JoVE Encyclopedia of Experiments
Inmunología
0 vistas • 5:33 min • July 8th, 2025
Para un ensayo de microneutralización, tome una placa de pocillos múltiples que contenga suero humano diluido en serie inactivado por calor con concentraciones decrecientes de anticuerpos neutralizantes específicos de la influenza.
Introducir virus patógenos de la influenza. Los anticuerpos séricos interactúan con los virus y los neutralizan; sin embargo, las diluciones séricas más altas exhiben una neutralización limitada del virus.
Semilla con células de riñón canino Madine-Darby, o células MDCK, que sobreexpresan residuos de ácido siálico humano en su superficie.
En la dilución más alta, los virus de la influenza no neutralizados se fusionan con el ácido siálico de las células, liberando el genoma viral en el citoplasma celular.
Los genes virales se transcriben y traducen a proteínas virales y nucleoproteínas dentro de la célula huésped.
Tratar con una alta concentración de acetona para fijación y permeabilización.
Introducir anticuerpos primarios que interactúan con las nucleoproteínas virales.
Superposición con anticuerpos secundarios conjugados con enzimas que interactúan con anticuerpos primarios. Lavar y tratar con el sustrato de la enzima, produciendo un producto coloreante.
Cuantifique las intensidades de color y grafique contra la dilución sérica; la dilución sérica más alta, logrando una neutralización del virus del cincuenta por ciento, representa el título de neutralización.
El día 1 del ensayo de MN, descongele los sueros en un baño de agua a 37 grados Celsius y retírelos inmediatamente después de descongelarlos. Inactivar con calor los sueros humanos durante 30 minutos en un baño de agua a 56 grados Celsius, como se describe en el protocolo de texto. A continuación, colocar los sueros en hielo y añadir el diluyente del virus a los sueros para conseguir una predilución de 1 a 10.
Para realizar la prueba con un virus, agregue 50 microlitros de diluyente de virus a las filas B a H, excepto las columnas 11 y 12. A continuación, añadir 100 microlitros de 1 de 10 sueros diluidos a las columnas A1 a A10. Realice una dilución en serie doble de las filas A a H y deseche los últimos 50 microlitros en la fila H.
Para el control del virus, agregue 50 microlitros de diluyente del virus a los pocillos A12, B12, C12 y D12. Para el control celular, agregue 100 microlitros de diluyente de virus a los pocillos E12, F12, G12 y H12. Para los sueros de control, agregue 100 microlitros de sueros de control diluidos al pocillo A, columna 11, y agregue 50 microlitros de diluyente de virus a los pocillos B11 a H11. Proceda a diluir en serie. Cubra las placas e incube a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono, hasta que esté listo para la adición del virus.
Para la adición de virus, diluya el virus a 100 TCID50 en 50 microlitros con diluyente de virus. Agregue 50 microlitros de virus diluido a todos los pocillos, excepto la columna 11 en las placas de titulación posterior y los pocillos de control celular E12, F12, G12 y H12 en todas las placas. Agregue 50 microlitros de diluyente de virus a todos los pocillos en la columna 11. Luego, agregue 50 microlitros del virus a 100 TCID50 en 50 microlitros al primer pocillo.
A continuación, mezcle y transfiera 50 microlitros a pocillos sucesivos para realizar diluciones seriadas dobles. Cambie las puntas de pipeta entre pocillos para evitar la transferencia de virus. Deseche 50 microlitros del pocillo H11, luego agregue 50 microlitros de diluyente de virus a la columna 11 para llevar el volumen final a 100 microlitros. Golpea los platos para mezclar. Incube las placas a 37 grados Celsius, 5% de dióxido de carbono durante una hora antes de realizar la adición de células MDCK el primer día y ELISA el segundo día como antes.
Después de agregar los anticuerpos primarios y secundarios, como se describe en el protocolo de texto, realice la adición del sustrato y la lectura de la placa. Lave las placas cinco veces con 300 microlitros de tampón de lavado y golpee con una toallita sin pelusa. Agregue 100 microlitros de sustrato OPD recién preparado a cada pocillo. Luego, incube las placas a temperatura ambiente hasta que los pocillos de control del virus alcancen una densidad óptica de 490 nanómetros entre 0,8 y 3, con el control celular a un OD de fondo bajo inferior a 0,2. A continuación, agregue 100 microlitros de la solución de parada a todos los pocillos.
Lea el diámetro exterior de los pocillos a 490 nanómetros, utilizando un espectrofotómetro de microplacas. Finalmente, determine el título de anticuerpos neutralizantes de cada muestra de suero, como se describe en el protocolo de texto.