Name: Protocolo para las infecciones de dengue en mosquitos (Aedes aegypti) y determinación de fenotipo infección (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T21:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 25 s
Description: Aprende a infectar mosquitos Aedes aegypti con virus del dengue para estudiar genes de resistencia viral. Este protocolo detalla propagación viral, alimentación de mosquitos y titulación en intestino medio y glándulas salivales.

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A. propagar el virus en la línea celular C6/36. <ol><li> Las células crecen un 80% de confluencia en 75 cm 2 frasco; </li><li> Retire el papel con 3.4 ml restantes en el frasco; </li><li> Tomar 0,5 ml de virus de archivo y añadir en la celda de arriba con la multiplicidad de infección de 1,5 partículas virales por célula. Agitando el matraz durante 15 minutos lentamente a la temperatura ambiente. </li><li> Incubar durante 45 minutos a 5% de CO 2 y 37 ° C </li><li> Añadir 30 ml de medio, y se incuba durante 5 días. </li></ol> B. Prepare la mezcla de virus y la sangre <ol><li> Separe la celda con el raspador y la transferencia de la célula y los medios de comunicación a los 50 tubos cónicos mL; </li><li> Centrifugado a 800g durante 10 minutos, recoger el sobrenadante, pero deje 1 ml de sobrenadante con el pellet de células; </li><li> Congelar el sedimento celular por encima de las emisiones de CO 2 en seco y luego descongelar a 37 ° C baño de agua, repetir dos o tres veces; </li><li> Centrifugado a 800g durante 10 minutos, tome el sobrenadante, y se combinan con el sobrenadante se recogió desde el paso 3; </li><li> Recoger la sangre humana entera con el mismo procedimiento (paso 3) para la preparación de la cultura de gametocitos de infectar a los mosquitos Anopheles con Plasmodium falciparum; </li><li> Combine la misma cantidad de lo anterior la sangre humana entera con sobrenadante de virus desde el paso 4, y añadir suero humano (10% del volumen total). </li><li> Incubar la mezcla por encima de la sangre humana y el virus del dengue durante 30 minutos a 37 ° C baño de agua </li></ol> C. mosquitos Alimentación Este procedimiento es casi idéntico a lo que se han descrito en la sección de infecciones por Plasmodium falciparum en los mosquitos. Nos ensayo de la infección del intestino medio en el día 7, y la infección por la saliva a los 14 días después de que se alimentan de sangre. Todo el material que entró en contacto con el virus se trata en primer lugar con el 75% de etanol y luego con lejía al 10%. D. Ensayo el título del virus en los tejidos del mosquito <ol><li> Dos o tres días antes de la disección de los tejidos del mosquito, crecer C6/36 células en una placa de 24, así como que las células alcanzan el 80% de confluencia en el día en que el ensayo se lleva a cabo; </li><li> Los mosquitos son anestesiados a 4 ° C, sacrificado y superficie estéril por inmersión en etanol al 75% durante 1 minuto. A continuación, los mosquitos se lavaron con agua estéril dos veces antes de la disección de las glándulas salivales del intestino medio o bajo el microscopio de disección. A partir de este paso, todo el procedimiento que figura a continuación se llevó a cabo en un ambiente estéril, como una cabina de seguridad biológica. Estos tejidos se transfiere a un tubo que contiene 150 l de medios y homogeneizado con una pastilla Kontes mortero motor durante 90 segundos; </li><li> Realizar una dilución al 1:100 añadiendo 10 l de la homogeneizado en 990 medios de comunicación l; </li><li> Hacer más de 1: 10, 1:100 y 1:1000 dilución con el medio de la placa de 96 pozos; </li><li> Retire el papel de la placa de 24 pocillos, y añadir 100 ml de cada una de las cuatro disoluciones correspondientes a cada pocillo; </li><li> Agitar la placa lentamente durante 15 minutos a la temperatura ambiente, luego se incuban durante 45 minutos a 5% de CO 2 y 37 ° C; </li><li> Añadir 1 ml de Metilcelulosa superposición (1%) a cada pocillo; </li><li> Incubar las placas a 37 º C con CO2 al 5% durante 5 días; </li><li> Los pasos de aquí en adelante no requieren de un ambiente estéril, pero como con cualquier otro agente patógeno de cuidado se debe tomar en todo momento. Deseche superposición Metilcelulosa de cada placa y borrar para eliminar el exceso de material </li><li> Añadir 1 ml de solución fijadora metanol / acetona (1:1) a cada pocillo. Mantener a 4 ° C durante 1 hora; </li><li> Vierta el fijador, y lavar una vez con PBS 1X; </li><li> Hacer la dilución 1:1000 a la primaria de anticuerpos contra el virus con un 5% Blotto; </li><li> Añadir 200 l de fluido hiperinmune diluido a cada pocillo, incubar a 37 ° C durante 1 hora; </li><li> Extraer el líquido hiperinmune y la placa de lavar con PBS 1 X </li><li> Prepare una dilución 1:1000 de cabra anti-ratón conjugado (Cat. KPL # 074 a 1806) en BLOTTO del 5% (leche descremada en polvo 5 g en 100 ml de 1 X PBS), a continuación, añadir 200 l en cada pocillo e incubar a 37 ° C durante 1 hora; </li><li> Prepare el sustrato de la siguiente manera: añadir 1 tableta de 3&#39;-Diaminobencidina terrahydrochloride (Cat. Sigma # D5905) en 20 ml de 1 X PBS, después de disolverse, y se añaden 8 l de peroxidasa de hidrógeno al 30% </li><li> Añadir 200 l de sustrato por encima a cada pocillo. Deje reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos </li><li> Retire del sustrato y detener la reacción mediante la adición de 1 ml de agua destilada a cada pocillo </li><li> Vierta en platos de agua y secarlos a secas </li><li> Contar con la partícula del virus </li></ol>

