Name: Preparación de los tendones Cola de Rata de Estudios biomecánicos y Mechanobiological (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-30T17:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 12 s
Description: Aprende a preparar tendones de cola de rata para estudios biomecánicos y mechanobiologicos. Este método optimizado mantiene la viabilidad tisular y la integridad durante la extracción, medición y carga en bioreactor.

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Este artículo fue apoyada por NSERC # 299280 Grant, IRSST como una beca para los padres y G. FRSQ como un premio de investigación de estudiantes de pregrado de M. Cyr. Damos las gracias a Yoan Lemieux-Laneville para realizar las manipulaciones grabadas en video.

Antes de cualquier manipulación, debe identificar el grupo de tendones que se utilizan en función de la experiencia que están llevando a cabo y el aparato a su disposición. Para nuestros propósitos, los tendones ventral fueron elegidos porque son más pequeños y por lo tanto más fáciles de manipular en la medición de la sección transversal y ajustándolas a la cámara del biorreactor. Tenga en cuenta que todos los instrumentos son esterilizados en autoclave o con etanol al 70%. Por otra parte, una botella de aerosol que contiene 70% de etanol se coloca al lado de cada estación de trabajo para esterilizar los guantes experimentadores antes de cada operación. Parte 1: Extracción Después de la resección, la cola es cuidadosamente manipulada por sus extremos para evitar daños en los tejidos. Además, para conservar la viabilidad celular, todas las manipulaciones se llevan a cabo en solución salina fría. 1A) Materiales: <ul><li> Solución salina fría (D-PBS) </li><li> Hielo picado </li><li> Superficie protectora </li><li> Tabla de cortar </li><li> Manipulación de las placas individuales </li><li> 2 500 platos ml </li><li> Dos platos de vidrio 2L </li><li> Cinta adhesiva </li><li> 1 Pinzas </li><li> 1 pinza </li><li> 1 Pinzas de pie </li><li> 1 par de tijeras quirúrgicas </li><li> Un bisturí </li><li> 1 par de tijeras quirúrgicas <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Manipulación individual con la identificación de la orientación ("P" de "proximal") </li></ul> 1B) Estación de trabajo: <ol><li> Hacia fuera el protector de la superficie y el lugar de la tabla de cortar en la parte superior. </li><li> Llene cada dos grandes platos de cristal a la mitad con hielo picado y colócalos en el papel. </li><li> Pegue un pedazo de cinta adhesiva en una esquina de la placa de la manipulación y se identifican con una letra para indicar el extremo proximal. </li><li> Llena los dos platos pequeños de cristal a mitad de camino y todas las ranuras de las placas de la manipulación con la solución salina fría. Colocarlos en los platos de cristal grande que contenga hielo. </li><li> Organizar todos los instrumentos estériles en el protector de la superficie. </li><li> La transferencia de la cola en uno de los platos de vidrio que contiene una solución salina. </li></ol> 1C) Manipulaciones: <ol><li> Observar la anatomía en el extremo proximal de la cola para distinguir la cara ventral de la parte dorsal. La cara ventral tiene un mayor número de tendones y los vasos sanguíneos que puede ser verificado por una leve presión en la cola para producir pequeñas gotas de sangre. </li><li> Con las tijeras quirúrgicas, cortar la piel a lo largo de la cara dorsal de la cola, si se desea extraer los tendones ventral (oa lo largo de la parte ventral si necesita los tendones dorsales). </li><li> Abrir la incisión en el extremo proximal y quitar la piel con las pinzas o los dedos y por la manipulación cuidadosa de los extremos de la cola. </li><li> Enjuague la sangre y el pelo en la solución salina y la transferencia de la muestra en el plato de cristal restante que contiene una solución fresca. Cambiar los guantes. Una sección transversal se observa bajo microscopio de luz se muestran los grupos tendón de seis años. Un tendón de cada grupo se adjunta al final de cada vértebra caudal, por lo que cortar en el disco intervertebral para exponer los tendones nuevo a lo largo del corte. