Name: La inducción de la hipofisitis autoinmune experimental en ratones SJL (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Aprende a inducir hipofisitis autoinmune experimental en ratones SJL mediante inyección de inmunógeno hipofisiario y evalúa la severidad mediante histopatología. Este modelo reproduce características de la enfermedad humana.

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Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención DK080351 para PC, y por una generosa donación de la familia de Terry y Kristine Gore.

Protocolo experimental Una vez que el inmunógeno pituitaria está preparado (véase el artículo del compañero), se inyecta por vía subcutánea en ratones SJL (de los Laboratorios Jackson, las acciones de 000.686). Una inyección de idéntica se repite 7 días después. Los ratones se utilizan para recoger en vivo y los resultados post-mortem. Paso 1. La inyección subcutánea de inmunógeno hipófisis en ratones SJL Los ratones son los primeros anestesiados mediante la inyección de 0,5 ml de 20 mg / ml 2,2,2-tribromoetanol (Avertin, Islas Turcas y Caicos Estados Unidos, T-1420) por vía intraperitoneal. Los ratones son inyectados por vía subcutánea con 100 l de la emulsión de la hipófisis que, como se indica en el compañero JoVe 2181 artículo, contiene 1 mg de extracto de pituitaria y 0,25 mg de adyuvante completo de Freund. La emulsión se inyecta en la región dorsal izquierda pata trasera ((50 l) y la región inguinal derecha (50 l). La emulsión de la hipófisis se inyecta de nuevo en el día 7 en los sitios opuestos (50 l en la región dorsal derecha y la pierna trasera 50 l en la región inguinal izquierda). Los ratones son monitoreados diariamente por los primeros 3 días y luego semanalmente hasta el día del sacrificio, que por lo general 28 días después de la primera inmunización. Paso 2. Recopilación de los resultados en vivo: ensayos de sangre El tejido más utilizado para evaluar los resultados experimentales, mientras que los ratones siguen vivos es la sangre. La sangre es habitualmente elaborado 14 días después de la primera inmunización para medir los niveles séricos de anticuerpos pituitaria u otros marcadores como citocinas y quimiocinas. Sanguínea de ratones vivos de la siguiente manera. Los ratones se llevan a cabo de forma segura por la piel del cuello y la parte posterior de la mandíbula se encuentra. Una vez que la parte de atrás de la mandíbula se encuentra, 4 mm lancetas se utilizan para perforar el paquete vascular submandibular. Después se recoge la sangre, ejercen presión sobre los de la zona con una gasa con alcohol para evitar un hematoma. La sangre recogida se centrifuga a 2.000 g durante 20 minutos, y se almacenan a -80 ° C hasta su uso. Paso 3. Recopilación de los resultados post-mortem: la hipófisis histopatología Los ratones suelen ser sacrificados 28 días después de la primera inmunización. La característica principal necesarias para establecer el diagnóstico de HAE es la infiltración de la glándula pituitaria por hematopoyéticos de células mononucleares. Los ratones son sacrificados colocándolos en una cámara de plástico sellada que es perfundido con CO 2. Los ratones se mantienen en la cámara para un total de 8 minutos. Después de la eutanasia, la glándula pituitaria se recoge como se describe en el artículo del compañero. Una glándula suprarrenal se ve hinchada y más firmemente adheridas a los alrededores de la duramadre. Pinzas de Sharp se utiliza para aflojar las meninges que rodean la glándula pituitaria. Una vez que se mueve libremente en la pituitaria del hueso esfenoides, uno de los extremos de la glándula pituitaria se sujeta con una pinza y la glándula pituitaria es levantarse con cuidado. La glándula se coloca en un tubo de microcentrífuga que contiene 5 fijador Beckstead es. La glándula pituitaria es fija durante la noche, envuelto en papel de la lente, y se coloca en un casete. Las glándulas se procesan utilizando el siguiente protocolo: <table border="1"><tbody><tr><td> Número de estación </td><td> Reactivo </td><td> Tiempo en minutos </td><td> Temperatura (Celsius) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 70% de alcohol </td><td> 5 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 70% de alcohol </td><td> 15 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 95% de alcohol </td><td> 15 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 95% de alcohol </td><td> 15 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 100% de alcohol </td><td> 15 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 100% de alcohol </td><td> 7.5 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 100% de alcohol </td><td> 7.5 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> xileno </td><td> 20 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 9 </td><td> xileno </td><td> 20 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> xileno </td><td&gt; 20 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 11 </td><td> parafina </td><td> 30 </td><td> 58 </td></tr><tr><td> 12 </td><td> parafina </td><td> 5 </td><td> 58 </td></tr><tr><td> 13 </td><td> parafina </td><td> 5 </td><td> 58 </td></tr></tbody></table> Después del procesamiento, la glándula pituitaria son embebidos en parafina y al menos 5 secciones no consecutivos (5 m de espesor) se cortan de cada glándula. Después del corte, las glándulas se tiñen con hematoxilina y eosina, y se analizan para cuantificar la infiltración mononuclear. La sección con la infiltración más grave se ha seleccionado para la puntuación. La gravedad se califica sobre la base de una estimación subjetiva del grado de sustitución de la pituitaria anterior o la destrucción por las células inmunes: grado 0, ausencia de enfermedad, grado 1, 2% y un 20% la participación, grado 2, 20% -30%, grado 3, 30% -50%, grado 4, 50% -90%, el 5 º grado, superior al 90%. Todas las secciones están marcados por dos individuos ciegos a la fuente de las secciones.