<table><tbody><tr><td>Incubadora</td><td></td><td></td><td></td><td>con 5% CO2, 37°C</td></tr><tr><td>Tubos cónicos de 50 ml</td><td></td><td></td><td></td><td>plástico</td></tr><tr><td>Punta de pipeta</td><td></td><td></td><td></td><td>para cultivo de tejidos</td></tr><tr><td>Pipetaman</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de Pasteur</td><td></td><td></td><td></td><td>vidrio, estériles</td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td></td><td></td><td></td><td>37°C</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua con circulación</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alimentadores de membrana de vidrio</td><td></td><td></td><td></td><td>con tubo de goma para adaptar los alimentadores</td></tr><tr><td>Vasos para mosquitos</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etileno al 75%</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lejía al 10%</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular</td><td></td><td></td><td></td><td>placas de 6, 24 y 96 pocillos</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td></td><td></td><td></td><td>vidrio</td></tr><tr><td>Portaobjetos</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de punta fina</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td><td>1X, estéril</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Microscopio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Células C6/36</td><td>células</td><td></td><td></td><td>Para propagación de virus</td></tr><tr><td>Medio C6/36</td><td></td><td></td><td></td><td>MEM con 10% de SFB inactivado por calor, 1% de L-glutamina y aminoácidos no esenciales, y 1% (v/v) de penicilina-estreptomicina.</td></tr><tr><td>3&amp;rsquo;-Diaminobencidina tetrahidrocloruro</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5905</td><td>1 tableta en 20 ml de PBS 1X, disolver y luego añadir 8 &amp;#x03BC;l de peróxido de hidrógeno al 30%</td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno al 30%</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A. aegypti</td><td>Animal</td><td></td><td></td><td>mosquito</td></tr></tbody></table>

protocolo para las infecciones de dengue en mosquitos (aedes aegypti) y determinación de fenotipo infección

