Generación de ADN / ARN híbridos en el ADN genómico de transformación utilizando oligonucleótidos de ARN que contiene

El objetivo general del siguiente experimento consiste en generar híbridos de R-N-A-D-N-A a nivel cromosómico en células de levadura vivas mediante la transformación de las células de levadura con oligos que contienen ARN. Esto se logra introduciendo un oligo de cadena sencilla que contiene ARN en células de levadura en división. A continuación, el oligo se apareará con la región complementaria de un gen marcador mutado ubicado en un cromosoma de levadura para formar un híbrido de R-N-A-D-N-A; en un segundo paso, las células transformadas mediante el oligo que contiene ARN se siembran en medios selectivos.

Esto permite el crecimiento de células en las cuales la porción de ARN del oligonucleótido sirve como molde para la corrección del gen marcador mutado. A continuación, se cuentan las colonias de levadura que crecen en medios selectivos para determinar la frecuencia de corrección génica mediante el oligonucleótido que contiene ARN, obteniéndose resultados que revelan la transferencia de información genética desde la región de ARN del oligonucleótido hacia el gen marcador mutado en el genoma de la levadura. Esto es evidente a partir del análisis por digestión con enzimas de restricción, análisis de secuencia y el ensayo de labilidad alcalina.

Hola, soy HIN fundador, el laboratorio de la Dra. Francesca en la escuela de biología del Instituto de Tecnología de Georgia. Hoy les mostraremos un procedimiento para generar híbridos de ARN-ADN a nivel cromosómico en células de levadura vivas. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar cómo las células toleran la presencia de ARN integrado en el ADN genómico y para determinar qué factores afectan la estabilidad de los híbridos de ARN-ADN in vivo.

Así que comencemos. Antes de iniciar este procedimiento, limpie todos los materiales que se utilizarán en el experimento, incluyendo los tubos de oligonucleótidos, pipetas, gradillas para vórtex, el área experimental y los guantes usados por el investigador, con una solución de descontaminación para ARN. Para eliminar cualquier posible contaminación con ARN, utilice agua libre de ARN, reactivos químicos, tubos y puntas de pipeta libres de ARN durante todo el procedimiento.

Obtenga un oligómero que contenga ARN para transferir información genética al ADN genómico de células de levadura. La cepa de levadura utilizada aquí contiene un gen trip cinco mutante con una deleción de dos pares de bases y una mutación sin sentido. Dicha cepa de levadura es un mutante atrófico de triptófano y no forma colonias en medios sin triptófano.

El oligo que contiene ARN es un 65 MER con una inserción de dos bases de ADN diseñada para corregir la mutación por deleción. Además, el oligo tiene un ribonucleótido para corregir la mutación sin sentido del alelo trip cinco. Una vez obtenido, prepare el oligo que contiene ARN hasta una solución stock de 250 micromoles por litro según se describe en el protocolo escrito. Inocule 16 horas antes de la transformación con el oligo que contiene ARN.

Cinco mililitros de medio líquido rico en levadura, péptido y dextrosa, o medio YPD, con las células de levadura mutantes trip cinco, y cultivar las células a 30 grados Celsius durante la noche. Tras la incubación nocturna, transferir 1,5 mililitros de la cultura nocturna a 50 mililitros de medio líquido YPD. Incubar las células en un agitador a 30 grados Celsius a 225 rotaciones por minuto durante cuatro horas inmediatamente antes de la transformación por descongelación.

Los oligos que contienen ARN y los oligos correspondientes de solo ADN sobre hielo. Los oligos correspondientes de solo ADN se utilizan como control positivo. Diluya los oligos hasta 50 micromolar con agua libre de ARN en tubos libres de ARN.

Prepare 70 microlitros de cada oligo para tener suficiente muestra para tres transformaciones de un mol con algo de exceso. Desnaturalice los oligos que contienen ARN y los oligos de solo ADN en un bloque térmico a 100 grados Celsius durante dos minutos para eliminar las estructuras secundarias de los oligos inmediatamente después de la desnaturalización. Coloque los tubos en hielo y manténgalos allí hasta la transformación. Prepare la solución uno y la solución dos inmediatamente antes de la transformación en tubos libres de ARN. Transfiera el cultivo celular a un tubo de 50 mililitros libre de ARN y centrifugue a 3000 rotaciones por minuto, correspondientes a 1.562 veces la gravedad, durante dos minutos.

Elimine el sobrenadante y lave las células con 50 mililitros de agua libre de ARN. Centrifugue las células nuevamente a 3000 rotaciones por minuto durante dos minutos. Repita este proceso cinco veces para eliminar el medio de cultivo y cualquier ARN que pudiera estar presente tras la centrifugación final.

