La formación de colonias de células (CFC) para el ensayo de células hematopoyéticas humanas

Este procedimiento evalúa en un medio semisólido, la capacidad de los progenitores hematopoyéticos para proliferar y diferenciarse a lo largo de diferentes linajes hematopoyéticos para iniciar el cultivo. Células CD 34 positivas recién descongeladas en presencia de citocinas para promover la activación después de dos días. Realice la transducción retroviral de una construcción de prueba que exprese GFP mediante la adición de las células positivas CD 34 activadas a una placa precargada con virus.

48 horas más tarde, se aíslan las células GFP positivas por fax, luego se colocan estas células en medio semisólido de metilcelulosa suplementado con factores de crecimiento y se incuban durante aproximadamente dos semanas hasta que aparecen las colonias en la superficie. Finalmente, cosechar las colonias, inmovilizar las células en portaobjetos usando citosina y teñir con giza derecho para la determinación microscópica del linaje hematopoyético y la etapa de maduración. Este método puede proporcionar información mecanicista en los estudios de la leucemogénesis, es decir, los efectos de los oncogenes en la diferenciación hematopoyética.

Para ver un cultivo se descongela rápidamente un vial de células CD 34 positivas congeladas a 37 grados centígrados agitando suavemente hasta que quede un último cristal de hielo pequeño y transfiere la suspensión celular a un tubo cónico de 50 mililitros. Enjuague suavemente las células restantes del vial con un mililitro de medio a temperatura ambiente, 2% F-B-S-I-M-D-M y agréguelo gota a gota al tubo de 50 mililitros mientras agita suavemente. Ahora espere tres minutos.

Continúe agregando lentamente dos mililitros de medio mientras mezcla suavemente y nuevamente equilibre durante tres minutos. Repita este procedimiento de agregar medios de igual volumen a la suspensión celular diluida a intervalos de tres minutos, girando suavemente entre adiciones hasta que el volumen final alcance los 32 mililitros para recoger las celdas, centrifugar a 250 G durante 10 minutos a temperatura ambiente y eliminar el supernat, dejando alrededor de 0,5 mililitros de medio por encima del pellet. Proceda a lavar las celdas una vez suspendiendo el pellet en 20 mililitros de medio y centrifugando a 200 G durante ocho minutos A temperatura ambiente, retire la cuerda y suspenda las celdas en medio IMDM completo a aproximadamente medio millón de celdas por mililitro.

Finalmente, para determinar la concentración celular, tome 10 microlitros de la suspensión en un microtubo mezclado con el mismo volumen de solución de azul de triano al 0,4% y cuente. Usando un hemocitómetro, diluya las células a 10 a la quinta celda por mililitro agregando medio IMDM completo complementado con la mezcla de cultivo de citocinas activadoras, las células en una incubadora humidificada a 37 grados Celsius con dióxido de carbono al 5% durante dos días el día de la transducción cuentan las células antes de comenzar la precarga del virus para determinar el número de pocillos que se deben preparar para preparar una placa de cultivo de tejidos no tratada de 24 pocillos. Agregue 400 microlitros de 25 microgramos por mililitro, solución de actina retro a cada pocillo e incube durante dos horas a temperatura ambiente en la campana de bioseguridad de flujo laminar.

Retire la solución de actina retro y codifique cada pocillo con 2%BSA incubando durante 30 minutos a temperatura ambiente. Mientras tanto, descongele las soluciones de stock de virus y guárdelas en hielo. A continuación, aspire el virus de carga de solución BSA añadiendo 0,5 mililitros de preparación de virus a cada pocillo y centrifugue a 2.200 G a cuatro grados centígrados durante 15 minutos.

Retire la solución de virus de los pocillos y repita la carga del virus tres veces más. Finalmente, enjuague cada pocillo con medio IMDM frío. Ahora recoja las células CD 34 positivas preactivadas por centrifugación y vuelva a suspender las células en un medio IMDM completo y fresco suplementado con citocinas alícuota 0,15 millones de células CD 34 positivas en cada uno de los pocillos codificados por el virus e incube en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante dos días para cosechar las células transducidas de manera suave pero completa.

Suspenda las células de las placas flotantes del virus y filtre la suspensión a través de un filtro de células de 50 micras en un tubo cónico. Tome 10 microlitros de la suspensión celular en un microtubo. Mezcle con un volumen igual de solución de azul de triano y cuente las células con un hemocímetro.

