Name: Mediada por adenovirus eliminación de moléculas de señalización genética en cultivos de fibroblastos de embriones de ratón primaria (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Aprende a eliminar genes condicionalmente en fibroblastos embrionarios de ratón usando adenovirus para entregar Cre recombinasa. Este método permite estudiar la función de Rac1 en la dinámica de actina con eficiencia cercana al cien por ciento.

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Los autores desean agradecer al Dr. Rizaldy Scott en el Hospital Mount Sinai en Toronto, Ontario por su don de la primaria Rac1 fibroblastos flox / flox de embriones de ratón. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de funcionamiento para NJ de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR, 2009-93.526 MOP) y el de Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC, RG 327372 a 06). SH y MW son apoyados por CGSMA y M-CGS premios de CIHR y NSERC, respectivamente. Steve Hawley Testamentos y Melanie contribuyeron igualmente a este trabajo.

Las células de descongelación <ol><li> Obtener los fibroblastos congelados embriones de ratón (MEFs) (generado previamente del cultivo de embriones primarios individuales) a partir de nitrógeno líquido. </li><li> Descongelar las células mediante la inmersión en el vial a 37 ° C con agitación hasta que se hayan descongelado por completo. </li><li> Añadir 9 ml de DMEM que se ha complementado con suero fetal bovino al 10% y 1% de penicilina-estreptomicina a una placa de cultivo celular de 10 cm. </li><li> Añadir la suspensión de células descongeladas, gota a gota a la placa, el rock suavemente la placa para dispersar las células de la placa y refrigerarla en un 37 ° C CO, 5% 2 incubadora durante la noche. Tenga en cuenta que si las células son sensibles a DMSO (del proceso de congelación), los medios de comunicación inicial puede ser sustituido por medio fresco después que las células se han adherido a la placa (aproximadamente cuatro horas después de la chapa). También tenga en cuenta que la confluencia de las células después de la descongelación dependerá del número de células congeladas, la tasa de recuperación de las células después de la congelación, y la tasa de crecimiento de las células. </li></ol> Las células de los pases <ol start="5"><li> Cuando las células han llegado a prácticamente el 100% de confluencia (por ejemplo: al día siguiente), aspirado de los medios de comunicación y lavar las células con 5 ml de PBS estéril. </li><li> Quitar PBS y añadir 1 ml de tripsina que contiene 10 mM EDTA y la placa de lugar en la incubadora durante unos 5 minutos para permitir que las células se desprenden de la placa. </li><li> Cuando las células se han desprendido, agregar 9 ml de los medios de comunicación a las células con tripsina, pipeta de 3.2 veces para dispersar a grupos, añadir 1 ml de esta suspensión, gota a gota en un plato nuevo que contiene 9 ml de los medios de comunicación, y este lugar en los 37 ° C incubadora durante la noche . La presencia de FBS en los medios de inactivar la tripsina, alternativamente, las células se pueden lavar primero a diluir la tripsina. </li></ol> Conteo de células y placas en la cubierta se desliza <ol start="8"><li> Eliminar las células de la incubadora, lavar y trypsinize como antes, excepto que esta vez añadir 5-6 ml medios de comunicación de nuevo a las células con tripsina en lugar de 9 ml. </li><li> Las células con una pipeta a fondo para asegurar la disociación completa en una única suspensión de células, y extraer 15μL para combinar con 15μL de azul tripán en un tubo de microcentrífuga separados. </li><li> Mezclar esta suspensión celular / azul tripán pipeteando arriba y abajo varias veces, y añadir 15μL del hemocitómetro. </li><li> Bajo el microscopio, las células muertas que aparecen en azul. Cuente el número de células claras / incoloro (que viven) en una de las redes de 4X4 en el hemocitómetro. Repita este cuenta con las otras tres redes de 4X4 (denominado A, B, C y D) y el uso de la siguiente ecuación para calcular el número de células por microlitro de la suspensión: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq0.jpg" alt="Ecuación 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="La ecuación 1"></li><li> A través de la optimización del protocolo, hemos determinado que el recubrimiento 30.000 resultados células de la densidad celular apropiada para la visualización a la conclusión del experimento. </li><li> Para calcular el volumen de suspensión celular necesario para 30.000 celdas, utilice la siguiente ecuación: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq1.jpg" alt="Ecuación 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="La ecuación 2"></li><li> A continuación, coloque una hoja de cubierta de vidrio estéril en cada pocillo de una placa de seis bien y añadir 2 ml de los medios de comunicación a cada pocillo, y luego añadir, gota a gota de la suspensión de su celular el volumen requerido por 30.000 células en cada pocillo. Tenga en cuenta que se desliza cubierta de vidrio se utilizan para este experimento que vamos a visualizar las células mediante microscopía de fluorescencia en un momento posterior, no todas las aplicaciones necesariamente requerirá de la microscopía, y por lo tanto la cubierta se desliza puede no ser necesaria. </li></ol> Virus de transducción <ol start="15"><li> Después de varias horas o (tiempo suficiente para asegurar que las células se adhieren a la cubierta se desliza) durante la noche, retire el material y lavar las células con 1 ml de suero libre de DMEM. </li><li> Añadir 1 ml de medio libre de suero a cada pocillo de la adición de los virus. Para este experimento, adeno-Cre virus se obtuvo comercialmente de Biolabs Vector. </li><li> Optimización de protocolos anteriores han demostrado que una multiplicidad de infección (MOI), de 500 proporciona transducción de genes de alta eficiencia en la atención primaria MEFs con poco o ningún efecto sobre la viabilidad celular. MOI se puede calcular de la siguiente manera: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq2.jpg" alt="Ecuación 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="La ecuación 3"> <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq3.jpg" alt="Ecuación 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="La ecuación 4"></li><li> Agregar el volumen calculado de virus directamente a cada uno, así que va a ser infectados, agite suavemente la placa para dispersar a los virus de las células y el lugar en la incubadora a 37 ° C durante la noche. </li><li> A la mañana siguiente, eliminar el virus que contienen los medios de comunicación de las células y lavar las células en 1 ml de PBS estéril y luego agregar 2 ml de los medios de comunicación regulares para cada pozo. </li><li> En el caso de las células de Rac1 se ejemplifica en este experimento, se produjeron cambios morfológicos en las células en aproximadamente 72 horas después de transducción. </li></ol> Resultados representante Las células se visualizand mediante la tinción con el colorante phalloidin actina (a efectos de imágenes solamente) y la imagen con el Leica TCS-SP5 multifotónica microscopio láser confocal de barrido en el Centro de Análisis Avanzados de la Universidad de Guelph. La figura 1 muestra la morfología alargada y contratados de la Rac1 flox / flox células que fueron expuestos a virus adeno-Cre en comparación con las mismas células no expuestas al virus. <img src="/files/ftp_upload/2160/2160fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Comparación entre Rac1 flox / flox células infectadas con virus adeno-Cre (izquierda) en comparación con las células no infectadas de la misma fuente (derecha).