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Sección transversal de la cola de rata se observa bajo el microscopio óptico. </li><li> Corte el extremo distal a través del cartílago 2-3 vértebras más corta con tijeras quirúrgicas. Coloque la pieza en el tablero para cortar los tejidos blandos utilizando un bisturí y luego inmediatamente a colocarlo en la solución. </li><li> Con unas pinzas, sacar un tendón de la parte final distal. </li><li> Con un agarre suave en ambos extremos, el lugar del tendón en la placa de manipulación individual. Repita los dos últimos pasos hasta que no los tendones más se pueden extraer y cortar una vértebra más corto cada vez que nuevos tejidos necesitan ser expuestos. </li></ol> Parte 2: corte transversal medida del área 7 Cuando el tejido se somete a la caracterización mecánica o la estimulación, sus propiedades mecánicas están especificadas por la normalización de la fuerza en el interior del tendón con el estrés. Esta es la razón por la que evaluar la sección transversal. 2A) Materiales: <ul><li> Micrómetro óptico </li><li> Estereomicroscopio </li><li> Cámara digital </li><li> Borde de reconocimiento y los algoritmos de reconstrucción perfil 5,6 </li><li> Solución salina fría (D-PBS) </li><li> 1 20-200μL Micro pipetas de volumen </li><li> Una llave hexagonal de ajuste micrómetro óptico </li><li> 2 pinzas / Files/ftp_upload/2176/2176fig3.jpg "alt =" Figura 3 "/&gt; Figura 3. Micrómetro óptico </li></ul> 2B) Estación de trabajo: <ol><li> Abra el software (Cámara digital y algoritmos). </li><li> Coloque el micrómetro óptico de modo que haya espacio suficiente para cargar el tendón en el aparato. </li><li> Creación de los instrumentos y el plato de vidrio que contiene los tendones extraídos a mano. </li></ol> 2C) Manipulaciones: <ol><li> Llenar el compartimiento de medición con una solución salina fría hasta que los dos sistemas de anclaje están sumergidos. </li><li> Transferencia del tendón en el compartimiento mediante la celebración de los extremos con unas pinzas. </li><li> Mediante succión a través de la micropipeta de volumen, sacar un extremo a la vez en el tubo de silicona. Aspirar hasta el final se extiende más allá de los cuellos del eje. </li><li> Apretar los collares de eje para comprimir los tubos e instalar el aparato bajo el microscopio estereoscópico. </li><li> Con una ampliación de 105X, estirar los tendones mientras se observa el tejido hasta que las arrugas ya no son perceptibles. Tramo adicional de 0,40%. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Proyección del tendón con un aumento de 105x, antes y después del estiramiento. </li><li> Ajuste la posición y el enfoque para mantener una imagen clara del tendón en un rotación de 180 °. </li><li> Tomar una foto en cada rotación de 10 ° sin necesidad de modificar la tensión, el enfoque o la posición. Utilice sólo el eje de rotación para llevar a cabo la rotación. Debido a su forma de cono, estos pasos se pueden repetir en diferentes puntos a lo largo del tendón. </li><li> Activar el reconocimiento de borde y los algoritmos de reconstrucción de perfil con el fin de analizar la base de datos que ha registrado. </li><li> Libre del tendón aflojando los cuellos del eje y el soplado de aire en los tubos de silicona con la pipeta el volumen de micro. </li><li> Vuelva a insertar el tendón en la placa de la manipulación, una vez más la manipulación por los extremos. </li><li> Verificar la forma de la reconstrucción perfil obtenido y el valor de la sección transversal. </li></ol> Parte 3: Enjuague Para eliminar la contaminación que pueda haber ocurrido durante las manipulaciones anteriores, los tejidos se lavan en gabinete de bioseguridad. 3A) Materiales: <ul><li> Solución salina fría (D-PBS) </li><li> Múltiples ranura manipulación placa </li><li> Manipulación de las placas individuales </li><li> Cinta adhesiva </li><li> 2 pinzas </li><li> 1 Pinzas de pie </li></ul> 3B) Estación de trabajo: <ol><li> Encender el ventilador en el gabinete de bioseguridad 15 minutos de antelación y limpiar las superficies interiores con etanol al 70%. </li><li> Traiga todos los instrumentos dentro de la cabina de bioseguridad. </li><li> Palo trozos de cinta en una esquina de cada placa individual para identificar el extremo proximal. </li><li> Llenar todas las ranuras con una solución salina estéril. </li></ol> 3C) Manipulaciones: <ol><li> Introducir la placa de la manipulación que contiene el tendón extraído en el gabinete. </li><li> Con unas pinzas, quite el tendón de su plato con una comprensión suave en cada extremo. </li><li> Sumerja y revuelva suavemente el tendón en la solución salina en cada compartimento de la placa de la manipulación de múltiples ranuras, a partir de la más cercana y de proceder a la ranura más lejana. </li><li> Por último, se sumergen en el tendón de una placa de manipulación individual. </li></ol> Parte 4: Carga en la cámara de biorreactor Para evitar una mayor contaminación, las manipulaciones siguientes también se llevó a cabo en la cabina de bioseguridad. 