Preparación de inmunógeno ratón hipófisis para la inducción de la hipofisitis autoinmune experimental

La hipofisitis autoinmunitaria se caracteriza por un agrandamiento de la glándula pituitaria y una deficiencia de una o más hormonas hipofisarias. Los autoantígenos causantes siguen siendo desconocidos. Aquí, se muestra un protocolo para preparar proteínas de la glándula pituitaria de ratón para su uso en el estudio de esta enfermedad.

Las primeras glándulas pituitarias se aíslan de ratones sacrificados. A continuación, las hipófisis se homogeneizan para romper mecánicamente las células y liberar proteínas citosólicas. El homogéneo se clarifica mediante centrifugación a baja velocidad y se evalúa la cantidad mediante colormetría, ensayo BCA y la calidad mediante electroforesis en gel de poliacrilamida.

Finalmente, el homogeneizado de proteína acuosa se mezcla con un adyuvante aceitoso. Luego, esta mezcla se inyecta en ratones para crear un modelo de ratón que se asemeja a la hipofisitis autoinmune. Como se muestra en el video complementario, se han descrito cuatro técnicas para inducir hipofisitis en animales de experimentación.

La técnica presentada en este artículo, es decir, la inyección de proteínas pituitarias mixtas adyuvante contra la gripe, es la más antigua, que data de la década de 1960. Otros enfoques han sido la inyección de glicoproteínas solubles del virus de la rubéola en 1992, la inyección estereotáctica de un adenovirus directamente en la glándula pituitaria en 2002 y el trasplante de la glándula pituitaria de una cepa de rata bajo la cápsula renal de otra cepa de rata en 2010. La principal ventaja del enfoque adyuvante de Florence es que hoy en día es menos invasivo, más consistente y, sobre todo, más preciso en la inducción de una enfermedad que se asemeja mucho a la contraparte humana.

Aunque se ha reportado desde la década de 1960, la técnica adyuvante extranjera tuvo un desempeño deficiente para la inducción de hipofisitis. Cuando comencé mi trabajo de doctorado, solo pude obtener una instancia y gravedad de hipofisitis modestas utilizando el protocolo de adyuvantes extranjeros publicado. Las cosas mejoran significativamente cuando tengo la idea de aumentar diez veces la cantidad de proteínas pitu que contienen en la emoción EM.

Aunque estos métodos pueden proporcionar información sobre la patogénesis de la hipofisitis autoinmune, también se pueden utilizar para estudiar otras enfermedades autoinmunes para las que los autoantígenos aún no se han identificado. Por lo general, las personas nuevas en estos métodos lucharán principalmente con el último paso, la preparación del margen, porque requiere habilidades manuales, tiempo y dedicación. Por lo tanto, la demostración visual es fundamental para comprender cómo se debe preparar una emulsión adecuada.

Las implicaciones de esta técnica se extienden más allá del campo de la autoinmunidad. Saber cómo preparar el antígeno para la inmunización también se puede utilizar para la producción de anticuerpos monoclonales o para probar nuevas vacunas. Demostrando esta técnica estarán S Zoo heroico Ura y Mayland al gato de mi laboratorio.

La hipófisis del ratón es una glándula de forma cilíndrica que se encuentra en la base del cráneo en una depresión del hueso esfenoidal llamada térica. La glándula está bordeada lateralmente por los nervios trigémino y anteriormente por el quiasma del nervio óptico. Está compuesto por un lóbulo anterior más grande y lóbulos más pequeños, intermedios y posteriores.

Para aislar la glándula pituitaria, use unas tijeras para decapitar al ratón sacrificado, luego haga cortes paralelos desde la parte posterior hasta la parte delantera del cráneo. Levanta el cerebro y gíralo hacia atrás para exponer la glándula pituitaria, que aparece como un cilindro en el contexto de un triángulo isósceles. Teniendo la glándula pituitaria como base, los nervios trigéminos como lados y el quiasma óptico como vértice.

Rodea la glándula con las puntas de las pinzas cerradas para romper la meninga circundante. Luego, con pinzas finas, agarre la pituitaria de la celda de Turca y colóquela en un tubo de plástico sobre hielo seco. Para una preparación, recolecta 300 glándulas pituitarias de ratón.

Esta recolección requiere aproximadamente nueve horas persona. Una vez que se complete la recolección, almacene las glándulas pituitarias a menos 80 grados centígrados hasta que las necesite. Coloca un tubo Falcon de 15 mililitros en un baño de hielo.

Añadir al tubo 250 microlitros de tampón de homogeneización. Por cada 100 hipófisis recolectadas justo antes de la homogeneización, agregue las glándulas pituitarias del ratón al tampón. A continuación, coloque la punta del homogeneizador poly tron, un generador de cinco milímetros de diámetro, en la parte inferior del tubo Falcon que contiene las pituitarias del ratón y el tampón, homogeneice a máxima velocidad durante 30 segundos.

Mover suavemente el tubo hacia arriba y hacia abajo mientras se mantiene en hielo. A continuación, deje reposar el homogeneizado en hielo durante un minuto. Repita los pasos de homogeneización y enfriamiento dos veces más.

