Prueba de Actividad Protozoacidal de ligando-lítica péptidos intestinales contra termitas protozoos In vitro (Cultura protozoos) y In vivo (Microinyección en termitas intestino grueso)

El objetivo general de este procedimiento es demostrar que un ligando sintetizado se une específicamente a las protozoos que digieren la celulosa en el intestino de termitas subterráneas del género *form mosen*, y que el ligando unido a un péptido lítico mata a estos protozoos *in vitro* en cultivos anaeróbicos de protozoos y *in vivo* mediante inyección en el intestino posterior de la termita. Esto se logra primero extrayendo protozoos intestinales de termitas obreras bajo condiciones anaeróbicas. El segundo paso del procedimiento consiste en confirmar la unión de un ligando marcado con fluorescencia a los protozoos intestinales de termita *in vitro*.

El tercer paso del procedimiento consiste en demostrar que el péptido lítico unido al ligando mata a los protozoos del intestino de las termitas in vitro. El paso final del procedimiento es inyectar el ligando marcado con fluorescencia y el péptido lítico unido al ligando en el intestino posterior de la termita para confirmar la unión y destrucción de los protozoos intestinales in vivo. Mediante inyecciones de cultivos de protozoos en el intestino posterior de la termita y microscopía de fluorescencia, demostramos que un ligando unido a un péptido lítico se une y mata eficazmente a los protozoos del intestino de las termitas in vitro e in vivo.

La unión del ligando al péptido lítico aumentó la toxicidad frente a protozoos en comparación con el péptido lítico solo. Aunque redujo la toxicidad frente a organismos no diana, como E. coli, muy probablemente porque el ligando no se une a la membrana celular bacteriana, la eliminación de los protozoos provoca la muerte de las termitas en menos de dos semanas. La técnica presentada, que utiliza péptidos colíticos con ligandos para eliminar los protozoos simbióticos en el intestino de las termitas subterráneas, forma parte de los esfuerzos por desarrollar métodos alternativos para el control de termitas.

Con menor dependencia de productos químicos y sin los simbiontes en sus intestinos, las termitas mueren. Extraemos protozoos del intestino de la termita para demostrar que el ligando se une a los protozoos y que el péptido lítico del ligando mata a los protozoos. Las partículas de madera dentro de los protozoos muestran autofluorescencia. Por lo tanto, es importante comparar los resultados de los protozoos tratados con el ligando fluorescente con los protozoos no tratados.

Para evitar falsos positivos, inyectamos péptidos directamente en el intestino posterior, ya que si los péptidos se administran por vía oral a las termitas, las proteasas del intestino medio y del intestino anterior los digerirán. Mediante el uso de bibliotecas de presentación farge de New England Bio Labs, identificamos 19 secuencias de péptidos hep que se unen a protozoos. Elegimos uno de los ligandos con una secuencia peptídica que mostraba similitudes con glicoproteínas putativas conocidas en la membrana de Trypanosoma brucei.

Después de la síntesis del péptido, acoplamos el péptido sintetizado a una sonda fluorescente en el extremo C mediante una síntesis peptídica en estado sólido utilizando la resina E-D-A-N-S novatech para evaluar las propiedades líticas de los conjugados peptídicos. En este procedimiento, utilizamos un conjugado del ligando sintetizado y el péptido lítico ate, que fue sintetizado previamente un día antes del experimento en la instalación de proteínas de LSU. Utilice sigma coat para tratar todos los materiales empleados y evitar la absorción de protozoos o péptidos en las superficies.

Aplique una capa uniforme y deje secar durante la noche antes de usar al día siguiente. Prepare una caja de ventilador dentro de una caja de guantes para hacer circular constantemente aire a temperatura ambiente a través de una pila de desecante y paquetes de catalizador tipo D con el fin de reducir los niveles de humedad y oxígeno durante más de una hora. Llene la caja de guantes con una corriente continua de nitrógeno durante 20 a 30 minutos y use nitrógeno adicional para mantener condiciones anaeróbicas cuando sea necesario.

A continuación, prepare el medio Traeger U y ajuste el pH a siete. Pase el medio esterilizado por filtro dentro de la cabina de flujo laminar mediante una punta de 200 microlitros conectada a un tubo con una mezcla de 2,5 % de hidrógeno, 5 % de dióxido de carbono y 92,5 % de nitrógeno durante una hora para eliminar los residuos de oxígeno en la cabina. Una vez que los materiales estén listos, use pinzas para obtener una obrera de termita de una placa de Petri y sumerja todo el cuerpo en un vaso de precipitados lleno con etanol al 70 %, sosteniendo suavemente la termita con las pinzas durante aproximadamente 10 segundos. Para eliminar contaminantes superficiales, retire la obrera del etanol y déjela secar sobre una toalla limpia Kimwipe durante unos 20 segundos.

