos correspondientes de solo ADN se utilizan como control positivo. Diluya los oligos hasta 50 micromolar con agua libre de ARN en tubos libres de ARN.Prepare 70 microlitros de cada oligo para tener suficiente muestra para tres transformaciones de un mol con algo de exceso. Desnaturalice los oligos que contienen ARN y los oligos de solo ADN en un bloque térmico a 100 grados Celsius durante dos minutos para eliminar las estructuras secundarias de los oligos inmediatamente después de la desnaturalización. Coloque los tubos en hielo y manténgalos allí hasta la transformación. Prepare la solución uno y la solución dos inmediatamente antes de la transformación en tubos libres de ARN. Transfiera el cultivo celular a un tubo de 50 mililitros libre de ARN y centrifugue a 3000 rotaciones por minuto, correspondientes a 1.562 veces la gravedad, durante dos minutos.Elimine el sobrenadante y lave las células con 50 mililitros de agua libre de ARN. Centrifugue las células nuevamente a 3000 rotaciones por minuto durante dos minutos. Repita este proceso cinco veces para eliminar el medio de cultivo y cualquier ARN que pudiera estar presente tras la centrifugación final.Elimine el sobrenadante y re suspenda las células en cinco mililitros de solución uno. Centrifugue la muestra a 3000 rotaciones por minuto durante dos minutos, deseche el sobrenadante y agregue 250 microlitros de la solución uno a las células. Esta cantidad de células es suficiente para siete u ocho transformaciones.Aliquotar 50 microlitros de la suspensión celular en cada uno de siete tubos microcentrífugos libres de RNAsas. A continuación, añadir 20 de los 50 micromolares de oligo que contiene ARN en tres tubos, 20 microlitros del oligo de ADN al 50 micromolar en tres tubos y 20 microlitros de agua estéril sin oligo para el control negativo en un tubo.Luego, agregue 300 microlitros de la solución dos para cada una de las siete reacciones de transformación. Vortexee las muestras vigorosamente para mezclar los componentes. Incube las reacciones de transformación a 30 grados Celsius durante 30 minutos en un agitador tras la incubación.Sometan los muestras a un choque térmico a 42 grados Celsius durante 15 minutos. Luego centrifugen las células a 5.000 rotaciones por minuto, lo que equivale a 2.236 ×g, durante cuatro minutos. Retiren el agente SUP y resuspendan las células en 100 microlitros de agua estéril en muchas de tres tubos.Tome una alícuota de esta suspensión celular y diluya cada alícuota con agua estéril en un factor de 100 000. Añada aproximadamente 15 perlas de vidrio estériles por placa e inocule 100 microlitros de las células diluidas 100 000 veces en tres placas de medio YPD. Inocule 100 microlitros de las células resuspendidas de cada reacción de transformación en una placa de Petri con medio sintético completo sólido sin triptófano y agite las placas uniformemente.Luego, retire las perlas. Incube las células en placas de YPD a 30 grados Celsius durante dos días e incube las células en placas de medio sólido completo sintético sin triptófano a 30 grados Celsius durante cuatro a cinco días. Cuente y compare el número de colonias crecidas en el medio selectivo, así como en el medio YPD, para calcular la frecuencia de corrección génica para el oligo que contiene ARN, para el oligo de solo ADN y para el control sin oligo.No se espera formación de colonias en el medio selectivo cuando no se añaden oligonucleótidos a las células; siembra por estría varias colonias transformadas seleccionadas al azar en medio YPD para obtener aislados de colonias individuales. Incuba las células durante dos días a 30 grados Celsius para el crecimiento de colonias. Tras la incubación, selecciona varias colonias individuales y realiza trasplantes en medio YPD y en el medio selectivo.Se observa crecimiento en medio sólido sintético completo sin triptófano tras un día de incubación en las células transformadas con los oligos, pero no en la cepa control sin oligo en el medio sólido sintético completo selectivo sin triptófano. A continuación, diseñe un par de cebadores para amplificar la región diana del oligo de ARN mediante PCR de colonias para iniciar la PCR de colonias. Re suspenda las células tomadas de los parches individuales en 50 microlitros de agua que contenga una unidad de liasa, incube las muestras a temperatura ambiente durante 10 minutos, seguido de incubación en un bloque térmico a 100 grados Celsius durante cinco minutos para romper las células y liberar el ADN genómico en solución.Prepare las reacciones de PCR en tubos para PCR, añadiendo 10 microlitros de la suspensión celular a cada tubo y realice la reacción de amplificación según se describe en el protocolo escrito. Somete las muestras resultantes a electroforesis en un gel de agarosa al 1% para observar el producto de PCR. Dado que la información genética transferida por el oligonucleótido que contiene ARN en este experimento genera un nuevo sitio de restricción VAN 91 1 en la región genómica diana de la levadura, es posible verificar la transferencia correcta de la información digiriendo el producto de PCR con la enzima de restricción van 91 1.Prepare la reacción de digestión incluyendo seis microlitros de producto de PCR, tampón BSA y 0,5 microlitros de la enzima de restricción, y complete con agua estéril hasta un volumen final de 