Protocolo para las infecciones de dengue en mosquitos (Aedes aegypti) y determinación de fenotipo infección

Soy George Dimopoulos, y ahora les mostraremos un procedimiento sobre cómo infectar el mosquito Aidas GTI con el virus del dengue. Y lo primero que tendremos que hacer es propagar el virus en una línea celular Aidas Us. Mi nombre es José Luis Ramírez, y soy estudiante de doctorado en el ous Lab.

Para este procedimiento, necesitaremos una instalación BSL two con una campana de cultivo de tejidos, una incubadora de CO2 configurada a 37 grados centígrados. Necesitamos tubos cónicos de plástico de 50 ml. Necesitamos suero humano, necesitamos un baño de agua, a 37 grados centígrados, una centrífuga.

Necesitamos placas de 96 pocillos y otros estándares de biología molecular y bioquímica, reactivos y consumibles. Por lo tanto, se trata de una campana de cultivo de tejidos regular en una instalación BSL dos, y el primer paso es extraer las células que han crecido hasta una fluidez del 80% en un matraz de 75 centímetros cuadrados. Se trata de un medio MEM con un 10% de calor, calor y suero fetal bovino activado suplementado con un 1% de L-glutamina y aminoácidos no esenciales.

Bien, ahora agregaremos el virus del dengue a las células. Hemos sacado el stock de virus del congelador a menos 80 y lo hemos descongelado en una incubadora a 37 grados. Añadimos unos 0,5 mililitros de material de virus a las células para lograr una concentración de aproximadamente 1,5 partículas de virus por célula.

A continuación, las células se colocan en un agitador durante unos 15 minutos a un ritmo de agitación lento. A continuación, las células se colocan en una incubadora de CO2 durante unos 45 minutos. A 37 grados centígrados, la concentración de CO2 es del 5%Después de la incubación de 45 minutos, sacaremos las células y agregaremos 30 ml de medio, y luego colocaremos las células en la incubadora nuevamente e incubaremos durante otros cinco días.

Ahora prepararemos las partículas del virus para la infección. Primero, debemos separar las células del matraz con un raspador y luego transferirlas junto con un medio a un tubo cónico de 50 ml. Ahora tenemos celdas centrífugas a 12.000 RPM durante 10 minutos para pelletizarlas.

En la parte inferior de esta botella, se puede ver el pellet. A continuación, retiraremos el sobrenadante y solo dejaremos un ml con las células para poder liberar el virus de las células. Los congelaremos.

Eso romperá las células, y luego las descongelaremos y luego las volveremos a congelar y repetiremos este procedimiento tres o cuatro veces y la congelación se realiza en hielo seco. Después de la congelación, el pellet de la célula se coloca en un baño de agua a 37 grados para descongelarlas, y luego se congelan nuevamente en los ojos secos entre cada paso de congelación, WEP suspende las células a través del vórtice. Ahora estamos recolectando el virus que contiene sobrenadante y lo estamos agregando al sobrenadante de la centrifugación anterior, que también contiene partículas de virus.

Esta preparación viral ahora está lista para ser combinada con una cantidad igual de sangre humana entera y suero. Aquí hemos combinado la preparación del virus con sangre humana entera suplementada con un 15% de suero humano. Esta solución de virus de la sangre se va a utilizar ahora para alimentar a los mosquitos e infectarlos.

Vamos a añadir esta sangre en un alimentador de membrana y este alimentador de membrana se colocará en un recipiente que contiene los mosquitos y dejaremos que los mosquitos se alimenten de esta sangre durante unos 25 minutos. Hemos colocado un clip en el alimentador de membrana con el fin de estabilizarlo. Lo pesa básicamente en la red, y ahora agregaremos la sangre al alimentador.

En algunas ocasiones, este experimento puede funcionar mejor cuando se realiza en la oscuridad, ya que, naturalmente, los mosquitos se alimentan con frecuencia en la oscuridad. Esto depende, por supuesto, de cómo se haya acondicionado la colonia de mosquitos. Los mosquitos ya se han alimentado durante unos 25 a 30 minutos, y podemos quitar el comedero de membrana y colocarlo en un recipiente seguro para su descontaminación.

Después de la extracción de sangre, los mosquitos no aptos deben eliminarse de los Fed . Para hacer esto, derribamos a los mosquitos colocando las tazas pequeñas que contenían los mosquitos alimentados con sangre en una habitación fría durante cinco a 10 minutos. Como podemos ver, los mosquitos ya están en el frío.

Abrimos la tapa y transferimos los mosquitos en un pequeño plato de gasolina, que se mantiene en una cubitera para que los mosquitos se mantengan fríos todo el tiempo y no puedan escapar. Recuerde, estos son mosquitos infectados, por lo que se debe tener todo el cuidado para que no se suelten. Una vez que los mosquitos están en la cámara frigorífica, que transfieren los mosquitos al sector normal, que se mantiene a temperatura ambiente, pero ponemos los mosquitos siempre en la placa de petróleo, que se mantiene en la cubitera, para que estén allí para que siempre estén abajo.

Se puede ver cómo se pueden eliminar los mosquitos de la Fed de los de la UNFI. Los de la Fed tienen la sangre en ellos. Están completamente hinchados.