4A) Materiales: <ul><li> Biorreactor de 4 cámaras </li><li> Ancla estéril </li><li> Una placa de Petri estéril </li><li> Media celda fría cultivo (DMEM) </li><li> Cianoacrilato </li><li> 2 pinzas </li><li> Pinzas de pie </li><li> 0.5-10μl de micro-pipeta de volumen </li><li> 1 Regla <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Biorreactor de cámara </li></ul> 4B) Estación de trabajo: <ol><li> Desde el paso anterior se realizó también en gabinete de bioseguridad, la eliminación de herramientas innecesarias le dará más espacio de trabajo. </li><li> Lleve todos los otros instrumentos en el interior del gabinete. </li></ol> 4C) Manipulaciones: <ol><li> Coloque un ancla en la placa de la manipulación con su carrete centrado sobre el extremo del tendón y la herida de tejido y alrededor de la bobina. </li><li> Rodar el ancla más y mantener la extremidad suelta al tiempo que garantiza que el tejido permanece unida al ancla. Parar después de ¾ de vuelta. </li><li> Llevar a cabo la mismapasos con el otro extremo. </li><li> Rollo de los dos anclajes en igual hasta que es de 6 cm entre sus centros 1. </li><li> Afloje el tendón que lo sumergen en la solución y permitir que las secciones anclado en seco breve para mejorar sus propiedades mecánicas 2.3. </li><li> Vierta cianoacrilato en la placa de Petri y sacar 2.5μL en la pipeta de volumen micro. </li><li> Aplique una gota de cianoacrilato para el tejido de la herida, sin dejar caer el pegamento en la solución salina. Repita la operación hasta 2 gotas se han aplicado a cada ancla. </li><li> Con el tendón todavía completamente sumergido, espere 5 minutos para que el pegamento se seque por completo. </li><li> Durante este tiempo, para llenar el compartimiento de cámara con solución salina. </li><li> Rehidratar todo el tejido con una solución salina para evitar daños. </li><li> Sólo mediante la manipulación de las anclas, la transferencia del tendón en la cámara de bioreactor y cerrarlo para evitar fugas y la contaminación durante la transferencia. </li></ol> Parte 5: Resultados del representante: El resultado del protocolo muestra que cuando se realiza correctamente, el aislamiento del tejido riguroso procedimiento de preparación que sea posible para mantener la esterilidad del tejido, la viabilidad y la integridad. En primer lugar, utilizando el método de extracción simple y repetitivo, que son capaces de extraer los tendones de cola sin dañar la red de colágeno, ya que puede ser observado por un análisis microscópico de las secciones de H &amp; E contaminada se dio cuenta después de la extracción. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Red de colágeno del tendón después de la extracción (5μm sección longitudinal teñidos con H &amp; E). A continuación, los tendones se cultivaron durante un máximo de diez días y llevó a cabo pruebas de esterilidad. Cada día, plateado solución utilizada cultivo en agar y se incubó durante 24 horas. Dado que no se observó el crecimiento bacteriano, llegamos a la conclusión de que nuestras manipulaciones no dan lugar a la contaminación. Con el algoritmo de reconstrucción de perfil y un micrómetro óptico, podemos estimar el área transversal dentro de un margen de error del 2% 7. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig7.jpg" alt="Figura 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 7"> Figura 7. Reconstrucción perfil de un RTT. Finalmente, se evaluó la viabilidad de usar el LIVE / DEAD viabilidad / citotoxicidad kit de células de los mamíferos después del paso de enjuague y después de un período de cultivo de doce días. Dado que una gran mayoría de verde fluorescente las células vivas se hicieron evidentes, podemos afirmar que nuestros procedimientos de aislamiento tienen éxito en la preservación de los tejidos vivos. La misma prueba se llevó a cabo dos horas después de fijar el tendón en la cámara del biorreactor. Se verificó que la deshidratación y la cola en el ancla no se había extendido en el tejido entre los dos anclajes. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig8.jpg" alt="Figura 8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 8"> Figura 8. Viabilidad de los tejidos en el ancla (verde = células vivas, rojo = las células muertas)

