Name: Estrategias para el Estudio de la neuroprotección de frío preacondicionamiento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-02T17:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 27 s
Description: Aprende a investigar la neuroprotección por preacondicionamiento en frío usando cultivos de hipocampo de rata. Este método permite analizar señalización inmune neural y citocinas como TNF-α e interleucina 11 para identificar dianas terapéuticas.

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Este trabajo fue financiado por subvenciones del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NS-19108), la Fundación Migraña Investigación y la Fundación White a Richard P. Kraig. La Sra. Marcia P. Kraig asistencia en la preparación de medios de cultivo y mantenimiento de cultivos de división. Damos las gracias a Yelena Grinberg por sus comentarios y revisiones en una versión final de este artículo.

<ol><li>Aptowicz, C. O., Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+plasticity+in+hippocampal+slice+cultures+involves+changes+in+voltage-gated+Na%2B+channel+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Homeostatic plasticity in hippocampal slice cultures involves changes in voltage-gated Na+ channel expression.</a> Brain Res. 998, 155-163 (2004).</li>
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<li>Calabrese, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+stress+response+terminology%3A+Integrating+the+concepts+of+adaptive+response+and+preconditioning+stress+within+a+hormetic+dose-response+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Biological stress response terminology: Integrating the concepts of adaptive response and preconditioning stress within a hormetic dose-response framework.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 222, 122-128 (2007).</li>
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<li>Hulse, R. E., Winterfield, J., Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+clasmatodendrosis+in+hippocampal+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Astrocytic clasmatodendrosis in hippocampal organ culture.</a> Glia. 33, 169-179 (2001).</li>
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<li>Kunkler, P. E., Hulse, R. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+cytokine+protein+expression+profiles+from+spreading+depression+in+hippocampal+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Multiplexed cytokine protein expression profiles from spreading depression in hippocampal organotypic cultures.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 24, 829-839 (2004).</li>
<li>Kunkler, P. E., Hulse, R. E., Schmitt, M. W., Nicholson, C., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+current+source+density+analysis+in+hippocampal+organotypic+culture+shows+that+spreading+depression+occurs+with+uniquely+reversing+currents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optical current source density analysis in hippocampal organotypic culture shows that spreading depression occurs with uniquely reversing currents.</a> J Neurosci. 25, 3952-3961 (2005).</li>
<li>Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+astrocytosis+from+excitotoxic+injury+in+hippocampal+organ+culture+parallels+that+seen+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Reactive astrocytosis from excitotoxic injury in hippocampal organ culture parallels that seen in vivo.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 17, 26-43 (1997).</li>
<li>Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+waves+precede+electrophysiological+changes+of+spreading+depression+in+hippocampal+organ+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium waves precede electrophysiological changes of spreading depression in hippocampal organ cultures.</a> J Neurosci. 18, 3416-3425 (1998).</li>
<li>Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P%2FQ+Ca2%2B+channel+blockade+stops+spreading+depression+and+related+pyramidal+neuronal+Ca2%2B+rise+in+hippocampal+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">P/Q Ca2+ channel blockade stops spreading depression and related pyramidal neuronal Ca2+ rise in hippocampal organ culture.</a> Hippocampus. 14, 356-367 (2004).</li>
<li>Lambertsen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+protect+neurons+against+ischemia+by+synthesis+of+tumor+necrosis+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia protect neurons against ischemia by synthesis of tumor necrosis factor.</a> J Neurosci. 29, 1319-1330 (2009).</li>
<li>Lee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulator+of+G-protein+signaling+10+promotes+dopaminergic+neuron+survival+via+regulation+of+the+microglial+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulator of G-protein signaling 10 promotes dopaminergic neuron survival via regulation of the microglial inflammatory response.</a> J Neurosci. 28, 8517-8528 (2008).</li>
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<li>Wilde, G. J., Pringle, A. K., Sundstrom, L. E., Mann, D. A., Iannotti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+and+augmentation+of+ischaemia-related+neuronal+death+by+tumour+necrosis+factor-alpha+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Attenuation and augmentation of ischaemia-related neuronal death by tumour necrosis factor-alpha in vitro.</a> Eur J Neurosci. 12, 3863-3870 (2000).</li>
</ol>