<ol><li>Tzou, S. C., Lupi, I., Landek, M., Gutenberg, A., Tzou, Y. M., Kimura, H., Pinna, G., Rose, N. R., Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+Hypophysitis+of+SJL+mice%3A+Clinical+Insights+from+a+New+Animal+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Autoimmune Hypophysitis of SJL mice: Clinical Insights from a New Animal Model.</a> Endocrinology. , (2008).</li>
<li>Twarog, F. J., Rose, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+production+of+thyroid+autoantibodies+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The production of thyroid autoantibodies in mice.</a> J Immunol. 101, 242-2450 (1968).</li>
<li>Patrick, J., Lindstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+response+to+acetylcholine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Autoimmune response to acetylcholine receptor.</a> Science. 180, 871-872 (1973).</li>
<li>Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+hypophysitis%3A+an+underestimated+disease+in+search+of+its+autoantigen%28s%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Autoimmune hypophysitis: an underestimated disease in search of its autoantigen(s).</a> J Clin Endocrinol Metab. 92, 2038-2040 (2007).</li>
<li>Beckstead, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+preservation+of+fixation-sensitive+antigens+in+paraffin-embedded+tissues%3A+addendum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A simple technique for preservation of fixation-sensitive antigens in paraffin-embedded tissues: addendum.</a> J Histochem Cytochem. 43, 345-345 (1995).</li>
<li>Levine, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allergic+adenophypophysitis%3A+new+experimental+disease+of+the+pituitary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Allergic adenophypophysitis: new experimental disease of the pituitary gland.</a> Science. 158, 1190-1191 (1967).</li>
<li>Yoon, J. W., Choi, D. S., Liang, H. C., Baek, H. S., Ko, I. Y., Jun, H. S., Gillam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+an+organ-specific+autoimmune+disease%2C+lymphocytic+hypophysitis%2C+in+hamsters+by+recombinant+rubella+virus+glycoprotein+and+prevention+of+disease+by+neonatal+thymectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Induction of an organ-specific autoimmune disease, lymphocytic hypophysitis, in hamsters by recombinant rubella virus glycoprotein and prevention of disease by neonatal thymectomy.</a> Journal of Virology. 66, 1210-1214 (1992).</li>
<li>Davis, J. R., McMahon, R. F., Lowenstein, P. R., Castro, M. G., Lincoln, G. A., McNeilly, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+the+ovine+pituitary+gland+is+associated+with+hypophysitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated gene transfer in the ovine pituitary gland is associated with hypophysitis.</a> J Endocrinol. 173, 265-271 (2002).</li>
<li>Rotondo, F., Quintanar-Stephano, A., Asa, S. L., Lombardero, M., Berczi, I., Scheithauer, B. W., Horvath, E., Kovacs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenohypophysitis+in+rat+pituitary+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">Adenohypophysitis in rat pituitary allografts.</a> Int J Exp Pathol. , (2010).</li>
</ol>

Cuatro técnicas se han reportado para inducir hipofisitis en animales de experimentación. La técnica descrita en este artículo, que es la inyección de proteínas pituitaria mezclada con adyuvante de Freund s, es la más antigua, que data de 1967 6, y se ha mejorado, más recientemente, 1. Otras técnicas son la inyección de glicoproteínas solubles virus de la rubéola en 1992 7, la inyección estereotáxica de un adenovirus directamente en la glándula pituitaria en 2002 8, y el trasp...