<ol><li>Bennett, M. B., Ker, R., Dimery, N., Alexander, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+various+mammalian+tendons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Zool.+Lond%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of various mammalian tendons.</a> J. Zool. Lond. A209, 537-548 (1986).</li>
<li>Dupuis, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22D%C3%A9shydratation+de+matrices+collag%C3%A9niques+reconstruites+in+vitro%3A+effets+sur+les+propri%C3%A9t%C3%A9s+m%C3%A9caniques+et+histologiques+%5B%5D%22">Déshydratation de matrices collagéniques reconstruites in vitro: effets sur les propriétés mécaniques et histologiques [dissertation]</a>. , Québec, Université Laval. Québec. 114-114 (1981).</li>
<li>Haut, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+influence+of+strain+rate+on+the+tensile+failure+of+rat+tail+tendon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Age-dependent influence of strain rate on the tensile failure of rat tail tendon.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 105, 296-299 (1983).</li>
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</ol>

Mediante la aplicación de los procedimientos experimentales, podemos realizar una gran variedad de estudios in vitro de este tipo de tejidos. Como por ejemplo, un estudio sobre la degeneración de los tejidos se llevó a cabo mediante la aplicación de los menores de la estimulación de RTT por un período de diez días. Cada día, se evaluaron las propiedades mecánicas del tejido en los ensayos no destructivos de relajación de tensiones. Al final, hemos sido capaces de observar la variación de estrés RTT y por lo tan...

<table><tbody><tr><td>D-PBS </td><td>Reactivo</td><td>Wisent Inc.</td><td>311-410-CL</td><td>Solución salina</td></tr><tr><td>Glucosa </td><td>Reactivo</td><td>Wisent Inc.</td><td>609-037-EL</td><td>Solución salina&lt;br/&gt;1g/L</td></tr><tr><td>Antibióticos-antimicóticos </td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Solución salina&lt;br/&gt;1%</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>12800-017</td><td>Solución de cultivo</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Reactivo</td><td>Wisent Inc.</td><td>600-105-CG</td><td>Solución de cultivo&lt;br/&gt;3.7g/L</td></tr><tr><td>SFB</td><td>Reactivo</td><td>Wisent Inc.</td><td>090150</td><td>Solución de cultivo&lt;br/&gt;10%</td></tr><tr><td>Antibióticos-antimicóticos</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Solución de cultivo&lt;br/&gt;1%</td></tr><tr><td>Micrómetro óptico</td><td>Herramienta</td><td>Hecho a medida</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de manipulación</td><td>Herramienta</td><td>Hecho a medida</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámara del biorreactor</td><td>Herramienta</td><td>Hecho a medida</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparación de los tendones cola de rata de estudios biomecánicos y mechanobiological

Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

Tendones cola de rata (RTT) son un modelo común biológicos utilizados en la experimentación en estudios in vitro en los campos de la fisiología del tendón y tendinitis. Trabajar con los tejidos es un reto porque son muy frágiles, y hasta ahora no había protocolo rigurosamente detallado de su aislamiento. Frente a estos desafíos, hemos desarrollado métodos e instrumentos para facilitar la manipulación de RTT y el tejido de control de la viabilidad, la esterilidad y la integridad. En este artículo se describen los procedimientos experimentales utilizados para preparar RTT para los estudios biomecánicos y mechanobiological. Nuestro trabajo se divide en cuatro etapas: extracción, corte transversal medida del área, el enjuague y la carga en la cámara del biorreactor. En cada paso, todos los procedimientos, materiales y manipulaciones se presentan en detalle para que puedan ser fácilmente reproducidas. Por otra parte, los instrumentos específicos desarrollados se presentan: una placa de manipulación utilizados para separar RTT, un micrómetro óptico para colocar el tejido en la medida del área transversal y un sistema de anclaje para fijar la RTT en un biorreactor. Por último, se describen los resultados obtenidos después de múltiples pruebas para validar nuestros métodos. Evaluaciones de la viabilidad, la esterilidad y la integridad demostrar que nuestros procedimientos sean lo suficientemente rigurosos para la manipulación de los tejidos delicados, como los tendones de cola de rata.

En este artículo se describen los procedimientos experimentales utilizados para preparar los tendones cola de rata para los estudios biomecánicos y mechanobiological. Varias características de los principales pasos en la preparación se ha demostrado, a partir de la extracción, corte transversal medida del área, el enjuague y la carga en la cámara del biorreactor.

Preparación de los tendones Cola de Rata de Estudios biomecánicos y Mechanobiological

Los tendones de cola de rata (TCR) son un modelo biológico común utilizado en estudios experimentales in vitro en los campos de la fisiología tendinosa y la tendinopatía. Trabajar...