Dos conceptos de importancia fundamental importancia a la delimitación del sistema de señalización de citoquinas que participan en frío preacondicionamiento neuroprotección se ilustra en las figuras 6 y 7. En primer lugar, las citoquinas son la concentración extremadamente baja moléculas de señalización en el cerebro normal. Sin embargo, los cambios fisiológicos concentración de citoquinas tienen un inmenso potencial para alterar la estructura y función del cerebro (es decir, el fenotipo), debido a su capacidad para alterar la expresión génica (Figura 6). Además, las citoquinas son altamente redundantes y pleiotrópicos de múltiples citoquinas que pueden tener efectos similares y una citocina sola puede tener efectos diferentes (Figura 7). Por lo tanto, para establecer con precisión la innata citoquinas bases para la neuroprotección del frío-preacondicionamiento (u otros estímulos fisiológicos preacondicionamiento), análisis combinado de las variables relacionadas con la señalización debe ser determinado. Esto se logra a través de estrategias de ensayo multiplex. Esto establecerá la citoquina "firma" de frío preacondicionamiento neuroprotección. <img src="/files/ftp_upload/2192/2192fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Poder de señalización cerebral de citoquinas. Las ilustraciones de transmitir el inmenso poder de señalización de las concentraciones fisiológicas de las citoquinas cerebrales en comparación con las concentraciones de otros bien conocidos colegas. La concentración es representado como el inverso de la distancia, comenzando con un bigote de gato solo como punto de referencia. De sodio (10 -1 M ilustrado por un grano de pimienta) y potasio (10 -3 M ilustrado por un tomate) están presentes en el espacio intersticial del cerebro a niveles de alrededor de 150 y 3 mm, respectivamente, y tienen bien reconocido papel en la función de las células neuronales electrofisiológicos. Del mismo modo, el pH (es decir, ~ 10 -7 M niveles de iones de hidrógeno y se muestra como 780 metros a lo largo del lago de Chicago) y calcio (es decir, ~ 10 -8 M niveles mostrados como 7,8 kilometros visto desde una imagen de satélite de Google a lo largo del lago de Chicago de McCormick lugar a Promontory Point en Hyde Park, cerca de la Universidad de Chicago). Además, los neurotransmisores liberados al espacio intersticial en estas concentraciones afectan a la actividad local de la región del cerebro. Por el contrario, las citoquinas (que se muestra como la distancia entre la Tierra y Marte) puede alterar la función del cerebro en concentraciones de más de diez millones de veces menos. <img src="/files/ftp_upload/2192/2192fig7.jpg" alt="Figura 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 7"> Figura 7. La señalización de vías de las citoquinas interactivo innata. Citoquinas son altamente redundantes y pleiotrópicos de múltiples citoquinas que pueden tener efectos similares y una citocina sola puede tener efectos diferentes. Esta diversidad se debe a la señalización complejo interactivo que ocurre en el nivel de los ligandos, los receptores, y fosfoproteínas. Una mayor complejidad deriva del hecho de que el cerebro está formado por diferentes tipos de células, cada una capaz de células específicas de citoquinas innata, receptores, y los cambios relacionados fosfoproteína. Para fines ilustrativos aquí, sólo citoquinas innatas vías de señalización (basada en estudios de células inmunes) se muestran. Para simplificar, el cerebro se dibuja como una sola célula (línea blanca) que muestra las posibles interacciones de las citoquinas innatas (IL-1α e IL-1β (denominado aquí como la IL-1α / β), TNF-α, IL-6, IFN-γ e IL-10), receptores (IL-1R1, TNFR1, IL-6/gp130, IFNγR, e IL-10R), y fosfoproteínas (es decir, quinasas ERK1 / 2, P38 (P38-MAPK) y JNK) y factores de transcripción (ATF-2, NFκB, y STAT3). Por ejemplo, el TNF-α a través de señales de TNFR1 de JNK, p38 MAPK y ERK1 / 2, lo que desencadena la expresión de genes a través de ATF-2. TNF-α también altera la expresión de genes directamente a través de la activación de NFκB. En conjunto, la activación de estos factores de transcripción evocar mayor (flecha) y disminuye (extremo romo) la expresión de citoquinas y sus receptores, como se indica. Es importante destacar que estas vías muestran que los cambios en uno de citoquinas (por ejemplo, TNF-α), la producción de la influencia de otros (por ejemplo, IL-1β) citocinas. Por lo tanto, para establecer con precisión la citoquina-bases para la neuroprotección del frío de preacondicionamiento, el análisis de compuesto de variables relacionadas con la señalización debe ser determinado. Esto establecerá la citoquina innata "firma" de preacondicionamiento en frío. (Imagen fue compilado a partir de los datos de referencia # 25.)