<ol><li>Guo, F., Debidda, M., Yang, L., Williams, D. A., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Deletion+of+Rac1+GTPase+Reveals+Its+Critical+Role+in+Actin+Stress+Fiber+Formation+and+Focal+Adhesion+Complex+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Genetic Deletion of Rac1 GTPase Reveals Its Critical Role in Actin Stress Fiber Formation and Focal Adhesion Complex Assembly.</a> J. Biol. Chem. 281, 18652-18659 (2006).</li>
<li>Glogauer, M., Marchal, C. C., Zhu, F., Worku, A., Clausen, B. E., Foerster, I., Marks, P., GP, D. owney, Dinauer, M., Kwiatkowski, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac1+deletion+in+mouse+neutrophils+has+selective+effects+on+neutrophil+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rac1 deletion in mouse neutrophils has selective effects on neutrophil functions.</a> J. Immunol. 170, 5652-5657 (2003).</li>
<li>Prost, S., Sheahan, S., Rannie, D., Harrison, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+Cre+deletion+of+floxed+sequences+in+primary+mouse+cells+is+an+efficient+alternative+for+studies+of+gene+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated Cre deletion of floxed sequences in primary mouse cells is an efficient alternative for studies of gene deletion.</a> Nucleic Acids Res. 29, E80-E80 (2001).</li>
<li>Rijnkels, M., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-Cre-mediated+recombination+in+mammary+epithelial+early+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-Cre-mediated recombination in mammary epithelial early progenitor cells.</a> J. Cell. Sci. 114, 3147-3153 (2001).</li>
<li>Vidali, L., Chen, F., Cicchetti, G., Ohta, Y., Kwiatkowski, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac1-null+mouse+embryonic+fibroblasts+are+motile+and+respond+to+platelet-derived+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Rac1-null mouse embryonic fibroblasts are motile and respond to platelet-derived growth factor.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2377-2390 (2006).</li>
<li>Wang, H., Xie, H., Zhang, H., Das, S. K., Dey, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+gene+recombination+by+adenovirus-driven+Cre+in+the+mouse+uterus%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Conditional gene recombination by adenovirus-driven Cre in the mouse uterus.</a> Genesis. 44, 51-56 (2006).</li>
</ol>

Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por el Consejo Canadiense de los Animales.

El video que acompaña un ejemplo de cómo un virus recombinante se puede utilizar para extirpar un gen específico in vitro utilizando la recombinasa Cre. El desarrollo de este protocolo sin embargo, puso de manifiesto algunos puntos en particular vale la pena abordar. <ul><li> Los procedimientos de seguridad siempre se debe emplear cuando se trabaja con adenovirus. Una bata de laboratorio y se deben usar guantes en todo momento mientras trabaja con el virus. Los medios de comunicación y artículos de plástico deben ser tratados con lejía al 10% por lo menos durante 30 minutos, y utensilios de plástico deben ser esterilizados en autoclave a partir de entonces. </li><li> Evitar la repetición de congelación-descongelación del stock de virus ya que esto puede afectar a título de virus y por lo tanto reducen la eficiencia de transducción. Pequeñas cantidades de stock de virus debe ser, inicialmente alícuotas en tubos separados. </li><li> MOI que van desde 50 hasta 500 fueron probados durante el desarrollo del método y las tasas de eficiencia de transducción se observaron en la mayoría de los casos, sin efectos negativos sobre la viabilidad celular. </li><li> Adeno-GFP se utilizó también durante el desarrollo de métodos para detectar rápidamente la eficiencia de transducción. Este control (o un vector vacío) debe llevarse a cabo durante el experimento para asegurarse de que la infección viral por sí sola no resultará en cambios celulares. Del mismo modo, si la escisión del gen floxed de interés en sus células no se traduce en cambios celulares (es decir, cambios en la morfología o la viabilidad), y luego infectan el mismo tipo de células con virus adeno-GFP es un control importante utilizar para demostrar que la transducción de virus ocurriendo. </li></ul> Más allá del examen de las cascadas de señalización en la cultura, el enfoque de adeno-Cre también se ha empleado en vivo para eliminar condicionalmente genes de animales de experimentación 3,4, y para marcar poblaciones específicas de células de un organismo 6. El sistema de adenovirus también puede ser adaptado para introducir otros genes de la recombinasa Cre en las células huésped. Dos principales ventajas de la utilización de este vector de entrega son sus transducción de alta eficiencia y la entrega de genes, y la falta de integración con el ADN del huésped. Sin embargo, la generación de nuevos adenovirus recombinante puede ser mano de obra intensiva. El protocolo descrito aquí por lo tanto, aprovecha la potencia del sistema adenoviral mediante la explotación de los desarrollados anteriormente adeno-Cre virus, y el acoplamiento que con nuestro alelo floxed de interés, Rac1. A través de esta llamada condicional a cabo el experimento, hemos confirmado que la transducción con el virus adeno-Cre de MEFs que lleva un alelo Rac1 floxed en verdad causa la escisión de Rac1 que conducen a los cambios en la morfología celular característica de las células deficientes en Rac1 2,5.