<table><tbody><tr><td>Ratones SJL (The Jackson Laboratories)</td><td></td><td>stock 000686</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-Tribrom&amp;#8211;etanol (Avertin)</td><td>TCI America</td><td>T-1420</td><td></td></tr><tr><td>Fijador de Beckstead&amp;rsquo;s</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la inducción de la hipofisitis autoinmune experimental en ratones sjl

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Hipofisitis autoinmune se puede reproducir experimentalmente mediante la inyección de proteínas de la hipófisis se mezcla con un adyuvante en ratones susceptibles 1. Los modelos de ratón nos permitirá estudiar cómo se desarrollan las enfermedades, a menudo proporciona una buena réplica de los mismos procesos que ocurren en los seres humanos. Para algunas enfermedades autoinmunes, como la diabetes tipo 1A, hay modelos (el ratón NOD), que desarrollan espontáneamente una enfermedad similar a la contraparte humana. Para muchas otras enfermedades autoinmunes, sin embargo, el modelo necesita ser inducida experimentalmente. Un enfoque común a este respecto consiste en inyectar el ratón con un antígeno dominante derivada de la del órgano estudiado. Por ejemplo, los investigadores interesados ​​en la tiroiditis autoinmune inyectar ratones con tiroglobulina 2, y aquellos interesados ​​en la miastenia gravis inyectarles el receptor de acetilcolina 3. Si el autoantígeno para una enfermedad autoinmune en particular no se conoce, los investigadores inyectan un extracto de proteína cruda del órgano blanco de la reacción autoinmune. Para hipofisitis autoinmune, el autoantígeno patógenos (s) aún no se han identificado 4, y por lo tanto una preparación de proteína cruda pituitaria se utiliza. En este artículo de vídeo se demuestra cómo inducir hipofisitis autoinmune experimental en ratones SJL.

Este video muestra la forma de inducir hipofisitis autoinmune en ratones SJL y la forma de evaluar su gravedad por la histopatología.

La inducción de la hipofisitis autoinmune experimental en ratones SJL

La hipofisitis autoinmune puede reproducirse experimentalmente mediante la inyección de proteínas hipofisarias mezcladas con un adyuvante en ratones susceptibles1. El ratón...