15 microlitros. Incube las muestras durante una hora a 37 grados Celsius. Corra una muestra no digerida junto con las muestras digeridas en la misma hilera de un gel de agarosa al 2% para observar la modificación genética transferida por el tracto de ARN del oligonucleótido que contiene ARN.Purifique los productos de PCR utilizando un kit de purificación de PCR y prepárelos para la secuenciación de ADN. Envíe las muestras para secuenciación con los mismos cebadores utilizados para amplificar el producto. Finalmente, analice los resultados de la secuenciación de ADN mediante un software que permita el alineamiento de múltiples secuencias con una secuencia de referencia elegida para realizar el tratamiento alcalino del oligo que contiene ARN para cada reacción con un mol del oligo que contiene ARN o del oligo solo de ADN en un tubo de 1,5 mililitros.Luego, agregue cuatro microlitros de hidróxido de sodio uno molar para la hidrólisis o cuatro microlitros de agua para el control negativo. Incube las muestras a 65 grados Celsius en un baño de agua durante una hora tras la incubación. Transfiera la reacción al hielo.Neutralice la reacción de hidrólisis con dos microlitros de ácido clorhídrico 1,2 molar, cuatro microlitros de tris clorhidrato 1 molar y cuatro microlitros de agua para el control negativo. Añada seis microlitros de agua y cuatro microlitros de tris clorhidrato 1 molar. Mantenga las muestras en hielo hasta que se pueda realizar la transformación.Como se acaba de describir, las células de levadura transformadas sin oligo no forman ninguna colonia en el medio sólido completo sintético sin triptófano fan. Por el contrario, las células crecidas en medio sólido completo sintético sin triptófano después de ser transformadas con un ole del oligo que contiene ARN ahora muestran colonias.Las colonias de levadura también crecen en medio sólido sintético completo sin triptófano después de que las células se transforman con un nanomol del oligonucleótido de control correspondiente; la detección de la transferencia de información genética desde el oligonucleótido que contiene ARN hacia el ADN cromosómico de levadura es evidente mediante la digestión con la enzima de restricción VAN 91-1 del producto de PCR que amplifica la región genómica diana, como se muestra. El producto de PCR del locus trip. Five amplificado a partir del ADN genómico de la cepa mutante trip. Five puede observarse.También se muestra el producto de PCR amplificado a partir de ADN genómico derivado de una colonia trip más, dirigida por el oligo de solo ADN. Los productos de PCR amplificados a partir de ADN genómico derivado de colonias trip más, dirigidas por el oligo que contiene ARN, también se separaron en el gel. Los resultados de la digestión con la enzima de restricción van 91 1 de los mismos productos de PCR revelan una banda amplificada de 278 pares de bases y las bandas de los productos de digestión por van 91 1 de 177 pares de bases y 101 pares de bases.La secuenciación de ADN revela la corrección génica mediante el oligonucleótido que contiene ARN aquí. Se muestra un electroferograma de ADN de la región genómica diana atacada por el oligonucleótido que contiene ARN. La g en la secuencia de ADN deriva del RG en el oligonucleótido que contiene ARN.También se muestra en un cuadro la inserción de las secuencias de bases CG en la región trip cinco de los transformantes trip más, dirigida por el oligo de solo ADN y el oligo que contiene ARN, que coinciden en la secuencia consenso y se comparan con la del trip. Células mutantes cinco antes de la edición mediante los oligos. El oligo inferior que contiene ARN para la reparación tiene una inserción de dos bases de ADN y una sustitución de una base de ARN.La región delimitada en azul con sombreado amarillo muestra que el oligonucleótido que contiene ARN, así como el oligonucleótido de solo ADN, corrigieron con precisión la mutación por deleción y la mutación sin sentido en todas las muestras analizadas; las líneas discontinuas marcan la posición de la secuencia del oligonucleótido que contiene ARN. El tratamiento alcalino impide la corrección génica mediante el oligonucleótido que contiene ARN; se muestra la frecuencia de transformación por el oligonucleótido que contiene ARN y por el oligonucleótido de solo ADN. Las barras de error representan el error estándar de la media para tres transformaciones independientes de cada oligonucleótido.El oligo solo de ADN muestra una frecuencia de transformación similar con y sin tratamiento con hidróxido de sodio. Por el contrario, la frecuencia de transformación mediante el oligo que contiene ARN cae a cero tras el tratamiento con hidróxido de sodio. Por lo tanto, la preparación con el oligo que contiene ARN no está contaminada con el oligo solo de ADN.Por lo tanto, la frecuencia de transformación observada es específica para el oligonucleótido que contiene ARN. Acabamos de mostrarle cómo formar un híbrido ARN-ADN a nivel cromosómico y la transferencia de información genética desde el ARN hacia el ADN genómico en células de levadura. Al realizar este procedimiento, es importante recordar utilizar oligonucleótidos de ARN de excelente calidad y trabajar en condiciones libres de ARN.Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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