Enjuague cada pocillo con 0,8 mililitros de HBSS frío con 0,02% de EDTA y agregue al mismo tubo de recolección a través de un filtro celular CEL Trix de 50 micras. Granular las células por centrifugación y lavar una vez con HBSS frío. Vuelva a suspender el pellet de celda final en HBSS con 1%BA y mantenga las celdas en hielo en la oscuridad para la posterior clasificación de celdas, que generalmente se realiza en una instalación central de clasificador de celdas de alta velocidad basada en el diseño experimental.

Descongele vigorosamente el número requerido de alícuotas de vórtice de medios de ensayo de CFC para mezclar y deje reposar el tubo durante al menos cinco minutos para permitir que las burbujas suban a la superficie antes de agregar las células. Ahora tome 3000 células clasificadas transducidas por virus en un microtubo estéril que contenga medios fríos de 2% F-B-S-I-M-D-M y ajuste el volumen final de la suspensión a 0,3 mililitros. Suspenda las células y transfiera toda la suspensión celular a una alícuota de tres mililitros de medio de crecimiento de culto al metilo.

Cree una suspensión celular homogénea mediante vórtices vigorosos. Deje que el tubo permanezca quieto durante tres minutos. Para colocar las pilas, coloque una aguja roma de calibre 16 en una jeringa de tres mililitros y extraiga 2,2 mililitros.

Teniendo cuidado de evitar la absorción de burbujas grandes, empuje 1,1 mililitros cada una en dos placas de cultivo de tejidos no tratadas de 30 milímetros y extienda la mezcla uniformemente girando, coloque placas duplicadas en una placa de 100 milímetros junto con un plato de agua. Continuando con tres litros de cultivo de agua estéril durante dos semanas. Caracterizar y puntuar las colonias según su morfología con un microscopio invertido con un aumento de 40x en una placa de cultivo marcada con una cuadrícula de puntuación.

Con el fin de documentar los resultados del cultivo, escanee toda la placa de ensayo de CFC utilizando un escáner normal a 600 DPI y tome fotomicrografías de baja potencia de colonias representativas utilizando un microscopio invertido equipado con una cámara a color para un análisis posterior de la diferenciación y proliferación. Las células de toda la placa de ensayo de CFC se recuperan suspendiendo en varios volúmenes de temperatura ambiente 2%F-B-S-I-M-D-M lavados y contados para los análisis morfológicos. Transfiera 30.000 células que se recuperaron de placas de ensayo de CFC a un portaobjetos. Usando una centrífuga de centrifugación STO, seque al aire los portaobjetos durante la noche para teñirlos de manera eficiente.

Configure una línea de montaje de nueve recipientes de tinción que contengan soluciones en el siguiente orden. Metanol absoluto derecho gemsa solución madre derecha gemsa tampón, 50%metanol y agua, dos recipientes de tampón de fosfato de agua pH seis y finalmente dos recipientes de agua. Coloque los portaobjetos en un portaobjetos y sumérjalos en metanol absoluto durante dos minutos y elimine el exceso de metanol.

Sumerja inmediatamente el portaobjetos y escriba la solución madre de gemsa durante cinco minutos. Transfiera el portador al tampón gemsa derecho pH 6.4 e incube durante 10 minutos. Sumerja el portador dos veces en metanol al 50% 10 veces en agua y otras 10 veces en el siguiente recipiente de agua y luego cinco veces en tampón de fosfato.

pH 6.0. Transfiera el portador al agua e incube durante dos minutos. Repita el lavado en el último recipiente de agua.

Ahora deje que los portaobjetos se sequen completamente al aire en el transportador. Retire cada portaobjetos y limpie la parte posterior del portaobjetos con toallitas Kim empapadas en metanol para eliminar las manchas. Coloque una gota de cyto seal 60 y un cubreobjetos para sellar.

Realice un recuento diferencial de 500 células para cada portaobjetos sostenido GM utilizando un microscopio. A los efectos de este experimento, las células se dividen en cinco categorías: células primitivas, células mieloides intermedias, células mieloides maduras, células eritroides intermedias y células eritroides maduras. Por ejemplo, cuando se comparó con la expresión de control de los nuevos 98 halcones, un oncogén de nueve aumentó la formación de colonias de eritroides rojos.

Este impacto del oncogén en el mercado es claramente evidente cuando las colonias se observan con bajo aumento. Un examen morfológico adicional mediante el sostenimiento de GEM proporciona información sobre el linaje y el grado de maduración de la población celular. En este ejemplo, la introducción de nuevos 98 Hawks, un nueve causó un aumento general en el número de células con hiperplasia eritroide e inhibió la inhibición de la maduración eritroide y mieloide.

Este SA proporciona información sobre la diferenciación de las células hematopoyéticas mediante la medición de la capacidad de una preparación de células de entrada para proliferar, diferenciarse y formar colonias en un medio semisólido.