La hipofisitis autoinmune se caracteriza por un agrandamiento de la glándula pituitaria y una deficiencia en una o más hormonas hipofisarias. Las causas de los autoantígenos permanecen desconocidas. Un video complementario demuestra un protocolo para preparar un inmunógeno de hipófisis de ratón, que se utilizará aquí para crear un modelo de ratón que se asemeje a la hipofisitis linfocítica autoinmune humana.El inmunógeno de hipófisis se inyecta en una cepa de ratón susceptible. Luego, la inyección se repite siete días después y, tras 14 días, se recoge sangre para estudios de biomarcadores. En el día 28, las glándulas hipófisis se extraen de ratones sacrificados, seccionan y tiñen para determinar el grado de infiltración de leucocitos.La hipofisitis autoinmune es una enfermedad cada vez más reconocida que puede ser difícil de distinguir de otras masas no secretoras de hormonas que se originan en la silla turca. Aunque la enfermedad fue descrita por primera vez hace aproximadamente 50 años, los autoantígenos reconocidos por el sistema inmunitario del paciente en la hipofisitis autoinmune han permanecido elusivos. En 2008, publicamos el desarrollo de un modelo murino que reproduce fielmente la enfermedad humana que estaba diseñado para imitar.Este modelo de ratón puede utilizarse para descubrir los autoantígenos hipofisarios implicados y para aprender más sobre la patogénesis y las historias naturales de la hipofisitis. El modelo se basa en la inyección de proteínas hipofisarias de ratón en una cepa susceptible, como la cepa SJL. Estas proteínas deben mezclarse con un adyuvante potente para crear un entorno inflamatorio local que eventualmente induzca la aparición de linfocitos autoreactivos hipofisarios.Primero en los ganglios linfáticos que drenan el sitio de inyección y luego en la glándula pituitaria. El modelo requiere la inyección de cantidades relativamente grandes de proteínas pituitarias, un total de dos miligramos por ratón. Esto sugiere que el autoantígeno o los autoantígenos están presentes en cantidades mínimas dentro de la glándula de la fertilidad. La inyección de una emulsión adecuadamente preparada es fundamental para la inducción de la enfermedad, ya que permite una liberación lenta y continua de proteínas pituitarias en los sitios de inyección, lo que finalmente favorece la generación y activación de linfocitos específicos contra la pituitaria.En el video complementario, se presenta un método para preparar inmunógeno de hipófisis. Las glándulas hipofisarias aisladas de ratones sacrificados se homogenizan y clarifican mediante centrifugación de baja velocidad. La mezcla de proteínas se evalúa cuantitativamente mediante un ensayo colorimétrico, el método de BCA, y cualitativamente mediante electroforesis en gel de poliacrilamida.El homogenato acuoso de proteínas se mezcla luego con un adyuvante oleoso que contiene bacilos inactivos de Mycobacterium tuberculosis para producir la emulsión hipofisaria. Después de preparar la emulsión como se muestra en el video complementario, retire la aguja microemulsificadora de la jeringa de un mililitro y coloque una aguja de calibre 25. Se requieren 100 microlitros de la emulsión hipofisaria para cada ratón que se vaya a inyectar.Después de anestesiar un ratón con Everton, asegúrese de que no haya respuesta al pellizco en el dedo del pie, luego inyecte 50 microlitros de la emulsión por vía subcutánea en la región dorsal posterior izquierda de la pata. Asegúrese de que la punta de la aguja esté completamente bajo la piel y de que ninguna emulsión se filtre fuera del sitio de inyección. A continuación, inyecte 50 microlitros en la región inguinal derecha.De nuevo, asegúrese de que no salga nada. Tenga en cuenta que la emulsión es blanquecina y puede ser difícil de distinguir en el contexto del fondo blanco del pelaje del ratón SGL L tras la inyección. Devuelva el ratón a su jaula y supervise su recuperación.Observe diariamente a los ratones inyectados durante los primeros tres días posteriores a la inyección para asegurarse de que no ocurra ningún malestar extremo. El adyuvante es proinflamatorio ya que contiene Mycobacterium tuberculosis inactivada. Bacilos el día siete, repita la inyección en los lados anatómicos opuestos.Inyecte 50 microlitros en la región de la pata trasera derecha y 50 microlitros en la región inguinal izquierda. Monitoree el ratón como antes, ya que los resultados experimentales se evaluarán tras haber ocurrido una respuesta inmune. La sangre es el tejido más comúnmente utilizado para evaluar los resultados experimentales mientras los ratones aún están vivos.Se extrae sangre rutinariamente 14 días después de la primera inmunización para medir los niveles séricos de anticuerpos contra la hipófisis u otros marcadores como citoquinas y quimiocinas. Para recolectar sangre de un ratón vivo, sujete firmemente al animal por la nuca y localice la parte posterior del hueso maxilar. Una vez identificada esta ubicación, puncione el haz vascular submandibular con una lanceta de cuatro milímetros.La sangre comenzará a salir del área perforada. Recolecte seis gotas de sangre en un tubo