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

El propósito de este procedimiento es para infectar a los mosquitos Aedes con el virus del dengue en una condición de laboratorio y examinar el nivel de infección y dinámica de los virus en los tejidos del mosquito. Este protocolo se utiliza rutinariamente para el estudio de las interacciones entre el virus de mosquitos, especialmente para la identificación de los factores del huésped novela que son capaces de determinar la competencia del vector. El experimento debe ser realizado en un laboratorio BSL2. Al igual que en las infecciones por Plasmodium falciparum, vestimenta adecuada, guantes y bata de laboratorio se debe usar en todo momento. Después del experimento, todos los materiales que entraron en contacto con el virus deben ser tratadas con etanol 75% y se blanquea antes de proceder con el lavado normal. Todos los otros materiales deben ser esterilizados en autoclave antes de desecharlos.

Una vez que un gen es identificado como potencialmente resistente a los virus del dengue, que debe ser evaluado por su papel en la prevención de las infecciones virales en el mosquito. Este protocolo se ilustra cómo la extensión de infecciones de dengue de los mosquitos pueden ser analizados. Las técnicas para el cultivo de los virus en la cultura, la alimentación de los mosquitos membrana de sangre humana, y analizando los títulos virales en el intestino del mosquito se ha demostrado.

Protocolo para las infecciones de dengue en mosquitos (Aedes aegypti) y determinación de fenotipo infección

El propósito de este procedimiento es infectar al mosquito Aedes con el virus del dengue en condiciones de laboratorio y examinar el nivel y la dinámica de la infección de...