Preparación de las Culturas Cortar <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / Equipo </td><td> Empresa </td><td> Catálogo / Número de modelo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Millicell-CM inserciones de cultivo de tejidos (30 mm) </td><td> Thermo Fisher </td><td> PICM0-3050 </td><td></td></tr><tr><td> Basal medio de Eagle </td><td> Invitrogen </td><td> 21010 </td><td></td></tr><tr><td> Solución salina balanceada de Earle s </td><td> Sigma </td><td> E2888 </td><td></td></tr><tr><td> Suero de caballo </td><td> Invitrogen </td><td> 26050-088 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> 35050 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15710-064 </td><td></td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Invitrogen </td><td> 15295 </td><td></td></tr><tr><td> D-glucosa </td><td> Sigma </td><td> G8769 </td><td></td></tr><tr><td> BSL-1 campana extractora de humos </td><td> Panadero </td><td></td><td></td></tr><tr><td> McIlwain helicóptero tejido </td><td> Brinkmann </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Teflon discos </td><td> Brinkmann </td><td> 023-49-310-1 </td><td></td></tr><tr><td> Espátula </td><td> Thermo Fisher </td><td> 14-373-25A </td><td></td></tr><tr><td> Tijeras curvas iris </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 14091-09 </td><td></td></tr><tr><td> Tijeras rectas largas </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 14002-14 </td><td></td></tr><tr><td> Unas pinzas largas </td><td> Thermo Fisher </td><td> 13-812-40 </td><td></td></tr><tr><td> Pinza en ángulo </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11808-02 </td><td></td></tr><tr><td> Pinzas corta </td><td> Thermo Fisher </td><td> 13-812-38 </td><td></td></tr><tr><td> # 5 Inox fórceps </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11254-20 </td><td></td></tr><tr><td> Iris 2 espátulas </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 10094-13 </td><td></td></tr><tr><td> 150 x 15 mm Petri </td><td> Thermo Fisher </td><td> 08-757-148 </td><td></td></tr><tr><td> 60 x 15 mm Petri </td><td> Thermo Fisher </td><td> 08 a 757-100B </td><td></td></tr><tr><td> Salvaje M8 ​​estereomicroscopio </td><td> Salvaje Heerbrugg </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Solución Gey s equilibrio de la sal </td><td> Sigma </td><td> G9779 </td><td></td></tr><tr><td> Blak-rayos ultravioleta de onda corta de medición metros </td><td> UVP </td><td> J-225 </td><td></td></tr><tr><td> 6-así Falcon placas de cultivo </td><td> Thermo Fisher </td><td> 08-772-1B </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Invitrogen </td><td> 21103</td><td></td></tr><tr><td> Suplemento B27 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504 </td><td></td></tr><tr><td> Gem21 Neuroplex </td><td> Gemini Bioproducts </td><td> 400-160-010 </td><td></td></tr><tr><td> El ácido ascórbico </td><td> Sigma </td><td> A4544 </td><td></td></tr><tr><td> Analizador de CO 2 </td><td> Bacharach </td><td> # 2820 </td><td></td></tr></tbody></table> Pre-selección para la vitalidad de las culturas Cortar <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / Equipo </td><td> Empresa </td><td> Catálogo / Número de modelo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Sytox Verde </td><td> Invitrogen </td><td> S7020 </td><td></td></tr><tr><td> DMIBRE microscopio invertido </td><td> Leica </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> En frío de preacondicionamiento <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / Equipo </td><td> Empresa </td><td> Catálogo / Número de modelo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> BSL-2 Campana Extractora </td><td> Nuaire </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Lesiones excitotóxica <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / Equipo </td><td> Empresa </td><td> Catálogo / Número de modelo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> CoolSnap fx cámara CCD </td><td> Fotometría </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fluoresceína </td><td> Invitrogen </td><td> F36915 </td><td></td></tr><tr><td> MetaMorph software </td><td> Molecular Devices </td><td> v. 7.5.04 </td><td></td></tr><tr><td> 100 m de profundidad hemocitómetro </td><td> Hausser Científico </td><td></td><td></td></tr><tr><td> N-metil-D-aspartato </td><td> Calbiochem </td><td> 454575 </td><td></td></tr><tr><td> SigmaStat software </td><td> Systat Software Inc. </td><td> v. 3.5 </td><td></td></tr></tbody></table> Co-tratamientos aplicados en frío de preacondicionamiento <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / Equipo </td><td> Empresa </td><td> Catálogo / Número de modelo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> sTNFR1 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 425-R1-050 </td><td></td></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino </td><td> Sigma </td><td> A-4503 </td><td></td></tr></tbody></table> Aislamiento del ARN <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / Equipo </td><td> Empresa </td><td> Catálogo / Número de modelo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Ater rnal </td><td> Ambion </td><td> AM7021 </td><td></td></tr><tr><td> Micro Kit RNeasy </td><td> Qiagen </td><td> 74004 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> Pescador </td><td> 03446-100 </td><td></td></tr><tr><td> Desechable 1.5 RNasa libre de Mortero </td><td> South Jersey herramienta de precisión y moldes, Inc. </td><td> 