Dentro de la cabina de flujo laminar, prepare un portaobjetos silanizado con 100 microlitros de medio Trager U para recolectar el intestino de termita y un tubo con 900 microlitros de medio Trager U para recolectar protozoos. Luego, utilizando un microscopio estereoscópico y un par de pinzas estériles de punta fina, sostenga el abdomen del individuo obrero y agarre la punta del abdomen con otro par de pinzas para extraer suavemente el intestino hacia arriba o hacia abajo en un ángulo de 45 grados; intente recolectar el intestino medio y el intestino posterior como una sola pieza. Coloque los intestinos de termita en una gota de 100 microlitros de medio Trager U sobre un portaobjetos para microscopio.

Deslice el siguiente, perfore los intestinos posteriores con un par de pinzas estériles finas para disección y libere los protozoos; luego transfiera suavemente el contenido intestinal con una pipeta de 200 microlitros a un tubo microcentrífugo de un mililitro que contenga 900 microlitros de medio Traeger. Espere cinco segundos para que se sedimenten los fragmentos de la pared intestinal y transfiera 900 microlitros del sobrenadante a un tubo nuevo. Transfiera te microlitros de cultivo de protozoos a un microscopio recubierto con sigma.

Deslice y verifique el estado de los protozoos bajo un microscopio con un aumento de 200 veces. Prepare cultivos control de protozoos aeróbicos, Tetra piriformis, amebas, Ug, gleaner y paramecios, así como un cultivo nocturno de E. coli en el medio de cultivo según lo recomendado por el proveedor inmediatamente después de obtener los protozoos. Fije los protozoos del intestino de termitas y cualquier otro control de protozoos, así como E. coli, con formaldehído al 10 % durante 12 horas a cuatro grados Celsius. Luego, centrifugue la solución de protozoos a 30 veces la gravedad durante 10 minutos.

Deseche el sobrenadante y lave el sedimento que contiene los protozoos fijados dos veces con un mililitro de medio Trager U reus, suspenda el sedimento en un mililitro de medio Traeger Edia. Incube los microorganismos fijados durante una a dos horas con 100 microlitros de una solución de ligando sintetizado acoplado al colorante fluorescente E-D-A-N-S, utilizando una concentración final de ligando de 50 micromolar disuelto en agua. Observe los microorganismos tratados con ligandos y los controles no tratados bajo un microscopio de fluorescencia a 400 aumentos, con una longitud de absorción máxima a 341 nanómetros y una emisión en la región azul a 471 nanómetros.

Para evaluar las propiedades líticas del péptido conjugado con ligando, pipetee seis alícuotas de 198 microlitros de cultivo de protozoos preparado como se muestra en la sección tres en tubos Eppendorf de 0,5 mililitros. Añada dos microlitros de una solución de 100 micromolar de un péptido lítico con ligando a la mitad de las alícuotas del cultivo de protozoos del intestino de termitas. Para obtener una concentración final de un micromolar, añada dos microlitros de agua estéril como control a la otra mitad de las alícuotas.

Después de una hora, transfiera 10 microlitros de cada cultivo de protozoos a un portaobjetos. Compare la supervivencia de los protozoos tratados con péptido lítico conjugado con ligando frente a los controles mediante un microscopio a 200 aumentos, utilizando un micropipeteador NGI PC con nivel de calor de dos etapas. Para obtener un tamaño de punta de 20 a 30 micrones, confirme el tamaño de la punta midiendo bajo un microscopio.

Utilizando un micrómetro, llene una aguja con aproximadamente 30 microlitros de un ligando marcado con fluorescencia de 50 micromolar suspendido en agua. Usando una jeringa acoplada, llene otra aguja con agua para el control. Sujete una micropipeta a un porta-pipetas y a un micromanipulador. Fije una aguja al soporte del sistema de inyección en un segundo micromanipulador.

Establezca los parámetros iniciales de inyección en aproximadamente un segundo de duración de pulso y una inyección de 10 a 12 PSI. Luego, avance lentamente la aguja dentro de la micropipeta e inyecte la solución utilizando un pedal de pie tras la inyección. Retire la micropipeta y registre la longitud de la solución inyectada.

Utilizando un calibrador vernier, calcule el volumen inyectado a partir de los parámetros conocidos de la micropipeta y ajuste la presión y la duración del pulso para expulsar 0,3 microlitros de solución. A continuación, prepare 20 termitas para cada tratamiento destinado a la inyección. Primero, comprima suavemente el extremo del abdomen con pinzas suaves para eliminar cualquier excreción presente en el recto.

Luego, inmovilice a las obreras de las termitas enfriándolas en hielo durante cinco minutos mientras las termitas quedan inmovilizadas. Prepare recipientes para sostener a las obreras de las termitas cortando las puntas de pipetas de 100 microlitros. Con una hoja de bisturí, corte la punta a una longitud de 10 a 12 milímetros según el tamaño de las termitas y colóquelas en un vial.

