Name: Protocolo para la cría de los mosquitos (A. gambiae) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T01:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 3 s
Description: Aprenda a criar Anopheles gambiae en el laboratorio mediante alimentación con sangre, control de temperatura y humedad. Este protocolo facilita estudios sobre transmisión de malaria y biología de vectores.

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Mosquito de alimentos: <ol><li> Una comida: la comida de pescado a tierra (Aquaricare). Una pizca hay que añadir. </li><li> Alimentos B: tierra de alimentos CAT (Purina). Una pizca hay que añadir. </li><li> Alimentos C: comida para gatos (Purina). Dos tablas hay que añadir. </li></ol> Sangre: Animal o la sangre humana puede ser usado para los mosquitos trasero. Se recoge sangre fresca con una jeringa y poner en un tubo estéril de 15 ml que contiene 1 ml de Falcon CPD (anticoagulante) por cada 10 ml de sangre, luego se mezcla suavemente y se centrifuga a temperatura ambiente a 2000 rpm durante 5 min. Se desecha el sobrenadante, teniendo cuidado de quitar la costra que comprende las demás células sanguíneas (por ejemplo, WBC). El pellet de glóbulos rojos se suspende en un volumen igual de medio RPMI con pipeta, y además lavar en este medio en tres ocasiones. Después del lavado final, los glóbulos rojos pellets se resuspendieron en un volumen igual de medio RPMI y se almacenan a 4 ° C (se puede mantener durante 8-10 días). Justo antes de la alimentación, los glóbulos rojos (en RPMI) se centrifuga (2000 rpm durante 5 minutos) para precipitar a las células y los glóbulos rojos envasados ​​se vuelve a suspender en el suero (O + suero humano) para obtener un hematocrito del 40%. La sangre debe mantenerse a 37 ° C en cualquier momento de la alimentación. DIA 1: <ol><li> El 3-5 días de edad los mosquitos hembras adultas se alimentan de la sangre para poner sus huevos. </li><li> Para la alimentación de la sangre, una membrana artificial (parafina) método de alimentación se utiliza de la siguiente manera: <ol><li> Los glóbulos rojos (ver arriba para la preparación de la sangre) se mezclan con suero inactivado por calor para obtener un hematocrito ~ 40% (RBC 40% y 60% de suero). Esto se agrega a la alimentación de vidrio. </li><li> El alimentador está conectado a una chaqueta de agua tibia (37 ° C), y se colocan en la jaula para permitir el acceso de los mosquitos a la superficie de la membrana. </li><li> Los mosquitos se les permite la alimentación de aproximadamente 30 minutos. </li></ol></li></ol> DIA 3: <ol><li> Las hembras ponen los huevos de dos días después de que se alimentan de sangre. Un pequeño papel de filtro envuelto en una forma cónica se coloca en un pequeño vaso con agua destilada, asegurándose de que el papel de filtro se humedece. El vaso se mantiene dentro de la jaula durante la noche para que los mosquitos ponen sus huevos. </li></ol> DIA 4: <ol><li> El papel de filtro que contiene los huevos del mosquito se coloca en una bandeja de plástico con alrededor de 300 ml de agua destilada. Una pizca de alimentos se añadirá a la bandeja de los huevos y se les permite a las larvas eclosionan en los próximos días. </li></ol> DIAS 5-8: <ol><li> Las larvas se alimentan de crecimiento todos los días con dos tablas de alimentos C, y supervisado por la densidad y la población. En el octavo día (5 días las larvas de edad), la población de larvas se diluye en una bandeja de ~ 10 bandejas, con una pizca de alimento A y C dos comprimidos de alimentos en cada bandeja. (~ 30 minutos) </li></ol> Los días 9 - 12: <ol><li> Las larvas se alimentan cada día con la comida C. El día 12 (9 larvas días de edad), el agua se cambia con el agua dulce y los alimentos se añade (una pizca de alimento B y dos tablas de alimentos C). Las pupas se empieza a desarrollar en esta etapa. Las bandejas están cubiertos con redes para evitar el escape de los adultos. (~ 80-10 minutos) </li></ol> DÍA 13 - 15: Las crisálidas se les permite salir a los adultos para los próximos 2 a 3 días. Los alimentos se da todos los días a las larvas / pupas con cuidado la eliminación de la red para evitar que escapen de los adultos. DIA 16: <ol><li> Los adultos se reúnen en una jaula a través de un aspirador conectado al vacío. La jaula consiste en una botella pequeña ml 100 con una mecha de algodón que se empapa con el 10% de sacarosa (autoclave) y un forro de toalla de papel en la parte inferior para absorber cualquier derrame potencial de azúcar que pueden ocurrir durante la manipulación de la jaula. (~ 30-40 minutos) </li></ol> Día 17 - 21: <ol><li> Los adultos (hombres y mujeres) se les mantiene en la sala de insectario durante 4-5 días, alimentadas con sacarosa al 10% antes de que sean de nuevo la sangre alimenta al comenzar el siguiente ciclo. Los mosquitos pueden utilizar los mismos para poner los huevos más de una vez. </li><li> Los mosquitos que no son necesarios para los experimentos de cría o puede ser muerto por la colocación de la jaula en un congelador. Las bandejas utilizadas y las jaulas deben limpiarse y secarse antes de que puedan ser utilizados de nuevo. </li></ol> NOTA: No puede haber algunas variaciones en el método de cría de mosquitos y laboratorios diferentes pueden tener diferentes técnicas.