749521-1590 </td><td></td></tr><tr><td> RNasin </td><td> Promega </td><td> N261A </td><td></td></tr><tr><td> Tris [hidroximetil] aminometano </td><td> Sigma </td><td> T3069 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA (ácido etilendiaminotetracético disódico sal hidratada </td><td> Sigma </td><td> # E7889 </td><td></td></tr></tbody></table> La cuantificación del ARN <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / Equipo </td><td> Empresa </td><td> Catálogo / Número de modelo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> RiboGreen ensayo </td><td> Invitrogen </td><td> R11491 </td><td></td></tr><tr><td> TRNA de levadura </td><td> Invitrogen </td><td> 15401-011 </td><td></td></tr><tr><td> 1,5 ml de tubos de centrifugación </td><td> EE.UU. Científico </td><td> 16155500 </td><td></td></tr><tr><td> 96 y placa de ensayo fluorescente </td><td> Nunc </td><td> DK-4000 </td><td></td></tr><tr><td> 96 y lector de placas fluorescentes </td><td> Tecan </td><td> Safire II </td><td></td></tr></tbody></table> PCR cuantitativa <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / Equipo </td><td> Empresa </td><td> Catálogo / Número de modelo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> revertir iScript kit de transcripción </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-8891 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green </td><td> Invitrogen </td><td> S7563 </td><td></td></tr><tr><td> Platino Taq polimerasa </td><td> Invitrogen </td><td> ARN Ultrasense 11732-927 </td><td></td></tr><tr><td> iCycler termociclador </td><td> Bio-Rad </td><td> iCycler Módulo óptico </td><td></td></tr><tr><td> iCycler software del sistema </td><td> Bio-Rad </td><td> v. 3.1 </td><td></td></tr></tbody></table> PCR cuantitativa de Microarrays <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / Equipo </td><td> Empresa </td><td> Catálogo / Número de modelo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> RNasa lejos </td><td> BioProducts molecular </td><td> # 7000 </td><td></td></tr><tr><td> RT 2 Kit primer capítulo </td><td> SABiosciences </td><td> C-03 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green PCR basada en la mezcla </td><td> SABiosciences </td><td> PA-011 </td><td> Específicas para iCycler </td></tr><tr><td> RT 2 Profiler PCR matriz </td><td> SABiosciences </td><td> PARN-011A </td><td></td></tr></tbody></table> Ensayo de proteómica <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / Equipo </td><td> Empresa </td><td> Catálogo/ Número de modelo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Lisis celular kit </td><td> Bio-Rad </td><td> 171-304011 </td><td></td></tr><tr><td> Microcentrífuga </td><td> Fisher Scientific </td><td> Micro 7 </td><td></td></tr><tr><td> BSA de valores de proteína </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0007 </td><td></td></tr><tr><td> Proteína BCA kit de ensayo </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23225 </td><td></td></tr><tr><td> Inmuno 96 MicroWell placas </td><td> Nunc </td><td> 449824 </td><td></td></tr><tr><td> Cinta aislante </td><td> Bio-Rad </td><td> 2239444 </td><td></td></tr><tr><td> 96 y lector de placas </td><td> Perkin Elmer </td><td> 1420-mulilabel contra </td><td></td></tr><tr><td> Bioplex TNF-α rata citoquinas ensayo </td><td> Bio-Rad </td><td> X0000001T </td><td></td></tr></tbody></table> Inmunotinción <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / Equipo </td><td> Empresa </td><td> Catálogo / Número de modelo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> 16% de paraformaldehído </td><td> Alfa Aesar </td><td> 43368 </td><td></td></tr><tr><td> Lisina </td><td> Sigma </td><td> L-6001 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato de sodio </td><td> Fisher Scientific </td><td> S374-1 </td><td></td></tr><tr><td> Peryodato de sodio </td><td> Sigma </td><td> S-1878 </td><td></td></tr><tr><td> Azida de sodio </td><td> Sigma </td><td> S-2002 </td><td></td></tr><tr><td> Peróxido de hidrógeno (30%) </td><td> Sigma </td><td> H1009 </td><td></td></tr><tr><td> De suero de cabra </td><td> Colorado Serum Empresa </td><td> CS 0920 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> T-8787 </td><td></td></tr><tr><td> Platos de tinción </td><td> Ted Pella, Inc. </td><td> 14511 </td><td></td></tr><tr><td> Agitador de placas </td><td> Lab-line Instruments, Inc. </td><td> 3520 </td><td></td></tr><tr><td> # 1 Filtro de documentos (185 mm) </td><td> Whatman </td><td> 1001-185 </td><td></td></tr><tr><td> 3,3-diaminobencidina </td><td> Sigma </td><td> D8001 </td><td></td></tr><tr><td> Dimetilsulfóxido </td><td> Sigma </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Pharmco-AAPER </td><td> 111000200 </td><td></td></tr><tr><td> Xileno </td><td> Fisher Scientific </td><td> X3S-4 </td><td></td></tr><tr><td> Permount medios de montaje </td><td> Fisher Scientific </td><td> SP15-100 </td><td></td></tr><tr><td> Criostato </td><td> Leica </td><td> cm 3 050 S </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek </td><td> Ted Pella, Inc. </td><td> 27050 </td><td></td></tr><tr><td> De punta fina brocha </td><td> Ted Pella </td><td> 11806 </td><td></td></tr><tr><td> PAP bloqueo de la pluma </td><td> Ted Pella, Inc. </td><td> 22309 </td><td></td></tr><tr><td> SFX potenciador de señal </td><td> Invitrogen </td><td> A31631 </td><td></td></tr><tr><td> Prolongar Antifade </td><td> Invitrogen </td><td> P7481 </td><td></td></tr></tbody></table>