de microcentrífuga. Limpie el área perforada con una toalla de papel húmeda para detener la hemorragia.Coloque los tubos de sangre en una centrífuga y centrifugue a 2000 G durante 20 minutos. Esta centrifugación separa las células sanguíneas, que quedarán en el precipitado, del suero snat. Transfiera el suero a un nuevo tubo microcentrífuga.Almacene el suero a menos 80 grados Celsius hasta que sea necesario. Se necesita aproximadamente un mes para que los ratones inmunizados desarrollen hipofisitis autoinmune completa. Por lo tanto, los ratones generalmente se sacrifican 28 días después de la primera inmunización.Después de cortar el cráneo, levante el cerebro y dóblelo hacia atrás para exponer la glándula pituitaria. Una glándula pituitaria enferma aparece hinchada y más firmemente adherida a las meninges circundantes. Mueva la punta de la pinza fina alrededor de la glándula pituitaria para soltar las meninges.Una vez que la pituitaria se mueva libremente sobre este hueso fen, agarre un extremo de la glándula con pinzas y levántela cuidadosamente de este hueso fen. Coloque el tejido en un tubo de microcentrífuga que contenga un mililitro de solución betted, un fijador a base de zinc, y fije la glándula durante toda la noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, transfiera la pituitaria a un trozo de papel para lentes.Envuelva la glándula pituitaria en papel de lente y colóquela en un casete de histología. Procese la muestra incubándola y aumentando las concentraciones de alcohol y luego de xileno tras el procesamiento. Retire el papel de lente y coloque la pituitaria en un molde metálico.Luego cubra la pituitaria con parafina. Coloque el casete de tejido encima del molde y llénelo con parafina adicional. Finalmente, coloque el conjunto sobre hielo para permitir que la parafina solidifique.Una vez que la parafina haya solidificado, utilice un microtomo para cortar secciones de cinco micrones de grosor. Recojas las secciones sobre un portaobjetos de vidrio. Recolecte al menos cinco secciones no consecutivas sobre el mismo portaobjetos de cada glándula pituitaria de ratón.Tiña los portaobjetos con hematina y eosina utilizando una estación automática de tinción de tejidos. Examine los portaobjetos con un microscopio óptico para recopilar los resultados. La característica principal de una glándula pituitaria que ha desarrollado hipofisitis es su infiltración por linfocitos, que aparecen como células pequeñas de color azul que se distribuyen a través del parénquima pituitario de forma aislada o formando agrupaciones.Los linfocitos están asociados con diversos grados de destrucción de las células endocrinas normales de la hipófisis. La sección con la infiltración linfocítica más severa y destrucción de la glándula pituitaria se selecciona para la puntuación por dos investigadores ciegos respecto a las condiciones experimentales. La puntuación se basa en una estimación subjetiva del grado de daño.Una puntuación de cero indica una glándula pituitaria normal o que rara vez se observan linfocitos y otras células mononucleares hematopoyéticas. Una puntuación de uno indica que la infiltración mononuclear ocupa entre el 2 y el 20 % del área total de la pituitaria anterior. Una puntuación de dos indica que la infiltración mononuclear ocupa entre el 20 y el 30 % del área total de la pituitaria anterior.Una puntuación de tres indica que la infiltración mononuclear ocupa entre el 30 y el 50 % del área total de la hipófisis anterior. Una puntuación de cuatro indica que la infiltración mononuclear ocupa entre el 50 y el 90 % del área total de la hipófisis anterior, y una puntuación de cinco indica que la infiltración mononuclear ocupó casi toda el área de la hipófisis anterior. Una vez dominada, la inyección del inmunógeno en un ratón puede realizarse en 15 minutos.La recolección de sangre periférica de un ratón puede realizarse en cinco minutos y la preparación de portaobjetos para histopatología en seis horas, mientras se lleva a cabo el procedimiento de inmunización. Es importante prestar mucha atención a la salud del ratón tras la anestesia y la inyección del inmunógeno. Además de la histopatología pituitaria.Este procedimiento puede utilizarse para recopilar una amplia variedad de resultados experimentales mediante diferentes métodos, como la evaluación de subpoblaciones celulares en los ganglios linfáticos drenantes mediante citometría de flujo. La técnica de inmunización con un extracto tisular para la inducción de una enfermedad autoinmune allana el camino para que los investigadores en el campo de la autoinmunidad descubran los eventos clave en la patogénesis de la enfermedad. Tras ver este video, se deberá tener una buena comprensión de cómo inmunizar ratones para inducir hipofisitis autoinmune experimental y de cómo evaluar su incidencia y gravedad.No olvide que trabajar con cuchillas de microtomo puede ser peligroso. Por ello, siempre se deben tomar precauciones como usar guantes y trabajar en condiciones adecuadas de iluminación.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

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