El video que está a punto de ver contiene los procedimientos experimentales utilizados para aislar y preparar el tendón de la cola de rata para estudios biomecánicos y biológicos mecánicos. El objetivo de este artículo es demostrar los métodos e instrumentos que se desarrollaron y optimizaron con el fin de mantener la viabilidad del tejido, la esterilidad y la integridad durante el procedimiento de preparación. Discutiremos varias características relacionadas con los pasos principales de la preparación, comenzando con la extracción, seguida por la medición del área de sección transversal, el enjuague y, finalmente, la carga en la cámara del biorreactor.Comencemos. La extracción es el primer paso del procedimiento para conservar la viabilidad celular. Todas sus manipulaciones se realizan en solución salina fría.Después de que se sacrifica a la rata, se reseca la cola con etanol al 70 % y se transfiere a un recipiente que contiene células y solución, manteniéndola sobre hielo. Para facilitar la extracción del tendón, es necesario retirar la piel. Téngase en cuenta que trabajamos con tendones ventrales.Dado que son más pequeños y más fáciles de manipular con nuestro equipo, se realiza una incisión a lo largo del lado dorsal de la cola. Luego se verifica la orientación adecuada de la cola observando la anatomía en el extremo proximal. Como podemos ver, el lado ventral muestra un mayor número de tendones y la presencia de un vaso sanguíneo puede verificarse mediante las gotas de sangre obtenidas.Al ejercer una ligera presión sobre la cola, se realiza la incisión. Comenzando desde el extremo proximal y utilizando un par de tijeras quirúrgicas. Se tiene cuidado de manipular la cola por sus extremos.Una vez completada la incisión, se retira la piel comenzando también por el extremo proximal utilizando los dedos o una pinza. Una vez más, se tiene cuidado de manipular la cola por sus extremos. Posteriormente, se enjuaga la cola en la solución para eliminar pelos y sangre.A continuación, se transfiere la muestra a un recipiente que contiene solución fresca y se mantiene sobre hielo. En este momento, el investigador cambia los guantes para exponer el tendón. Se reseca el extremo distal de la cola dos o tres vértebras más corto.Las vértebras son los haces visibles entre los haces tendinosos y también pueden percibirse al deslizar los dedos a lo largo de la cola. Vista en microscopía óptica de una sección transversal realizada a lo largo de la vértebra. El extremo Skoal muestra que existen seis grupos tendinosos diferentes, ya que el tendón de cada uno de ellos se inserta en la vértebra, y que solo estamos utilizando los tejidos ventrales.Se extraen cuatro tendones en cada corte, dos de los grupos inferiores y dos de los grupos laterales. Para realizar la resección, puede utilizar tijeras quirúrgicas para seccionar el disco intervertebral y un escalpelo sobre una tabla de cortar para los tejidos blandos. En este punto, el lado ventral se identifica por la presencia de esponjas tendinosas más grandes.Una vez verificada la orientación, el tendón se extrae suavemente desde el extremo distal utilizando pinzas; cuando no se pueden separar más tejidos, se reseca la cola en el hombro vertebral como se mostró anteriormente. Después de la extracción, el tejido se sumerge inmediatamente en la solución y, sosteniendo ambos extremos, el tendón se transfiere a una placa de manipulación que también contiene la solución celular y en la cual se utiliza cinta para identificar el extremo proximal. Un análisis microscópico de una sección longitudinal teñida con hematoxilina y eosina muestra que, mediante este método sencillo y repetitivo, el sello del tejido extraído presenta una red de colágeno bien alineada y densamente empaquetada.Después de la manipulación, cuando los tejidos sufren estimulación mecánica, describimos sus propiedades mecánicas normalizando la fuerza interna en esfuerzo. Por lo tanto, debemos evaluar su área de sección transversal. Para hacer esto, se reconstruye el perfil del tejido mediante el uso de una microscopía estéreo equipada con una cámara digital.Con este método, se conserva la integridad del tejido, ya que la carga de nieve o el esfuerzo se aplican directamente sobre él. La cámara digital toma imágenes de la proyección del inquilino sobre una vista de 180. Dentro de un marco de referencia, un algoritmo de asistencia visual localiza los bordes superior e inferior de la muestra.Luego, se utiliza un algoritmo con el software MATLAB para realizar la reconstrucción del perfil. Se diseñó un micrómetro óptico para mantener el tejido en la zona focal. Dado que fuera de esta región, la proyección es borrosa y el reenfoque desplazaría el marco de referencia local.El micrómetro incluye un compartimento de medición para evitar la deshidratación del tejido. Dos sistemas de posicionamiento con platillo giratorio, que permiten la rotación de la muestra, y dos dispositivos de anclaje fabricados con tubos de silicona comprimidos contra los colores del eje. Primero, se llena el compartimento de medición con solución celular fría hasta que la entrada de los tubos de silicona queda sumergida.Luego, el espécimen se transfiere al compartimento de medición utilizando pinzas y sujetándolo únicamente por sus extremidades. Mediante un pipeteo de volumen microscópico, las extremidades del tendón se introducen por sección en los tubos de silicona. A continuación, se realiza una aspiración hasta que el extremo sobresalga más allá de los colores del vástago.Una vez que ambos lados