estrategias para el estudio de la neuroprotección de frío preacondicionamiento

Strategies for Study of Neuroprotection from Cold-preconditioning

Lesión neurológica es una causa frecuente de morbilidad y mortalidad de la anestesia general y la relacionada con los procedimientos quirúrgicos que pueden ser aliviados por el desarrollo de soluciones eficaces, fáciles de administrar y tratamientos seguros del precondicionamiento. Tratamos de definir la señalización neuronal inmune responsable de frío preacondicionamiento como medio para identificar nuevas dianas para el desarrollo de terapias para proteger el cerebro antes del inicio de la lesión. Bajo nivel de pro-inflamatorias mediador de señalización cambia con el tiempo son esenciales para el frío preacondicionamiento neuroprotección. Esta señalización es consistente con los principios básicos de hormesis acondicionado fisiológicas, las cuales requieren que los estímulos irritativos alcanzar una magnitud de umbral con el tiempo suficiente para la adaptación a los estímulos para la protección a hacerse evidente. En consecuencia, la demarcación de la señalización inmune involucrados en frío preacondicionamiento neuroprotección requiere que los sistemas biológicos y las manipulaciones experimentales más capacidades técnicas son altamente reproducible y sensible. Nuestro enfoque es utilizar las culturas del hipocampo sector como un modelo in vitro que refleje sus homólogos en vivo con multi-sináptica redes neuronales influenciado por madurez y reposo macroglia / microglia. Este estado gliales es particularmente importante para la microglía, ya que son la principal fuente de citoquinas, que son operativos en el rango de femtomolar. Además, las culturas corte se puede mantener in vitro durante varias semanas, que es el tiempo suficiente para provocar la activación de los estímulos y evaluar las respuestas de adaptación. Por último, las condiciones ambientales puede ser controlada con precisión a partir de cultivos rebanada de manera que la señalización de citoquinas de frío preacondicionamiento se puede medir, imitado, y modulada para diseccionar los aspectos nodo crítico. La señalización de citoquinas análisis del sistema requiere el uso de las técnicas de multiplexado sensibles y reproducibles. Nosotros usamos la PCR cuantitativa para el TNF-α a la pantalla de activación de la microglia seguido por cuantitativa en tiempo real de detección amplia qPCR para evaluar todo el tejido de cambios en las citoquinas. Este último es un medio más sensible y reproducible para medir el sistema de señalización de citocinas varios cambios simultáneamente. Los cambios significativos se confirman con qPCR objetivo y la detección de proteínas. Nos sonda de tejido basado en cambios en las proteínas de citocinas con multiplexado ensayos de citometría de flujo utilizando la tecnología de microesferas Luminex. Células específicas de la producción de citocinas está determinada con inmunohistoquímica doble etiqueta. En conjunto, esta preparación del tejido cerebral y el estilo de uso, junto a las estrategias sugeridas de investigación, puede ser un método óptimo para la identificación de objetivos potenciales para el desarrollo de nuevas terapias que podrían imitar las ventajas de frío preacondicionamiento.