Esta suave homogeneización debería romper las células y liberar las proteínas sin romper los núcleos de la centrífuga. Se homogeneizan a baja velocidad, alrededor de 1000 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados para sedimentar, los núcleos, el tejido ininterrumpido y los materiales insolubles como el tejido conectivo y los complejos de proteínas desnaturalizadas. Teniendo cuidado de no alterar el pellet.

Transfiera el SNA ahora llamado estado postnuclear o PNS a un nuevo almacén de tubos Falcon. El PNS en hielo retrae el pellet utilizando el mismo volumen de tampón de homogeneización que antes, homogeneiza y centrifuga que antes. Después de agrupar las dos muestras de PNS, eloqua la solución en numerosos tubos de microcentrífuga.

Guarde los tubos de microcentrífuga a menos 80 grados centígrados hasta que los necesite. Esta preparación de proteínas es estable a menos 80 grados centígrados, pero pierde gradualmente su potencia. Por lo tanto, se recomienda usarlo dentro de los seis meses posteriores a la preparación.

Conserve una pequeña alícuota de PNS para determinar el rendimiento y la concentración de proteínas mediante el ensayo de ácido biy. A continuación, determine la calidad de la proteína mediante electroforesis en gel de 300 glándulas pituitarias de ratón, con un peso total medio de aproximadamente 570 miligramos. Espere un rendimiento de 60 miligramos de proteínas pituitarias o un miligramo de proteína por cada 10 miligramos de tejido.

La concentración de proteínas suele ser de alrededor de 40 miligramos por mililitro. El ejemplo proporcionado aquí es para inmunizar a 10 ratones. Plan para inyectar a cada ratón 100 microlitros de emulsión que contiene un miligramo de proteína pituitaria, permitiendo dos ratones adicionales para pérdidas de material durante la preparación aquí, se preparan 12 miligramos de emulsión de proteína.

Comience por descongelar rápidamente las alícuotas de proteína congeladas calentándolas en sus manos. Ajuste la concentración de proteínas a 20 miligramos por mililitro con PBS. A continuación, extraiga 600 microlitros del extracto de proteína pituitaria correspondiente a 12 miligramos en una jeringa Gas Tite Hamilton de 2,5 mililitros resuspende, adyuvante FRONS completo o CFA que contenga cinco miligramos por mililitro de mycobacterium tuberculosis matado por calor agitándolo manualmente.

A continuación, extraiga 600 microlitros del CFA en otra jeringa Hamilton de 2,5 mililitros. Coloque y asegure una aguja microemulsionante de calibre 22 a la jeringa llena de CFA. Empuje lentamente el émbolo de modo que la aguja se llene con CFA.

A continuación, fije y asegure el otro extremo de la aguja a la otra jeringa llena de extracto de proteína pituitaria. Evite atrapar burbujas de aire dentro de las jeringas. Avance lentamente el émbolo de la jeringa CFA para empujar el componente del aceite hacia el extracto acuoso de la hipófisis de modo que solo se mezcle una pequeña cantidad.

A continuación, empuje hacia atrás el émbolo de la jeringa de extracto pituitario en la jeringa CFA. Repita esta acción para aumentar gradualmente la cantidad de material mezclado hasta que se mezcle todo el contenido. Este material blanquecino y uniformemente distribuido representa la emulsión de agua y aceite.

Una vez que se forma la emulsión, repita el ciclo completo de ida y vuelta al menos 500 veces después del ciclo final, las jeringas contendrán una emulsión de agua y aceite uno a uno donde la concentración de proteína pituitaria ahora es de 10 miligramos por mililitro. La emulsión está lista para usar para probar la calidad de la emulsión con una gota de ella en un vaso de precipitados con agua. Si la emulsión se prepara correctamente, la gota se mantendrá compacta y apretada en la superficie.

Si la emulsión es de mala calidad, se extenderá y se dividirá en gotas más pequeñas. La emulsión se inyecta el mismo día de su preparación en ratones SJL para inducir hipofisitis autoinmune experimental. Este protocolo se detalla en el jo de vertical que lo acompaña.

Una vez que se ha recogido la glándula pitu y se dominan las técnicas, se puede realizar la instrucción de proteínas en una hora, recordando trabajar en ayuno y en hielo. Durante este paso, durante la preparación de la inmersión, que requiere aproximadamente una hora. Recuerde trabajar lenta y pacientemente en la fase inicial de mezcla después de su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la autoinmunidad exploraran los mecanismos a través de los cuales los linfocitos autorreactivos reconocen e infiltran el órgano diana. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de todo cómo preparar un extracto de proteína de la glándula pituitaria del ratón y cómo mezclarlo con los aju de Crohn para preparar una emulsión que esté lista para ser utilizada como inmunógeno. No olvide que trabajar con jeringas y las completas para la gripe, que contienen tuberculosis microbacteriana inactivada y seca, puede ser peligroso si se perfora accidentalmente.

Por lo tanto, siempre use brillos G y deseche las agujas correctamente mientras realiza este procedimiento.