El método de cultivo de embriones de roedores enteros utilizando el sistema de tipo de botella rotador Cultura
28 de agosto de 2010
Toda técnica de cultivo de embriones de ratón nos permite la cultura y embriones de rata Ex vivo Condición durante períodos limitados correspondientes a las etapas mitad de la gestación. En este protocolo de video, demostramos nuestros procedimientos estándar de cultivo de embriones de ratas después de todo E12.5 utilizando el sistema de botella de los rotadores, el tipo de cultivo.
En biología del desarrollo, existen varios animales que se utilizan para los experimentos. La técnica agrícola de rotación de embriones se estableció en la década de 1950 y se desarrolló antes del establecimiento de la manipulación genética moderna en la agricultura hawaiana. El director debilitado tiene como objetivo directo áreas de crecimiento con muerte celular o transfección de genes, ya que los embriones pueden manipularse y observarse mediante microscopio; por lo tanto, el cultivo completo de embriones es una herramienta muy útil.
Cuando deseamos estudiar el proceso dinámico de desarrollo de embriones maorianos tras el desarrollo posimplantación, el crecimiento de los embriones maorianos depende críticamente del presentador funcional, lo que limita el período de cultivo. En general, podemos cultivar embriones durante el período del día embrionario 8.5 al 14.5 en la rata, y del E 6.5 al 12.5 en el ratón.
En el laboratorio, cultivamos embriones de rata y de ratón utilizando un sistema de cultivo rotatorio. Este sistema de cultivo es el más popular y adecuado para el cultivo de embriones de rata y de ratón durante la gestación avanzada, es decir, después del día E 11.5 en ratas y del E 9.5 en ratones.
En este video, nos gustaría presentar nuestro protocolo estándar para cultivo en condiciones de ayuno utilizando embriones RU de E 12.5. En estas condiciones, el embrión puede cultivarse durante dos días, lo cual es suficiente para examinar diversas manipulaciones efectivas en la agricultura hor. Hay dos pasos críticos para el éxito.
Primero, el procedimiento de disección debe ser preciso para no dañar al embrión, especialmente los vasos rodriguianos. Segundo, el procedimiento debe ser lo más rápido posible. Esto es especialmente cierto para los embriones más viejos.
Por ejemplo, en el caso de embriones de ratón E 10.5, estos deben transferirse dentro de los 30 minutos. Aplicamos la técnica de cultivo de embrión completo para empaquetar seis embriones mutantes de derecha. Por ejemplo, analizamos el patrón de migración de células neurore en el mutante marcando un pequeño número de células con colorante o trasplantando células de nivel en embriones de tipo salvaje y fondo mutado.
Además, hemos establecido un método de transferencia génica a embriones de ratón y de pez rojo en cultivo mediante electropermeabilización, que utiliza una descarga eléctrica. Podemos introducir fácilmente construcciones de genes exógenos, formas dominantes negativas y ARNip en la zona de los cerebros en desarrollo. Por lo tanto, podemos analizar fácilmente las funciones génicas mediante experimentos de pérdida y ganancia de función.
También investigamos el comportamiento de células niveladas con GFP o RFP utilizando cultivo de órganos o cultivo de secciones siguiendo, o agricultura. Así, puede realizar una variedad de experimentos usando el cultivo Lio en combinación con otras técnicas.
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Descripción general
Este protocolo en video demuestra la técnica de cultivo de embrión completo para embriones de rata posteriores al día E12.5, utilizando un sistema de cultivo en frascos de tipo rotatorio. Este método permite el cultivo ex vivo durante las etapas críticas de la media gestación.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Biología del desarrollo
- Embriología
- Técnicas de cultivo ex vivo
Antecedentes
- La técnica de cultivo de embrión completo ha estado establecida desde la década de 1950.
- Permite la manipulación de embriones para estudios genéticos.
- Los embriones pueden cultivarse durante períodos de desarrollo específicos.
- El crecimiento depende de la presencia funcional del embrión.
Objetivo del estudio
- Estudiar los procesos dinámicos de desarrollo de embriones tras la implantación.
- Proporcionar un procedimiento estandarizado para el cultivo de embriones completos.
- Facilitar la investigación en biología del desarrollo.