Tratamos de definir la señalización neuronal inmune responsable de frío preacondicionamiento como medio para identificar nuevas dianas para el desarrollo de terapias para proteger el cerebro antes del inicio de la lesión. Se presentan estrategias para el trabajo de tal manera que requieren los sistemas biológicos, además de las manipulaciones experimentales capacidades técnicas que son altamente reproducible y sensible.

Estrategias para el Estudio de la neuroprotección de frío preacondicionamiento

Las lesiones neurológicas son una causa frecuente de morbilidad y mortalidad derivadas de la anestesia general y de los procedimientos quirúrgicos relacionados, las cuales podrían mitigarse mediante...

La lesión neurológica es una causa frecuente de morbilidad y mortalidad asociada a la anestesia general. El objetivo del trabajo presentado en este video es examinar el efecto del acondicionamiento frío en la señalización inmune neural de ratas como medio para identificar nuevos blancos terapéuticos que protejan el cerebro antes del inicio de la lesión. Esto se logra generando cultivos de rebanadas hipocampales de ratas adultas sanas y de larga duración.Los cultivos se exponen a un acondicionamiento frío para inducir una neuroprotección basada en el sistema inmunitario. Luego se añade la toxina anci y se realizan imágenes de los cultivos de secciones. El análisis de las imágenes sugiere que el acondicionamiento frío provoca una reducción drástica en el grado de pérdida neuronal selectiva.Me llamo Richard Craig, y ella es Heidi Mitchell. Somos del Departamento de Neurología de la Universidad de Chicago, y hoy les describiremos cómo la preparación de cultivos en cortes puede utilizarse para responder preguntas sobre neuroprotección que implican señales inmunitarias proinflamatorias de bajo nivel como medio para fortalecer el cerebro frente a enfermedades cerebrales. En términos generales, las personas nuevas en este procedimiento suelen tener dificultades debido a la necesidad de garantizar la viabilidad a largo plazo y cultivos sanos, capaces de mostrar señales proinflamatorias de bajo nivel.Heidi mostrará ahora una serie de procedimientos que utilizamos en el laboratorio para superar estos obstáculos, de modo que la señalización proinflamatoria de bajo nivel pueda medirse como un medio para desarrollar neuroprotectores para el cerebro. Los siguientes experimentos deben realizarse utilizando una bata de laboratorio limpia y guantes estériles colocados sobre las mangas de la bata. Comience colocando todos los materiales necesarios para el procedimiento dentro de una cabina de flujo laminar BSL-1, incluyendo un cortador de tejidos McIlwain con insertos de teflón, una hoja de bisturí, instrumental quirúrgico y placas de Petri para disección.La cabina debe estar ubicada en una sala de cultivo con presión positiva y filtro HIPAA, donde el aire se purifique mediante ventiladores autónomos de limpieza de aire con luz ultravioleta al menos 30 minutos antes de comenzar los experimentos. Coloque una placa fría de disección dentro de la cabina y conéctela a un baño de agua cercano en la cabina de cultivo celular. Coloque un inserto tipo milli cell en cada pocillo de una placa de seis pocillos y agregue 1,1 mililitros de medio de cultivo a cada uno.Coloque la bandeja en un incubador a 36 grados Celsius, 5 % de dióxido de carbono y 95 % de humedad durante al menos 20 minutos. Mantenga calientes a las crías de rata hasta que sean necesarias colocándolas bajo una lámpara de calor. Anestesie la cría colocándola en dióxido de carbono al 100 %. Una vez anestesiada, sumerja la cría en etanol al 100 %, luego separe la cabeza del cuerpo y coloque el cuerpo en un plato de Petri de 100 milímetros y la cabeza en otro.A continuación, utilice tijeras curvas para iris para abrir el cráneo mediante una incisión media seguida de dos cortes laterales a la izquierda y a la derecha detrás de los ojos. Use fórceps angulados para separar el cráneo sobreyacente y una espátula para comenzar a extraer el cerebro. Retire el cerebro cortando los nervios trigéminos con la espátula y coloque el cerebro en la mitad inferior de una placa de Petri de 60 milímetros que contenga 10 mililitros de solución salina tamponada estéril fría suplementada con glucosa.A continuación, utilice la pinza n.º 5 IOx bajo una espátula de iris n.º 2 para diseccionar los hipocampos de cada hemisferio y colóquelos sobre un disco de teflón para el cortador McIlwain. Con la espátula, retire el medio de los tejidos cerebrales utilizando el cortador con un grosor de corte ajustado entre 350 y 400 micrómetros. Corte los hipocampos perpendicularmente a su eje longitudinal con un movimiento rápido de un mililitro perpetuo.Lave las rebanadas recién cortadas fuera de los insertos de teflón y dentro de la mitad superior de una placa de Petri de 60 milímetros que contenga BSS frío. Coloque las rebanadas bajo un microscopio estéreo y examínelas. Identifique cualquier rebanada que tenga un giro dentado intacto y una capa celular parametálica.A continuación, coloque suavemente las tres rebanadas más grandes sobre un inserto, preparando un total de 12 rebanadas por muestra. Coloque los insertos en una bandeja de seis compartimentos y incube a 36 grados Celsius, renovando el medio de crecimiento cada tres o cuatro días. Renovar el medio de crecimiento sustituyendo el medio viejo por medio fresco y tibio.Devuelva las células al incubador de 36 grados después de siete días. Reemplace el medio con 1.1 mililitros de medio neurobasal suplementado sin suero. En el día 18, examine la vitalidad de los cultivos de rebanadas.Comience colocando 1,1 mililitros de ox poel en placas de cultivo de seis pocillos. Coloque la placa en el incubador para calentarla hasta 36 grados Celsius. Mientras tanto, encienda una fuente de luz fluorescente con un filtro fitzy para el microscopio y déjela calentar durante al menos 20 minutos.Esto garantizará una intensidad de luz uniforme. A continuación, utilice pinzas para colocar los insertos de cultivo porción en medio inox durante 10 minutos. Luego, transfiéralos de nuevo al medio libre de SIM.Coloque el inserto de cultivo sobre la platina del microscopio y marque la orientación para detectar de forma irreversible una lesión en la capa parametrial. Coloque los cultivos sobre una superficie aséptica de un microscopio invertido con un aumento de cinco veces, manteniendo las secciones en una orientación similar a la utilizada para el preexamen.Cambie al cubo de emisión de citación FIT CX. Seleccione cultivos que tengan menos de 30 células positivas para cytx en el área ca uno para el preacondicionamiento en frío. Coloque 1,1 mililitros de medio sin suero en una placa de cultivo de seis pocillos y coloque la placa en un incubador a 30 grados con 5% de dióxido de carbono y 95% de humedad durante al menos 20 minutos para equilibrar el medio después de que hayan transcurrido 20 minutos.Retire el medio de equilibración del incubador. Transfiera los insertos de cultivo con las secciones desde el medio libre de suero normal al medio a 30 grados. Luego colóquelos en el incubador a 30 grados durante 90 minutos tras la incubación.Devuelva los cultivos de secciones al medio normal sin suero e incube a 36 grados durante 24 horas. Comience la preselección para el uso experimental de los cultivos de secciones transfiriendo los insertos de cultivo al medio cit para 20 minutos. Mientras las secciones están incubando, encienda la lámpara ultravioleta y la cámara CCD y déjelas calentar durante 20 minutos.Si es necesario, utilice el software para limpiar el CCD exponiéndolo a la luz durante 50 ciclos. Luego, coloque una solución pepeta de 10 microlitros de fluoresceína en 90 microlitros de PBS sobre un hemocitómetro de 100 micrómetros de profundidad y colóquelo en la platina del microscopio. Utilizando el software, ajuste el tiempo de exposición para que el rango dinámico sea de 1000 de 4.096.A continuación, coloque el cultivo de tejido en rebanadas con acondicionamiento previo en frío en el microscopio y adquiera imágenes. Estas se utilizarán para determinar el nivel de fluorescencia de fondo, que se restará de la fluorescencia emitida por las rebanadas lesionadas. Si el acondicionamiento previo en frío por sí solo provocó lesión, se