<table><tbody><tr><td>Virus Ad-CMV-Cre</td><td>Vector Biolabs</td><td>1045</td><td></td></tr><tr><td>Medio DME de alta glucosa 500 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002201</td><td></td></tr><tr><td>Suero bovino fetal origen canadiense 500 mL</td><td>VWR international</td><td>CAA15-701</td><td></td></tr><tr><td>Solución 1X de PEN-ESTREP 100 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Faloídicina Texas Red-X</td><td>Invitrogen</td><td>T7471</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4549</td><td></td></tr></tbody></table>

mediada por adenovirus eliminación de moléculas de señalización genética en cultivos de fibroblastos de embriones de ratón primaria

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

La capacidad de eliminar genéticamente los componentes específicos de las diversas cascadas de señalización celular ha sido una herramienta fundamental en el análisis moderno de transducción de señales. Un método particular para lograr la supresión condicional es a través de la utilización del sistema Cre-loxP. Este método consiste en que flanquean el gen de interés con los sitios loxP, que son secuencias específicas de reconocimiento para la proteína recombinasa Cre. La exposición de los llamados floxed (flanqueado por sitios loxP) del ADN de esta enzima provoca un evento de recombinación Cre-mediada en los sitios loxP, y la escisión posterior de los genes que intervienen 3. Diferentes métodos existentes para administrar la recombinasa Cre en el sitio de interés. En este vídeo, que muestran el uso de un adenovirus que contiene el gen de la recombinasa Cre para infectar fibroblastos primarios de embriones de ratón (MEFs) obtenidas de embriones que contienen una floxed Rac1 alelo 1. Nuestra razón de ser para la selección de Rac1 MEFs para nuestros experimentos es que los cambios morfológicos claros se puede ver a la supresión de Rac1, debido a alteraciones en el citoesqueleto de actina a 2,5. 72 horas después de la transducción viral y la expresión de Cre, las células fueron teñidas con tinte phalloidin la actina y la imagen por microscopía confocal de barrido láser. Se observó que MEFs que habían estado expuestos al virus adeno-Cre aparecieron contratados y en la morfología alargada en comparación con las células no infectadas, de acuerdo con los informes anteriores 2,5. El método de adenovirus Cre recombinasa entrega es una ventaja ya que el virus adeno-Cre está fácilmente disponible, y la supresión de genes a través de Cre en casi el 100% de las células se puede lograr con la infección por adenovirus optimizado.

En este vídeo se utiliza un adenovirus que porta el gen de la recombinasa Cre para infectar fibroblastos primarios de embriones de ratón que lleva un alelo floxed Rac1.

Mediada por adenovirus eliminación de moléculas de señalización genética en cultivos de fibroblastos de embriones de ratón primaria

La capacidad de eliminar genéticamente componentes específicos de diversas cascadas de señalización celular ha sido una herramienta fundamental en la transducción de señales moderna...