Elimine el sobrenadante y re suspenda las células en cinco mililitros de solución uno. Centrifugue la muestra a 3000 rotaciones por minuto durante dos minutos, deseche el sobrenadante y agregue 250 microlitros de la solución uno a las células. Esta cantidad de células es suficiente para siete u ocho transformaciones.

Aliquotar 50 microlitros de la suspensión celular en cada uno de siete tubos microcentrífugos libres de RNAsas. A continuación, añadir 20 de los 50 micromolares de oligo que contiene ARN en tres tubos, 20 microlitros del oligo de ADN al 50 micromolar en tres tubos y 20 microlitros de agua estéril sin oligo para el control negativo en un tubo.

Luego, agregue 300 microlitros de la solución dos para cada una de las siete reacciones de transformación. Vortexee las muestras vigorosamente para mezclar los componentes. Incube las reacciones de transformación a 30 grados Celsius durante 30 minutos en un agitador tras la incubación.

Sometan los muestras a un choque térmico a 42 grados Celsius durante 15 minutos. Luego centrifugen las células a 5.000 rotaciones por minuto, lo que equivale a 2.236 ×g, durante cuatro minutos. Retiren el agente SUP y resuspendan las células en 100 microlitros de agua estéril en muchas de tres tubos.

Tome una alícuota de esta suspensión celular y diluya cada alícuota con agua estéril en un factor de 100 000. Añada aproximadamente 15 perlas de vidrio estériles por placa e inocule 100 microlitros de las células diluidas 100 000 veces en tres placas de medio YPD. Inocule 100 microlitros de las células resuspendidas de cada reacción de transformación en una placa de Petri con medio sintético completo sólido sin triptófano y agite las placas uniformemente.

Luego, retire las perlas. Incube las células en placas de YPD a 30 grados Celsius durante dos días e incube las células en placas de medio sólido completo sintético sin triptófano a 30 grados Celsius durante cuatro a cinco días. Cuente y compare el número de colonias crecidas en el medio selectivo, así como en el medio YPD, para calcular la frecuencia de corrección génica para el oligo que contiene ARN, para el oligo de solo ADN y para el control sin oligo.

No se espera formación de colonias en el medio selectivo cuando no se añaden oligonucleótidos a las células; siembra por estría varias colonias transformadas seleccionadas al azar en medio YPD para obtener aislados de colonias individuales. Incuba las células durante dos días a 30 grados Celsius para el crecimiento de colonias. Tras la incubación, selecciona varias colonias individuales y realiza trasplantes en medio YPD y en el medio selectivo.

Se observa crecimiento en medio sólido sintético completo sin triptófano tras un día de incubación en las células transformadas con los oligos, pero no en la cepa control sin oligo en el medio sólido sintético completo selectivo sin triptófano. A continuación, diseñe un par de cebadores para amplificar la región diana del oligo de ARN mediante PCR de colonias para iniciar la PCR de colonias. Re suspenda las células tomadas de los parches individuales en 50 microlitros de agua que contenga una unidad de liasa, incube las muestras a temperatura ambiente durante 10 minutos, seguido de incubación en un bloque térmico a 100 grados Celsius durante cinco minutos para romper las células y liberar el ADN genómico en solución.

Prepare las reacciones de PCR en tubos para PCR, añadiendo 10 microlitros de la suspensión celular a cada tubo y realice la reacción de amplificación según se describe en el protocolo escrito. Somete las muestras resultantes a electroforesis en un gel de agarosa al 1% para observar el producto de PCR. Dado que la información genética transferida por el oligonucleótido que contiene ARN en este experimento genera un nuevo sitio de restricción VAN 91 1 en la región genómica diana de la levadura, es posible verificar la transferencia correcta de la información digiriendo el producto de PCR con la enzima de restricción van 91 1.

Prepare la reacción de digestión incluyendo seis microlitros de producto de PCR, tampón BSA y 0,5 microlitros de la enzima de restricción, y complete con agua estéril hasta un volumen final de 15 microlitros. Incube las muestras durante una hora a 37 grados Celsius. Corra una muestra no digerida junto con las muestras digeridas en la misma hilera de un gel de agarosa al 2% para observar la modificación genética transferida por el tracto de ARN del oligonucleótido que contiene ARN.