están terminados, los colores del eje se aprietan utilizando una llave de cuello para comprimir el tubo. Ahora que el tendón está fijado, el aparato se instala bajo el micrófono estéreo. El tendón puede observarse directamente desde la pantalla del ordenador con un aumento de 105.Por consistencia, el tendón se estira hasta que los pliegues ya no son perceptibles, seguido de una deformación adicional del 0,4 %. Dado que el espécimen se captura desde 0 hasta 170 grados, se requiere una posición inicial y un ajuste de enfoque para obtener una imagen nítida en toda la circunferencia. De hecho, se toman 18 imágenes aumentando la rotación del espécimen en 10 grados entre cada vista.Con este método, es posible estimar el área de la sección transversal del tendón de la cola de una rata sin dañar el tejido. Al final, se obtiene una reconstrucción del perfil con un margen de error del 0,5 al 2%. Después de la medición, los tejidos se lavan para prevenir cualquier contaminación que pudiera haber ocurrido durante las manipulaciones previas.Se colocan en el gabinete placas de manipulación estériles que contienen solución de fijación fresca, una utilizada para el procedimiento de lavado mientras que la otra recibirá el tendón lavado. El experimentador lava su guante con etanol al 70 % antes de introducir el tendón extraído en la cabina de seguridad biológica. Sosteniendo únicamente los extremos, el tendón se transfiere cuidadosamente de pocillo a pocillo.Finalmente, se transfiere a una placa individual de manipulación que también contiene solución estéril de células. Para la validación del protocolo, realizamos pruebas de viabilidad y esterilidad. Primero, la viabilidad celular se evaluó utilizando un kit de viabilidad y citotoxicidad de células vivas y muertas para células mamíferas.Después de un cultivo de 12 días, se visualizó una gran mayoría de células vivas fluorescentes verdes, lo que confirma que los procedimientos de aislamiento son exitosos en la preservación del tejido vivo. Luego se realizaron exámenes para verificar la contaminación del cultivo utilizado. El medio se sembró en agar y se incubó durante 10 días, ya que no se observó crecimiento bacteriano.Realizamos que nuestras manipulaciones son estériles. El sistema de fijación utilizado aprovecha la ventaja de la deshidratación del tejido y el uso de adhesivo para muestras pequeñas, como la cola de rata o tendones, donde el adhesivo penetra en el tejido. Esto fija todas las subunidades, mientras que la deshidratación mejora sus propiedades mecánicas para evitar contaminaciones adicionales.Todo el procedimiento de carga se realiza dentro de una cabina de seguridad biológica donde todos los instrumentos y componentes de la cámara son estériles. Para la operación de carga, la cámara del biorreactor se fija sobre una plantilla de posicionamiento. Dos brazos móviles se colocan para recibir los anclajes de los tendones.Una cubierta cierra la cámara para evitar contaminación. Primero, los anclajes se depositan en los extremos de la placa de manipulación. Sus carretes se centran con el eje longitudinal del surco y sobre el tendón.A continuación, se enrolla el tendón alrededor de un anclaje. El anclaje se gira aproximadamente tres cuartas partes de una vuelta mientras el cuerpo del tejido permanece en la solución. Sujetando el extremo suelto, aseguramos la fijación del tejido al anclaje.A continuación, se repite el mismo procedimiento para la otra extremidad. Una vez que ambos lados están fijados, los anclajes se enrollan o desenrollan de manera uniforme hasta que haya seis centímetros. Entre las dos extremidades, se depositan dos gotas de 2,5 microlitros de ocreate en la parte lesionada de los tendones.Para ingresar a la adhesión, se tiene cuidado. Para evitar colocar pegamento en la solución celular, se requiere un mínimo de cinco minutos para que el pegamento se seque completamente. Para validar nuestro protocolo, realizamos pruebas para verificar la influencia del pegamento y de la deshidratación del punto de anclaje sobre la viabilidad del tejido.Después de dos horas, observamos que la condición de extremidad no se había extendido fuera del tejido. De hecho, existe un límite de color bien definido que marca el borde entre las células muertas fluorescentes rojas encontradas en el punto de anclaje y la mayoría de las células vivas verdes del cuerpo del tejido. Mientras tanto, la cámara del biorreactor se llena con medio de cultivo fresco.Una vez que la herida de la parte del tendón está seca, se rehidrata con la solución celular. Luego, el tejido anclado se transfiere a la cámara utilizando una pinza. Se cierra la tapa para evitar contaminaciones adicionales.La plantilla de posicionamiento se retirará una vez que la cámara esté instalada en el biorreactor. Acabamos de demostrar cómo preparar un tendón de cola de rata para estudios biomecánicos y biológicos mecánicos. Aplicando esos procedimientos, podemos realizar una amplia variedad de estudios in vitro sobre estos tejidos.Por ejemplo, se realizó un estudio sobre la degeneración del tejido mediante la aplicación de una estimulación insuficiente durante un período de 10 días. Cada día, evaluamos el tejido, sus propiedades mecánicas y la prueba de relajación de tensión no destructiva. Al final, pudimos observar la variación del esfuerzo.Hemos proporcionado evidencia de que nuestros rigurosos procedimientos de aislamiento y preparación permiten mantener la viabilidad del tejido, la ity y la anti. Gracias por vernos y mucha suerte con sus propios experimentos.