observarán células con aumento de fluorescencia a continuación.Para examinar el efecto de la lesión por exotoxina, transfiera los insertos a medio libre de suero que contenga de 20 a 50 micromolar de MDA que se haya equilibrado a 36 grados Celsius durante al menos 20 minutos. Incube durante 60 minutos a 36 grados Celsius; tras la incubación, el NMDA imita los efectos del neurotransmisor glutamato. Enjuague el NMDA de los insertos sumergiendo cada inserto tres veces en tres placas separadas de 60 milímetros.Cada uno conteniendo 10 mililitros de medio basal neuro, calentado a 36 grados Celsius. No utilice más de tres insertos para cada conjunto de placas de lavado de 360 milímetros. Después del lavado, coloque los insertos en una bandeja que contenga medio fresco y devuélvalos al incubador de 36 grados.Después de 24 horas, calibre la cámara con un estándar de fluoresceína como antes. Luego coloque los cultivos en medio OX durante 20 minutos antes de obtener imágenes. Si los niveles de lesión son bajos un día después de la lesión, extienda el experimento de dos a tres días según sea necesario para cuantificar la lesión utilizando el software metamorph.Defina un área de interés alrededor de la región CA1 para medir la intensidad de una región seleccionada tras la lesión. Copie y pegue el área de interés de la imagen de lesión a la imagen de fondo. A continuación, introduzca los valores de lesión y fondo en Excel utilizando software estadístico.Cuantifique el numerador menos el fondo para los cultivos de control y los sometidos a preacondicionamiento frío; realice la prueba estadística adecuada para comparar el daño en el grupo experimental frente al grupo de control, el cual siempre debe incluirse en cada ensayo experimental. Esta imagen muestra la tinción típica de un cultivo maduro de cortes hipocampales tras 21 días de cultivo in vitro. La marcación de extremos nuevos, mostrada en verde, se utiliza para ilustrar la arquitectura citológica de las neuronas principales.Las neuronas parametales se observan en las áreas CA1 y CA3 del hipocampo, y las neuronas del giro dentado o DG se ven a la izquierda aquí. El área CA1 mostrada con mayor aumento ilustra la morfología ramificada de las microglías en estado de quiescencia. En cultivos maduros de cortes, las células fueron marcadas con el marcador de superficie de microglía CD11b. Esta figura muestra los efectos del acondicionamiento por frío, la neuroprotección y los cultivos de cortes hipocampales incubados con el marcador Cytx verde para células muertas.Las imágenes de prescreening de la izquierda muestran que no hay ninguna lesión aquí. Las culturas control sham se muestran en la parte superior y las culturas con preacondicionamiento frío se muestran en la parte inferior. Las imágenes de la fila central muestran la lesión relativa de las culturas de tejido a los 24 horas tras la exposición a 20 micromolar de NMDA.Téngase en cuenta que la lesión del control simulado es mayor que la de los cultivos expuestos al acondicionamiento frío etiquetado como cp. En la imagen superior izquierda se muestra la escala de calibración de color de lesión relativa. Tradicionalmente, luego se someten los cultivos a un nivel máximo de lesión, como 20 micromolar y MDA durante la noche, para maximizar los niveles de lesión neuronal CA uno y la lesión relativa del acondicionamiento frío frente al simulado, indicada como una proporción de la lesión respecto a la lesión máxima.Sin embargo, la exposición a estímulos de lesión máximos puede no ser suficiente para superar la neuroprotección conferida por el acondicionamiento previo. Por consiguiente, el uso de ratios de lesión respecto a lesión máxima puede no reflejar con precisión la neuroprotección derivada del acondicionamiento previo. Esto es evidente en las imágenes de la derecha, que muestran que los niveles máximos tras acondicionamiento frío son menores que los de los controles simulados.En este estudio, se encontró que el uso de las relaciones entre lesión y lesión máxima podría ocultar la neuroprotección conferida por el acondicionamiento frío. Esto puede observarse en el esquema, donde la lesión simulada se muestra en rojo y la lesión tras el acondicionamiento frío en azul un día después de la exposición a NMDA; tras el acondicionamiento frío, el nivel de lesión se determinó en tres, en comparación con el nivel cinco observado en el control simulado. Esto es consistente con una neuroprotección del 40 %.Sin embargo, si se utiliza un formato tradicional que emplea proporciones como lesión respecto a lesión máxima, no se observa ninguna protección. En otras palabras, 50 % para el grupo control frente a 50 % para el preacondicionamiento frío. Se realizó PCR cuantitativa utilizando muestras de ARNm como se muestra aquí.Los niveles de TNF alfa tras el acondicionamiento frío, representados por la línea azul, fueron más altos que los controles, representados por las líneas verde, amarilla y morada. Esto sugiere que el acondicionamiento frío desencadena un aumento en la producción de TNF alfa en el cerebro; para confirmar los resultados de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa y del arreglo de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa, se realizó una tinción inmunohistoquímica. Este cultivo de secciones se procesó para interleucina 11 mostrada en rojo, y un nuevo final para mostrar las neuronas mostradas en verde.Téngase en cuenta que algunas neuronas parametales, que están indicadas por las flechas, muestran tinción de interleucina 11 y nuevo fin marcado y aparecen en amarillo. Las flechas señalan algunas células más pequeñas que se presume son astrocitos y que muestran únicamente un aumento en la tinción de interleucina 11. Al delimitar el sistema de señalización de citoquinas implicado en la neuroprotección mediante preacondicionamiento frío, es importante tener en cuenta algunos conceptos fundamentalmente importantes.Aunque las citocinas se encuentran en concentraciones extremadamente bajas en el cerebro normal, pequeños cambios en las concentraciones de citocinas alteran la expresión génica. Por lo tanto, incluso a bajas concentraciones, las citocinas tienen un inmenso potencial para modificar la estructura y función del cerebro y, por ende, el fenotipo de un organismo. Este concepto se representa aquí mediante la inversa de la distancia, comenzando con un bigote de gato como punto de referencia y comparando el sodio, el potasio, el pH y el calcio con la TNF alfa.También es importante tener en cuenta que las citoquinas son altamente redundantes y pleiotrópicas: múltiples citoquinas pueden tener efectos similares y una única citoquina puede tener efectos variables. Por lo tanto, para establecer con precisión la base de citoquinas innatas en la neuroprotección frente al acondicionamiento por frío, se deben determinar análisis compuestos de variables relacionadas de señalización. Esto se logra mediante estrategias de ensayos multiplex, que establecerán la firma de citoquinas en la neuroprotección inducida por acondicionamiento por frío. Una vez dominadas, estas culturas pueden prepararse en aproximadamente tres horas y manipularse para su estudio.La respuesta de la preacondicionamiento por frío puede realizarse durante aproximadamente tres días mientras se llevan a cabo estos procedimientos; es fundamental recordar que son necesarias técnicas estériles y un manejo mínimo para preservar la capacidad de detectar señales proinflamatorias de bajo nivel tras estos procedimientos. Otros métodos, como análisis proteómicos y biológicos moleculares, pueden aplicarse a los cultivos para descifrar los mecanismos mediante los cuales el preacondicionamiento por frío ejerce su efecto nutritivo y protector sobre el cerebro.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Hay evidencia acumulada, que el precondicionamiento isquémico (PC) - un reto isquémico no perjudicial para el cerebro - confiere una protección transitoria a una posterior lesión isquémica perjudicial. Hemos establecido oclusión de la arteria carótida común bilateral (BCCAO) como un estímulo para inducir la tolerancia de preacondicionamiento isquémico temprano (IT) de la isquemia cerebral focal transitoria (inducida por la oclusión de la arteria cerebral media, OACM) en ratones C57BL6 / J.