El análisis genético moderno depende en gran medida de técnicas que facilitan la eliminación dirigida de genes específicos de células, órganos o organismos completos. Estos experimentos de eliminación génica ayudan a revelar la función del gen en su contexto celular. Los fenotipos moleculares, morfológicos y fisiológicos del mutante nulo proporcionan pistas sobre el papel de los productos génicos codificados por la secuencia eliminada.En organismos modelo como los ratones, un método común para lograr una eliminación génica condicional consiste en flanquear el gen o el exón de interés con sitios LoxP, que sirven como secuencias de reconocimiento para la enzima recombinasa Cre. La excisión irreversible del alelo denominado "floxed" es entonces catalizada por Cre, eliminando así la secuencia del genoma. Existen varios métodos diferentes para introducir la recombinasa Cre en el sistema, incluyendo aquellos realizados in vivo y aquellos que trabajan directamente con células establecidas.Para esta aplicación específica, utilizaremos un adenovirus para entregar Cree a células de fibroblastos que han sido aisladas y cultivadas a partir de un ratón transgénico que porta un alelo flock. Este método produce una eficiencia casi del 100 % en la entrega del transgén. Cuando el virus se administra a las células, es internalizado dentro de una vesícula endocítica y transportado hasta la envoltura nuclear, donde su ADN, incluido el transgén de interés, puede penetrar en el núcleo a través del complejo poroso.La maquinaria celular puede entonces transcribir el gen inyectado y permitir que sus productos proteicos actúen sobre la célula. En este caso, la enzima Cre Recombinasa codificada por el virus elimina el alelo flanqueado del genoma de la célula huésped. Somos del Laboratorio Jones en la Universidad de Guelph en Guelph, Ontario, Canadá.En nuestro laboratorio, estamos interesados en el concepto de transducción de señales y en lo que ocurre cuando se eliminan componentes específicos de diversas cascadas de transducción de señales. Hoy vamos a analizar una cascada relacionada con la organización de la actina. La transducción de señales se lleva a cabo mediante una serie de componentes bioquímicos que transmiten información y provocan cambios fenotípicos, como la reorganización de la actina.Nuestra proteína de interés es RAC1, una pequeña GTPasa que es importante para mediar la dinámica de actina, incluyendo la adhesión celular, la migración y la morfología. En esta investigación, utilizaremos el sistema CRE LAX P para eliminar este gen y confirmar su función en la célula. Previamente, se aislaron células de fibroblastos de embriones de ratón con un alelo rack flocado, un día 12 después de la fecundación.Estas células se colocaron luego en nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo, y comenzaremos descongelando un solo vial de estas células que representa un embrión. Al realizar experimentos de cultivo celular, es importante mantener un ambiente estéril. Esto implica limpiar las superficies expuestas de una cabina de flujo aprobada, así como rociar todas las botellas de reactivos y equipos de laboratorio que ingresen a la cabina con etanol al 70 %.Una vez que se haya preparado la cabina de flujo laminar, descongele las células sumergiendo el vial en un vaso de precipitados con agua a 37 grados Celsius hasta que el contenido esté líquido. A continuación, esterilice el vial con etanol al 70 % y luego agregue la suspensión celular gota a gota sobre una placa de 10 centímetros que contenga nueve mililitros de medio DMEM con alta concentración de glucosa, suplementado con 10 % de suero bovino fetal y 1 % de penicilina.Estreptomicina agite suavemente la placa para dispersar las células y colóquela en el incubador a 37 grados con 5%CO2, recordando etiquetar la placa con la información correspondiente. Por lo general, las células alcanzan 100% de confluencia dentro de las 24 horas. En este momento, podemos pasar las células a una nueva placa.Para hacer esto, comience aspirando el medio antiguo. Añada cinco mililitros de PBS estéril para lavar las células y luego elimine también este. Ahora añada un mililitro de tripsina que contenga EDTA 10 milimolar.Coloque la placa en el incubador a 37 grados durante aproximadamente cinco minutos para permitir que las células se desprendan del sustrato. Regrese a la cabina de flujo laminar y agregue nueve mililitros de medio nuevamente a la placa tratada con tripsina, diluyendo así las células en una proporción de uno a diez; aspire y expulse el líquido varias veces para romper los agregados celulares, luego retire un mililitro de la suspensión y añádalo gota a gota a nueve mililitros de medio fresco en una nueva placa de 10 centímetros. Nuevamente, agite suavemente la placa para dispersar las células y colóquela en el incubador a 37 grados.Cuando las células hayan alcanzado confluencia, el siguiente paso es sembrarlas sobre cubreobjetos de vidrio para