Soy George Dimopoulos, y ahora les mostraremos un procedimiento para infectar el mosquito Aidas GTI con el virus del dengue. Y lo primero que necesitaremos hacer es propagar el virus en una línea celular Aidas Aus. Mi nombre es Jose Luis Ramirez, y soy estudiante de doctorado en el Laboratorio ous.Para este procedimiento, necesitaremos una instalación de nivel de seguridad biológica dos con una cabina de cultivo celular, un incubador de CO2 ajustado a 37 grados Celsius. Necesitamos tubos cónicos plásticos de 50 ml. Necesitamos suero humano, necesitamos un baño de agua a 37 grados Celsius y una centrífuga.Necesitamos placas de 96 pocillos y otros reactivos y consumibles estándar de biología molecular y bioquímica. Esta es una cabina de cultivo celular habitual en una instalación de nivel de seguridad biológica dos, y el primer paso consiste en retirar las células que han crecido hasta alcanzar una confluencia del 80 % en un matraz de 75 centímetros cuadrados. Este es un medio MEM con un 10 % de suero bovino fetal calentado e inactivado, suplementado con un 1 % de L-glutamina y aminoácidos no esenciales.Vale, ahora añadiremos el virus del dengue a las células. Hemos sacado el stock del virus del congelador a menos 80 y lo descongelamos en un incubador a 37 grados. Añadimos aproximadamente 0,5 mililitros del stock del virus a las células para alcanzar una concentración de alrededor de 1,5 partículas virales por célula.A continuación, las células se colocan en un agitador durante aproximadamente 15 minutos a una velocidad lenta de agitación. Luego, las células se colocan en un incubador de CO₂ durante aproximadamente 45 minutos. A 37 grados Celsius, la concentración de CO₂ es del 5 %. Después de la incubación de 45 minutos, sacaremos las células y añadiremos 30 ml de medio, y luego colocaremos las células nuevamente en el incubador e incubaremos durante otros cinco días.Ahora prepararemos las partículas virales para la infección. Primero, necesitamos desprender las células del frasco con un raspador y luego transferirlas junto con el medio a un tubo cónico de 50 ml. Ahora debemos centrifugar las células a 12.000 RPM durante 10 minutos para formar el precipitado.En la parte inferior de este frasco, puede observar el pellet. A continuación, eliminaremos el sobrenadante y dejaremos solo un ml con las células para liberar el virus de las células. Los congelaremos.Esto provocará la ruptura de las células, luego las descongelaremos y a continuación las volveremos a congelar, repitiendo este procedimiento de tres a cuatro veces. La congelación se realiza sobre hielo seco. Después de la congelación, el pellet celular se coloca en un baño de agua a 37 grados para descongelarlo, y luego se vuelve a congelar sobre el hielo seco. Entre cada paso de congelación, se suspenden las células mediante vortex. Ahora estamos recolectando el sobrenadante que contiene el virus y añadiéndolo al sobrenadante de la centrifugación anterior, que también contiene partículas virales.Esta preparación viral ya está lista para combinarse con una cantidad igual de sangre humana completa y suero. Aquí hemos combinado la preparación viral con sangre humana completa suplementada con 15% de suero humano. Esta solución de sangre y virus se utilizará ahora para alimentar a los mosquitos e infectarlos.Vamos a añadir esta sangre a un alimentador con membrana y este alimentador con membrana se colocará sobre un vaso que contiene los mosquitos; permitiremos que los mosquitos se alimenten de esta sangre durante aproximadamente 25 minutos. Hemos colocado una pinza en el alimentador con membrana para estabilizarlo. Básicamente, esto lo fija sobre la malla, y ahora añadiremos la sangre al alimentador.En algunos casos, este experimento puede funcionar mejor cuando se realiza en la oscuridad, ya que naturalmente los mosquitos suelen alimentarse en condiciones de oscuridad. Esto depende, por supuesto, de cómo se haya acondicionado la colonia de mosquitos. Los mosquitos ya se han alimentado durante aproximadamente 25 a 30 minutos, y podemos retirar el alimentador con membrana y colocarlo en un recipiente seguro para su descontaminación.Después del suministro de sangre, es necesario eliminar los mosquitos no aptos de los alimentados. Para ello, se inmovilizaron los mosquitos colocando los vasos pequeños que contienen los mosquitos alimentados con sangre en una cámara fría durante cinco a diez minutos. Como podemos ver, los mosquitos ya están inactivos debido al frío.Abrimos la tapa y transferimos los mosquitos a un pequeño recipiente de Petri, que se coloca sobre un cubo de hielo para mantener a los mosquitos fríos en todo momento y evitar que escapen. Recuerde, estos son mosquitos infectados, por lo que se debe tener extremo cuidado para no dejarlos escapar. Una vez que los mosquitos están en la cámara fría, los transferimos al insectario normal, que se mantiene a temperatura ambiente, pero siempre colocamos a los mosquitos en el recipiente de Petri, el cual se mantiene dentro del cubo de hielo, de modo que permanezcan inactivos en todo momento.Puede observarse cómo se pueden separar los mosquitos alimentados de los no alimentados. Los alimentados tienen sangre en su interior. Están completamente llenos.Algunos de ellos se han alimentado de sangre parcialmente, por lo que no están completamente llenos. Tienen una pequeña cantidad de sangre en su abdomen, mientras