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Biology

Biología

Este video demuestra los procedimientos quirúrgicos y preparaciones necesarios para estudiar las respuestas contráctiles del músculo gastrocnemio medial de rata in situ. Esta preparación permite la medición de las propiedades contráctiles del músculo esquelético bajo condiciones fisiológicas. El animal se anestesia y el músculo se separa del tejido circundante en su extremo distal. El tendón de Aquiles se conecta a un transductor de fuerza, lo que permite medir la respuesta contráctil del...

Procedimientos para la Rata In situ Propiedades contráctiles del músculo esquelético

Los explantes procedentes del sistema de la dopamina mesencéfalo y el cuerpo estriado se utilizan en un ensayo para la matriz de...

Disección y Cultura de ratón dopaminérgico estriatal en explantes y tridimensionales ensayos matriz de colágeno

Describimos un protocolo in vivo para medir la dorsiflexión del pie tras la estimulación del nervio peroneo y la contracción del compartimento crural anterior de la extremidad posterior de la rata. Estas mediciones son una herramienta traslacional indispensable para evaluar la patología del músculo esquelético y los enfoques de ingeniería de tejidos para la reparación y regeneración muscular.

Aplicaciones de la<em&gt; En Vivo</em&gt; Pruebas funcionales de la rata tibial anterior para la evaluación de la ingeniería tisular de reparación del músculo esquelético

Este protocolo describe el proceso de evaluación de la curación de tendones en ratas que han sido inyectados con plasma rico en plaquetas alogénicas (PRP) o solución salina después de quitar parte del tendón de Aquiles. Se evalúa el progreso de la curación del tendón en varios puntos del tiempo utilizando diferentes tipos de análisis.

Efectos del trasplante Allogeneic Plasma rico en plaquetas (PRP) en el proceso de cicatrización de los tendones de Aquiles seccionado de las ratas: una descripción metodológica

Este papel describe la preparación y la evaluación del cordón umbilical células madre mesenquimales derivadas de matriz esferoides con un modelo de defecto del tendón patelar bilateral en una rata. Este modelo se asocia con una morbilidad aceptable y encontraron para detectar diferencias entre los tendones no tratados y tratados y entre los dos tratamientos probado.

Evaluación de terapias con células madre en un modelo de lesión del tendón patelar Bilateral en ratas

En este trabajo, presentamos un protocolo in vitro e in situ para reparar un hueco tendinoso de hasta 1,5 cm llenándolo con injerto de colágeno modificado. Esto se realizó mediante el desarrollo de una técnica de sutura modificada para tomar la carga mecánica hasta que el injerto madure en el tejido huésped.

Una nueva técnica de sutura de tenorrafia con injerto de colágeno de ingeniería tisular para reparar defectos grandes del tendón

El protocolo describe métodos de ensayo biomecánicos de tracción eficientes y reproducibles para tendones murinos mediante el uso de accesorios impresos en 3D de ajuste personalizado.

Pruebas biomecánicas de tendones murinos

Este protocolo describe la preparación de tejido nervioso ciático entero de rata para la estimulación electrofisiológica ex vivo y el registro en un baño salino perfundido de dos compartimentos, regulado ambientalmente.

Preparación del nervio ciático de rata para neurofisiología ex vivo

Presentamos una plataforma experimental personalizada y un protocolo de cultivo de tejidos que recrea el cambio fibrocartilaginoso impulsado por el pinzamiento de la inserción del tendón de Aquiles en explantes de extremidades posteriores murinas con viabilidad celular sostenida, proporcionando un modelo adecuado para explorar la mecanobiología del pinzamiento tendinoso.

Modelo de explante de extremidad posterior murina para el estudio de la mecanobiología del pinzamiento del tendón de Aquiles

Aquí, presentamos un sistema modelo ensamblado para imitar la diafonía celular del tendón entre el tejido central del tendón que soporta la carga y un compartimento extrínseco que contiene poblaciones celulares activadas por enfermedades y lesiones. Como caso de uso importante, demostramos cómo se puede implementar el sistema para investigar la activación relevante de la enfermedad de las células endoteliales extrínsecas.

Ensamblaje de tendones de ingeniería para sondear la diafonía celular en la enfermedad y la reparación

Aprende a preparar tendones de cola de rata para estudios biomecánicos y mechanobiologicos. Este método optimizado mantiene la viabilidad tisular y la integridad durante la extracción, medición y carga en bioreactor.

Preparación de los tendones Cola de Rata de Estudios biomecánicos y Mechanobiological

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