Métodos Utilizados
- Técnica de cultivo de embrión completo
- Sistema de cultivo en frasco de tipo rotatorio
- Condiciones ex vivo para embriones de rata
- Períodos de cultivo desde el día embrionario 8.5 hasta el 14.5
Resultados principales
- Cultivo exitoso de embriones de rata después de E12.5.
- Descripción de procedimientos estándar para la manipulación de embriones.
- Conocimientos sobre los períodos críticos de crecimiento de los embriones.
- Establecimiento de un método confiable para estudios futuros.
Conclusiones
- La técnica de cultivo de embrión completo es una herramienta valiosa en la biología del desarrollo.
- Permite el estudio del desarrollo embrionario en condiciones controladas.
- Los métodos estandarizados mejoran la reproducibilidad en la investigación.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El sistema de cultivo de embrión completo de tipo rotatorio (WEC) permite la manipulación directa y la observación de embriones de roedores durante las etapas críticas de la media gestación, apoyando la reducción de riesgos mecanicistas en las fases iniciales del descubrimiento. Esta plataforma ex vivo posibilita intervenciones genéticas y celulares precisas, facilitando la validación funcional de dianas y el análisis de vías antes de los estudios in vivo. Su reproducibilidad y adaptabilidad la convierten en un recurso valioso para la investigación traslacional y la selección de carteras en modelos de desarrollo y enfermedad.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la manipulación genética o celular directa para la validación funcional de dianas en embriones de mamíferos.
- Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al permitir estudios de pérdida y ganancia de función en un sistema controlado ex vivo.
- Facilita la aclaración de vías y la comprobación de hipótesis en puntos críticos de inflexión del desarrollo.
- Proporciona una plataforma para evaluar el impacto de intervenciones candidatas sobre el desarrollo embrionario.
Desarrollo y Evaluación de Pruebas
- Prepara sistemas embrionarios validados y manipulables para ensayos fenotípicos posteriores o ensayos mecanicistas.
- Permite la evaluación reproducible y cuantitativa de los resultados del desarrollo tras perturbaciones genéticas o químicas.
- Facilita la estandarización y escalabilidad de ensayos para estudios comparativos entre genotipos o intervenciones.
- Posibilita la evaluación confiable de la función de compuestos o genes en un contexto fisiológicamente relevante.
Investigación Traslacional y Preclínica
- Se alinea con las etapas del desarrollo relevantes para la enfermedad, lo que permite modelar trastornos congénitos o la función génica.
- Proporciona continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al permitir estudios mecanicistas en embriones intactos.
- Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo al aclarar tempranamente las vulnerabilidades del desarrollo en la fase inicial del proceso.
- Facilita el descubrimiento y la validación de biomarcadores en un sistema controlado y manipulable.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El sistema de CEW de tipo rotatorio sirve de puente entre el descubrimiento inicial y la investigación preclínica, ya que permite la manipulación basada en hipótesis y el análisis cuantitativo del desarrollo embrionario. Situado entre los ensayos in vitro y los modelos in vivo, ofrece una plataforma única para estudios mecanicistas y la reducción de riesgos de dianas terapéuticas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías mediante intervención genética o celular directa.
- Selección: Proporciona sistemas embrionarios listos para ensayos y reproducibles para lecturas fenotípicas cuantitativas.
- Análisis: Permite la medición de resultados del desarrollo, migratorios o moleculares para análisis comparativo.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos mecanicistas iniciales con la modelización preclínica de enfermedades y la validación de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma estandarizada y adaptable para uso repetido en múltiples programas de descubrimiento.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Proporciona flujos de trabajo ex vivo estandarizados, reproducibles y escalables para estudios de desarrollo.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al aclarar tempranamente el riesgo biológico.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización y el avance ajustados al riesgo de activos en fase de descubrimiento.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en embriología, microdisección y técnicas de manipulación ex vivo.
- Necesita instrumentación especializada para cultivo en frascos rotatorios y una infraestructura de microscopía adecuada.
- Exige una estandarización rigurosa entre equipos para garantizar la reproducibilidad y la comparabilidad de los datos.
- Puede ser necesaria una adaptación para diferentes cepas de roedores o etapas del desarrollo.
- El período de cultivo está limitado por la dependencia embrionaria de la función placentaria, lo que restringe la ventana de análisis.