Purifique los productos de PCR utilizando un kit de purificación de PCR y prepárelos para la secuenciación de ADN. Envíe las muestras para secuenciación con los mismos cebadores utilizados para amplificar el producto. Finalmente, analice los resultados de la secuenciación de ADN mediante un software que permita el alineamiento de múltiples secuencias con una secuencia de referencia elegida para realizar el tratamiento alcalino del oligo que contiene ARN para cada reacción con un mol del oligo que contiene ARN o del oligo solo de ADN en un tubo de 1,5 mililitros.

Luego, agregue cuatro microlitros de hidróxido de sodio uno molar para la hidrólisis o cuatro microlitros de agua para el control negativo. Incube las muestras a 65 grados Celsius en un baño de agua durante una hora tras la incubación. Transfiera la reacción al hielo.

Neutralice la reacción de hidrólisis con dos microlitros de ácido clorhídrico 1,2 molar, cuatro microlitros de tris clorhidrato 1 molar y cuatro microlitros de agua para el control negativo. Añada seis microlitros de agua y cuatro microlitros de tris clorhidrato 1 molar. Mantenga las muestras en hielo hasta que se pueda realizar la transformación.

Como se acaba de describir, las células de levadura transformadas sin oligo no forman ninguna colonia en el medio sólido completo sintético sin triptófano fan. Por el contrario, las células crecidas en medio sólido completo sintético sin triptófano después de ser transformadas con un ole del oligo que contiene ARN ahora muestran colonias.

Las colonias de levadura también crecen en medio sólido sintético completo sin triptófano después de que las células se transforman con un nanomol del oligonucleótido de control correspondiente; la detección de la transferencia de información genética desde el oligonucleótido que contiene ARN hacia el ADN cromosómico de levadura es evidente mediante la digestión con la enzima de restricción VAN 91-1 del producto de PCR que amplifica la región genómica diana, como se muestra. El producto de PCR del locus trip. Five amplificado a partir del ADN genómico de la cepa mutante trip. Five puede observarse.

También se muestra el producto de PCR amplificado a partir de ADN genómico derivado de una colonia trip más, dirigida por el oligo de solo ADN. Los productos de PCR amplificados a partir de ADN genómico derivado de colonias trip más, dirigidas por el oligo que contiene ARN, también se separaron en el gel. Los resultados de la digestión con la enzima de restricción van 91 1 de los mismos productos de PCR revelan una banda amplificada de 278 pares de bases y las bandas de los productos de digestión por van 91 1 de 177 pares de bases y 101 pares de bases.

La secuenciación de ADN revela la corrección génica mediante el oligonucleótido que contiene ARN aquí. Se muestra un electroferograma de ADN de la región genómica diana atacada por el oligonucleótido que contiene ARN. La g en la secuencia de ADN deriva del RG en el oligonucleótido que contiene ARN.

También se muestra en un cuadro la inserción de las secuencias de bases CG en la región trip cinco de los transformantes trip más, dirigida por el oligo de solo ADN y el oligo que contiene ARN, que coinciden en la secuencia consenso y se comparan con la del trip. Células mutantes cinco antes de la edición mediante los oligos. El oligo inferior que contiene ARN para la reparación tiene una inserción de dos bases de ADN y una sustitución de una base de ARN.

La región delimitada en azul con sombreado amarillo muestra que el oligonucleótido que contiene ARN, así como el oligonucleótido de solo ADN, corrigieron con precisión la mutación por deleción y la mutación sin sentido en todas las muestras analizadas; las líneas discontinuas marcan la posición de la secuencia del oligonucleótido que contiene ARN. El tratamiento alcalino impide la corrección génica mediante el oligonucleótido que contiene ARN; se muestra la frecuencia de transformación por el oligonucleótido que contiene ARN y por el oligonucleótido de solo ADN. Las barras de error representan el error estándar de la media para tres transformaciones independientes de cada oligonucleótido.

El oligo solo de ADN muestra una frecuencia de transformación similar con y sin tratamiento con hidróxido de sodio. Por el contrario, la frecuencia de transformación mediante el oligo que contiene ARN cae a cero tras el tratamiento con hidróxido de sodio. Por lo tanto, la preparación con el oligo que contiene ARN no está contaminada con el oligo solo de ADN.

Por lo tanto, la frecuencia de transformación observada es específica para el oligonucleótido que contiene ARN. Acabamos de mostrarle cómo formar un híbrido ARN-ADN a nivel cromosómico y la transferencia de información genética desde el ARN hacia el ADN genómico en células de levadura. Al realizar este procedimiento, es importante recordar utilizar oligonucleótidos de ARN de excelente calidad y trabajar en condiciones libres de ARN.

Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.