poder observarlas mediante microscopía. Prepare las células utilizando la misma técnica empleada para el empaquetamiento, hasta el paso en que se agregan los trips a las células y se colocan en el incubador a 37 grados Celsius. Mientras las células se desprenden de la placa, prepare una placa de seis pocillos con cubreobjetos de vidrio, utilizando un cubreobjeto autoclaveado por pocillo.Una vez que las células se hayan desprendido de la placa, agregue cinco a seis mililitros de medio nuevamente a las células tratadas con tripsina. En la siguiente etapa del experimento, se realizarán conteos celulares para que un número adecuado de células pueda sembrarse y lograr una infección viral eficiente. Para contar las células, combine 15 microlitros de muestra con una parte igual de azul de tripano, pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar, y agregue 15 microlitros de esta solución al hemocitómetro.Las células muertas aparecerán azules. En esta preparación, cuente únicamente las células vivas o incoloras en la cuadrícula de cuatro por cuatro para calcular el número de células por microlitro. Comience contando las células en cuatro cuadrículas separadas, de la A a la D, y obtenga el promedio. Luego multiplique este valor por dos para compensar la dilución en azul de tripano.Dado que la cuadrícula contiene un décimo de microlitro, multiplique por 10 para expresar la cifra como células por microlitro. A continuación, determine el volumen requerido dividiendo el número deseado de células entre la concentración celular calculada previamente. Añada el volumen calculado de la suspensión celular gota a gota a cada pocillo de la placa de seis pocillos.Deje estas células en el incubador a 37 grados durante la noche. Al día siguiente, se añadirá virus a las células. El virus de Den Creek, obtenido de Vector B Labs, fue alícuotado y almacenado a 80 grados Celsius negativos.Recupere este virus y regresarlo a la campana de flujo laminar. Retire el plato de seis pocillos del incubador y llévelo a la campana. Aspire el medio y lave las células con un mililitro de DMEM sin suero.Ahora agregue un mililitro de medio sin suero a cada pocillo para la adición del virus. Para la aplicación viral, utilizamos una multiplicidad de infección o MOI de 500. Anteriormente se realizó la optimización del protocolo utilizando varias MOI y descubrimos que una MOI de 500 proporciona tasas de infección altamente eficientes con escaso o ningún efecto sobre la viabilidad celular.Para calcular la MOI, utilice la siguiente ecuación. Comience calculando el número de virus necesarios, lo cual puede lograrse multiplicando la MOI objetivo, en este caso 500, por el número de células por pocillo, es decir, 30.000. Para determinar el volumen del stock de virus que debe usarse, multiplique el número de virus por 1000 y divida este valor por la concentración inicial del virus. En este caso, agregaremos 1,5 microlitros de stock de virus a cada pocillo que deba infectarse.Agite suavemente la placa para dispersar el virus y coloque la placa en el incubador a 37 grados durante la noche. A la mañana siguiente, retire el medio vírico de las células, lávelas con PBS y añada dos mililitros de medio normal a las células. En este experimento, observamos que los cambios fenotípicos ocurrieron en las células aproximadamente a las 72 horas.Las células teñidas utilizando el colorante Acton se imagedon utilizando el microscopio confocal láser de barrido multiphoton Leica T-C-S-S-P cinco en el Centro de Análisis Avanzado de la Universidad de Guelph. Esto reveló cambios en la morfología entre células infectadas y no infectadas. Aquellas que carecen de RAC uno aparecen alargadas y delgadas en comparación con las células anchas y aplanadas que no estuvieron infectadas.Aquí hemos demostrado que el sistema de pliegue ADOC es un método robusto para la entrega eficiente de genes a células más allá del estudio de la transducción de señales. Sin embargo, también puedes utilizar este método para eliminar genes en animales experimentales o quizás para etiquetar poblaciones celulares específicas en un organismo. El sistema de adenovirus también puede usarse para introducir genes distintos de Cree al principio.Las ventajas del uso de este método de administración incluyen su alta afinidad, eficiencia y la ausencia de integración con el ADN de la célula huésped. Sin embargo, la generación de adenovirus comunes puede requerir mucho trabajo. Por lo tanto, el protocolo descrito aquí aprovecha el potencial del sistema adenoviral utilizando el virus ocre desarrollado previamente con nuestro RAC flocado uno mes mediante este knockout condicional, hemos demostrado que.Por lo tanto, la morfología depende en parte de la proteína GTPasa pequeña RAC1. En conclusión, desde el laboratorio de Jones queremos agradecerles por ver nuestro video y les deseamos mucho éxito en todas sus investigaciones futuras.

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