Bilateral Común oclusión de la arteria carótida como un estímulo de preacondicionamiento adecuado para inducir la tolerancia isquémica precoz de isquemia cerebral focal

Fuente: Zheng, Y., et al. Modelos experimentales para estudiar la neuroprotección del postcondicionamiento ácido contra la isquemia cerebral. J. Vis. Exp. (2017)Este video demuestra la aplicación del postacondicionamiento ácido (APC) para evaluar sus efectos neuroprotectores contra la lesión isquémica en un modelo de ratón de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO). Describe los pasos involucrados en la reperfusión en el modelo MCAO y la aplicación de APC durante la reperfusión para...

 Evaluación de los efectos neuroprotectores del postacondicionamiento ácido en un modelo de ratón de isquemia cerebral

Fuente: Poinsatte, K., et al., Cuantificación de la protección neurovascular después del preacondicionamiento hipóxico repetitivo y la oclusión transitoria de la arteria cerebral media en ratones. J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra el método de preacondicionamiento hipóxico repetitivo (RHP) al exponer a un ratón a ciclos de hipoxia controlados antes de inducir un accidente cerebrovascular isquémico. El experimento evalúa sus efectos sobre la estabilidad de la barrera hematoencefálica, la...

Adaptación neuronal al preacondicionamiento hipóxico repetitivo en ratones

Fuente: Brandli, A. Preacondicionamiento isquémico de extremidades remotas: una técnica neuroprotectora en roedores. J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra un protocolo de preacondicionamiento isquémico no invasivo de extremidades en ratas para inducir neuroprotección sistémica. El procedimiento implica la oclusión arterial controlada y la reperfusión, lo que desencadena vías de estrés celular que liberan factores protectores. Estos factores aumentan la resistencia a las lesiones isquémicas y...

Preacondicionamiento isquémico no invasivo de extremidades en un modelo de rata para neuroprotección

Precondicionamiento isquémico remoto (RIP) es un método de acondicionamiento de tejidos contra el estrés perjudicial. Hemos establecido un método de isquemia a distancia hacia la extremidad posterior, inflando un manguito del esfigmomanómetro durante 5-10 minutos. Las capacidades neuroprotectoras de RIP se han demostrado en un modelo de degeneración de la retina en los roedores.

Limb remoto Preacondicionamiento Isquémico: una técnica neuroprotector en roedores

Este protocolo describe el precondicionamiento hipóxico repetitivo, o exposiciones breves a la hipoxia sistémica que reducen los volúmenes de infarto y la interrupción de la barrera hematoencefálica después de una oclusión transitoria de la arteria cerebral media en ratones. También detalla la cuantificación dual del volumen del infarto y la alteración de la barrera hematoencefálica después de un accidente cerebrovascular para evaluar la eficacia de la protección neurovascular.

Cuantificación de Protección neurovascular Siguiendo repetitivo hipóxico Precondicionamiento y transitoria cerebral media oclusión de la arteria en ratones

oclusión quirúrgica de una rama distal de la arteria cerebral media (MCAO) es un modelo frecuentemente usado en investigación del accidente cerebrovascular experimental. Este manuscrito describe la técnica básica de la MCAO permanente, combinado con la inserción de una ventana craneal lateral, que ofrece la oportunidad para microscopía intravital longitudinal en ratones.

Ventana lateral crónica craneal Preparación Activa En Vivo Observación Siguiendo distal de la arteria cerebral media oclusión en ratones

El postcondicionamiento ácido protege contra la isquemia cerebral. Aquí presentamos dos modelos para ejecutar APC. Se consiguen respectivamente transfiriendo rebanadas corticostriatales a un tampón ácido después de la privación de oxígeno-glucosa in vitro e inhalando 20% de CO 2 después de la oclusión de la arteria cerebral media in vivo .

Modelos Experimentales para Estudiar la Neuroprotección del Acondicionamiento Acido Contra la Isquemia Cerebral

Locomoción compleja en ambientes naturalistas que requiere la coordinación cuidadosa de las extremidades consiste en las regiones de la corteza parietal. El siguiente protocolo describe el uso de desactivación reversible inducida por enfriamiento para demostrar el papel del área parietal 5 en evitación del obstáculo memoria-dirigida en el gato caminando.

Desactivaciones reversibles inducida por enfriamiento a estudiar contribuciones corticales a la memoria de obstáculo en el gato caminando

Los distintos efectos de los diferentes grados de hipotermia en la protección miocárdica no han sido evaluados a fondo. El objetivo del presente estudio era cuantificar los niveles de muerte celular tras diferentes tratamientos de hipotermia en un modelo humano basado en cardiomiocitos, sentando las bases para futuras investigaciones moleculares en profundidad.

Evaluación in vitro de la protección miocárdica después del preaccondicionamiento de hipotermia en un modelo de miocitos cardíacos humanos

Este artículo describe dos métodos de inducción de hipotermia de corta duración de cuerpo entero en ratas. El primer método, de inducción rápida, emplea el enfriamiento activo utilizando ventiladores y aerosol de etanol para una rápida disminución de la temperatura. El segundo método es un método de enfriamiento gradual. Esto se logra utilizando la combinación de anestesia con isoflurano y la reducción de los ajustes de temperatura en la estera de calor homeotérmica. Esto resulta en una...

Inducción de hipotermia de corta duración en ratas utilizando modelos para estudios que examinan la relevancia clínica y los mecanismos

Aprende a investigar la neuroprotección por preacondicionamiento en frío usando cultivos de hipocampo de rata. Este método permite analizar señalización inmune neural y citocinas como TNF-α e interleucina 11 para identificar dianas terapéuticas.

Estrategias para el Estudio de la neuroprotección de frío preacondicionamiento

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