Con una tapa de rosca, sujete el receptor al micromanipulador. Coloque una obrera en una placa de Petri sobre su lado dorsal y aspire la obrera de forma cefálica hacia el receptor utilizando una bomba de succión de nitrógeno, de modo que la extremidad de la obrera sobresalga del receptor. Sosteniendo cuidadosamente el receptor con la termita, avance la aguja cargada mediante el micromanipulador para insertarla en el ano de la obrera. Inyecte 0,3 microlitros del ligando marcado con fluorescencia o del control de agua.

Coloque las obreras inyectadas con ligando o agua en placas de Petri separadas con papel de filtro húmedo y manténgalas durante la noche a 26 grados Celsius con una humedad relativa del 78 %. Después de 24 horas, extraiga los intestinos de las termitas inyectadas y recolecte los protozoarios como se indicó anteriormente. Observe la unión del ligando en los protozoarios procedentes de las termitas inyectadas mediante microscopía de fluorescencia para evaluar las propiedades líticas de los péptidos líticos conjugados con ligando en termitas vivas.

Prepare los materiales para la inyección, el equipo y los termitas como se realizó previamente para inyecciones, e inyecte 0,3 microlitros de una solución de péptido lítico de ligando a 500 micromolar o agua como control en el intestino posterior de 20 obreras de termitas. Después de 24 horas, extraiga los intestinos de varias obreras y observe el contenido intestinal bajo el microscopio a 200 aumentos tan pronto como se confirme la muerte de todos los protozoos en el intestino de las termitas tratadas. Mantenga las termitas tratadas restantes y los controles en placas de Petri con papel de filtro húmedo y observe la mortalidad diariamente. Confirmamos que el ligando acoplado a una sonda fluorescente se une a las tres especies de protozoos, P. grassi, H. hartmanni y S. lacerata.

En el intestino posterior de cuatro especies de termitas subterráneas de Mosson, en densidades no detectables, la unión del ligando ocurre en toda la superficie celular y se concentra en la región anterior de los protozoos sobre el eje, junto a una lámina de microtúbulos y el núcleo MP ojo de pasto. También detectamos fluorescencia en todas las especies de protozoos aerobios de vida libre analizadas, lo que sugiere que el ligando se une a estructuras genéricas de los protozoos. Aunque no se observó unión del ligando para E. coli, un micromolar del péptido lítico ligando mató a las tres especies de protozoos del intestino de obreras de termitas subterráneas y de Omo, así como al protozoo de vida libre T. piriformis in vitro en menos de 10 minutos, mientras que los controles permanecieron vivos.

Esta imagen muestra la pérdida progresiva de la integridad de la membrana de los protozoos intestinales de termitas tratados con péptido lítico ligado. No se observó diferencia en el número de colonias de E. coli entre los tratamientos con péptido lítico ligado y agua; sin embargo, el péptido lítico sin ligando redujo considerablemente el número de colonias de E. coli. Esto sugiere que la unión de un ligando al péptido lítico protege en cierta medida a los microorganismos no diana de la lisis. La inyección de 0,3 microlitros de péptido lítico ligado a 500 micromolar mató a las tres especies de protozoos en el intestino de termitas superiores y subterráneas en un plazo de 24 horas, y las termitas murieron después de 10 días cuando se inyectó el péptido lítico acoplado a un ligando.

Los protozoos y los termitas murieron tres veces más rápido que cuando se inyectaron péptidos líticos no conjugados con ligandos, como se mostró en Husen y Colia 2009, lo que sugiere que el ligando aumenta la eficiencia citidal de los péptidos líticos sobre protozoos bajo condiciones óptimas de cultivo. Las tres especies de proa extraídas del intestino de Omo. Las termitas subterráneas deben permanecer vivas y saludables durante al menos tres días.

Sin embargo, si quedan residuos de oxígeno en el medio, el movimiento de los protozoos se detiene inmediatamente. Si se utiliza un medio inadecuado y la presión osmótica dentro de las células se vuelve demasiado alta, las membranas de los protozoos se hinchan y estos revientan. Si la presión osmótica en las células es demasiado baja o las membranas están dañadas, los protozoos se arrugan y se encogen. La fijación de los protozoos facilita la detección de la unión del ligando marcado con fluorescencia a los protozoos.

Es difícil detectar la fluorescencia y distinguirla de la autofluorescencia de las partículas de madera cuando los protozoos se mueven libremente. Una vez dominada esta técnica, aproximadamente 30 termitas por hora pueden ser inyectadas con la ayuda de un asistente. Aunque el péptido colítico ligando fue desarrollado para eliminar la simbiosis de protosomas en el intestino de termitas subterráneas y, por tanto, para el control de termitas, también podría ser útil para desarrollar fármacos contra parásitos protosomas como slash mania, ponoma, te y odium, que causan muchas enfermedades en humanos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión sobre cómo obtener y mantener en cultivo protozoos extraídos del intestino de termitas, cómo mostrar la unión específica de un ligando a protozoos mediante microscopía de fluorescencia, cómo demostrar la acción proto suicida del péptido colítico ligando in vitro. Y por último, pero no menos importante, cómo inyectar péptidos en el intestino del tumor de la termita para la confirmación in vivo.