Algunos de ellos se han alimentado parcialmente de sangre, por lo que no están completamente hinchados. Tienen una pequeña cantidad de sangre en el abdomen, pero otros tienen mucha sangre en el abdomen. Los UNFI no tienen sangre en el abdomen, por lo que se puede distinguir fácilmente entre los federales y los no aptos.

Así que transferiremos estos mosquitos del plato de gasolina a los vasos de cartón de la línea de cera. El siguiente paso es analizar la infección por el virus del dengue en el mosquito. Si queremos analizar la infección viral en el intestino medio del mosquito, debemos diseccionar los mosquitos alrededor del séptimo día después de que hayan tomado la comida de sangre.

Y si desea analizar la infección viral en la glándula sali, debemos diseccionar los mosquitos alrededor de los 14 días después de la alimentación con sangre, José ahora le mostrará cómo diseccionar el intestino del mosquito. Los mosquitos ya han sido anestesiados en hielo, y los mataremos a través de una incubación en etanol al 70% durante aproximadamente un minuto. A continuación, pasamos los mosquitos a dos baños de agua sucesivos.

Un minuto cada uno. Esto es para lavar el etanol de los mosquitos. Ahora diseccionaremos los mosquitos en PBS en portaobjetos de microscopio.

La mejor manera de diseccionar el intestino medio de un mosquito gitano es colocar el mosquito boca abajo sobre sus alas y agarrar la parte abdominal con una pinza y el tórax con otra pinza, y luego tirar del mosquito. Ahora José está separando el mosquito y aparecerá la tripa entre el abdomen y la parte torácica del mosquito. Ahora el intestino es el tejido semitransparente que ha aparecido en la parte superior del mosquito.

Ahora transferiremos el intestino disecado a un medio de línea celular y lo llevaremos a la campana de cultivo de tejidos para aislar las partículas del virus del intestino. Llevamos las tripas medias disecadas a la sala de cultivo de tejidos y las homogeneizamos con un mortero para liberar las partículas del virus. Después de la homogeneización del intestino medio, añadimos medio al homogeneizado para lograr una dilución de uno a 100 de las partículas del virus.

Luego continuamos diluyendo esto aún más a uno a 10, de uno a 101 a 1000. En la placa de 96 pocillos, hemos preparado la línea celular Alba picto con un 80% de fluidez en una placa de 24 pocillos. A continuación, retiramos el supnatante de las células de hiato alba picto y a estas células añadimos las partículas de virus diluidas para determinar la concentración de partículas de virus en cada dilución.

Esto nos permitirá determinar el nivel de infección del virus. En el intestino medio del mosquito, las células se agitan lentamente durante 15 minutos a temperatura ambiente. Luego colocamos las células durante 45 minutos en la incubadora de CO2 a 37 grados.

A continuación, añadimos un ml de superposición de metilcelulosa al 1% a cada pocillo, y la placa se incuba de nuevo a 37 grados de CO2 en la incubadora durante cinco días. Después de los cinco días de incubación, añadimos un ml de un fijador de metanol de acetona a cada pocillo. Luego incubamos la placa a cuatro grados centígrados en un refrigerador durante una hora.

A continuación, retiramos el fijador y lavamos cada pocillo una vez con PBS. A continuación, hacemos una dilución de uno a 1000 del anticuerpo primario anti dengue en una solución de sangre al 5%. A continuación, añadimos 200 microlitros de esta solución de anticuerpos.

A cada uno, bien Mueve la cabeza. Gracias. A continuación, incubamos la placa durante una hora a 37 grados centígrados. A continuación, retiramos el líquido hiperinmune y lavamos cada pozo con un XPBS.

A continuación, repetimos el procedimiento exactamente de la misma manera con un anticuerpo secundario. Preparamos 20 ml del sustrato según el protocolo, y lo añadimos a un recipiente. Luego añadimos 200 microlitros del sustrato a cada pocillo.

A continuación, detenemos la reacción retirando el sustrato y añadimos un ml de agua destilada a cada pocillo. Luego desechamos el agua del plato y dejamos que el plato se seque. Cada punto de color representa una placa de virus, y al contar estas placas, podemos estimar el número de partículas de virus que estaban en el intestino medio original del mosquito que homogeneizamos.

Acabamos de mostrarte el Procedimiento de cómo realizar una infección por el virus del dengue en el mosquito aegypti. Este protocolo implica la producción del virus en la línea celular del mosquito. A continuación, las partículas del virus se purifican de la línea celular y se aíslan, y se mezclan con sangre humana entera y se alimentan a los mosquitos.

El virus infectará a los mosquitos y, una vez que se ha establecido la infección, le hemos mostrado cómo aislar el tejido del intestino medio del mosquito y cómo determinar el nivel de infección de este intestino medio. Básicamente, homogeneizamos el intestino medio y utilizamos el procedimiento para liberar las partículas del virus de este intestino medio. A continuación, utilizamos estas partículas de virus para infectar de nuevo la línea celular del mosquito con el fin de determinar el nivel de infección del intestino medio, el número de partículas de virus que han infectado el intestino del mosquito.