que otros tienen una gran cantidad de sangre en su abdomen. Los no alimentados no tienen ninguna sangre en su abdomen, por lo que puede distinguirse fácilmente entre los alimentados y los no alimentados.Así que transferiremos estos mosquitos desde el recipiente de Petri a los vasos de cartón con revestimiento de cera. El siguiente paso consiste en analizar la infección por el virus del dengue en el mosquito. Si deseamos analizar la infección viral en el intestino medio del mosquito, debemos diseccionar los mosquitos aproximadamente al séptimo día después de que hayan ingerido la comida sanguínea.Y si desea analizar la infección viral en la glándula salival, debemos diseccionar los mosquitos aproximadamente a los 14 días posteriores a la ingesta de sangre. Ahora José le mostrará cómo diseccionar el intestino del mosquito. Los mosquitos han sido ahora anestesiados sobre hielo y los mataremos mediante una incubación en etanol al 70 % durante aproximadamente un minuto. A continuación, transferimos los mosquitos a dos baños sucesivos de agua.Un minuto cada uno. Esto sirve para eliminar el etanol de los mosquitos. Ahora disecaremos los mosquitos en PBS sobre portaobjetos de microscopio.La mejor manera de diseccionar el intestino medio de un mosquito gyp time consiste en colocar al mosquito boca abajo sobre sus alas y sujetar la parte abdominal con una pinza y el tórax con otra pinza, y luego estirar al mosquito. Ahora José está separando al mosquito y el intestino aparecerá entre el abdomen y la parte torácica del mosquito. Ahora el intestino es el tejido semitransparente que ha aparecido en la parte superior del mosquito.Ahora transferiremos el intestino diseccionado a un medio de cultivo celular y lo llevaremos a la cabina de cultivo de tejidos para aislar las partículas virales del intestino. Llevamos los intestinos medios diseccionados a la sala de cultivo de tejidos y los homogenizamos con un pistilo para liberar las partículas virales. Después de la homogenización del intestino medio, agregamos medio al homogenizado para obtener una dilución uno a 100 de las partículas virales.Luego continuamos diluyendo esto aún más a una relación de uno a 10, uno a 100 y uno a 1000. En la placa de 96 pocillos, hemos preparado la línea celular Alba picto hasta un 80 % de confluencia en una placa de 24 pocillos. A continuación, eliminamos el sobrenadante de las células Alba picto y añadimos a estas células las partículas virales diluidas para determinar la concentración de partículas virales en cada dilución.Esto nos permitirá determinar el nivel de infección del virus. En el intestino medio del mosquito, las células se agitan luego durante 15 minutos a temperatura ambiente lentamente. A continuación, colocamos las células durante 45 minutos en un incubador de CO₂ a 37 grados.A continuación, agregamos un ml de una capa superior de metilcelulosa al 1 % a cada pocillo, y luego la placa se incuba nuevamente durante cinco días en un incubador con CO2 a 37 grados. Después de la incubación de cinco días, agregamos un ml de un fijador de acetona-metanol a cada pocillo. Luego, incubamos la placa a cuatro grados Celsius en un refrigerador durante una hora.A continuación, eliminamos el fijador y lavamos cada pocillo una vez con PBS. A continuación, preparamos una dilución uno a 1000 del anticuerpo primario antidenque en una solución de sangre al 5%. A continuación, añadimos 200 microlitros de esta solución de anticuerpo.A cada pocillo, mueva la cabeza. Gracias. A continuación, incubamos la placa durante una hora a 37 grados Celsius. Luego eliminamos el fluido hipersuero y lavamos cada pocillo con un XPBS.A continuación, repetimos el procedimiento exactamente de la misma manera con un anticuerpo secundario. Preparamos 20 ml del sustrato según el protocolo, y lo añadimos a un recipiente. Luego, añadimos 200 microlitros del sustrato a cada pocillo.A continuación detenemos la reacción eliminando el sustrato y agregamos un ml de agua destilada a cada pocillo. Luego descartamos el agua de la placa y dejamos que la placa se seque. Cada punto de color representa una placa de virus, y al contar estas placas, podemos estimar el número de partículas virales que estaban en el intestino medio original del mosquito que homogenizamos.Acabamos de mostrarle el procedimiento para realizar una infección con el virus del dengue en mosquitos aegypti. Este protocolo implica la producción del virus en una línea celular de mosquito. Las partículas virales se purifican luego a partir de la línea celular y se aíslan, y se mezclan con sangre humana completa que se ofrece a los mosquitos.El virus infectará a los mosquitos y, una vez que se haya establecido la infección, le hemos mostrado cómo aislar el tejido del intestino medio del mosquito y cómo determinar el nivel de infección de este intestino medio. Básicamente, homogenizamos el intestino medio y utilizamos el procedimiento para liberar las partículas virales de este tejido. Luego, utilizamos estas partículas virales para infectar nuevamente la línea celular de mosquito con el fin de determinar el nivel de infección del intestino medio, así como la cantidad de partículas virales que han infectado el intestino del mosquito.

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Investigación

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Biología

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