<ol><li>Bangs, M. J., Soelarto, T., Barodji,, Wicaksana, B. P., Boewono, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonization+of+Anopheles+maculatus+from+Central+Java%2C+Indonesia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Mosq+Control+Assoc%22%5BJournal%5D)">Colonization of Anopheles maculatus from Central Java, Indonesia.</a> J Am Mosq Control Assoc. 18, 359-363 (2002).</li>
<li>Beier, M. S., Beier, J. C., Merdan, A. A., el Sawaf, B. M., Kadder, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+rearing+techniques+and+adult+life+table+parameters+for+Anopheles+sergentii+from+Egypt%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Mosq+Control+Assoc%22%5BJournal%5D)">Laboratory rearing techniques and adult life table parameters for Anopheles sergentii from Egypt.</a> J Am Mosq Control Assoc. 266, 266-270 (1987).</li>
<li>Benedict, M. Q. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBenedict%2C+MQ+%22Care+and+maintenance+of+anopheline+mosquitoes%2C+The+molecular+biology+of+disease+vectors%3A+A+methods+manual%22">Care and maintenance of anopheline mosquitoes, The molecular biology of disease vectors: A methods manual</a>. Crampton, J. M., Beard, C. B., Louis, C. , Champman & Hall. London. 3-12 (1997).</li>
<li>Casanges, A. H., Mcgovran, E. R., Chiles, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rearing+of+Anopheles+quadrimaculatus+Say+and+Aedes+aegypti+%28L.%29+in+the+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Mosq+News%22%5BJournal%5D)">Rearing of Anopheles quadrimaculatus Say and Aedes aegypti (L.) in the laboratory.</a> Mosq News. 9, 112-117 (1949).</li>
<li>Merritt, R. W., Dadd, R. H., Walker, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding+behavior%2C+natural+food+and+nutritional+relation+ships+of+larval+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Feeding behavior, natural food and nutritional relation ships of larval mosquitoes.</a> Annual Rev. Entomol. 37, 349-376 (1992).</li>
<li>Nasirian, H., Ladonni, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+bloodfeeding+of+Anopheles+stephensi+on+a+membrane+apparatus+with+human+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Mosq+Control+Assoc%22%5BJournal%5D)">Artificial bloodfeeding of Anopheles stephensi on a membrane apparatus with human whole blood.</a> J Am Mosq Control Assoc. 22, 54-56 (2006).</li>
<li>Ng'habi, K. R., John, B., Nkwengulila, G., Knols, B. G., Killeen, G. F., Ferguson, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+larval+crowding+on+mating+competitiveness+of+Anopheles+gambiae+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Effect of larval crowding on mating competitiveness of Anopheles gambiae mosquitoes.</a> Malar J. 30 (4), 49(2005).</li>
<li>Stobart, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+control+of+body+volume+in+the+larvae+of+the+mosquitoes+Aedes+aegypti+and+Aedes+detritus%5BTitle%5D)+AND+%22Edw.+J.+Exp.+Boil%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the control of body volume in the larvae of the mosquitoes Aedes aegypti and Aedes detritus.</a> Edw. J. Exp. Boil. 54, 67-82 (1971).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Alimento A</td><td></td><td>Aquaricare</td><td></td><td>Alimento molido para peces. Se debe agregar una pequeña pizca.</td></tr><tr><td>Alimento B</td><td></td><td>Purina</td><td></td><td>Alimento molido para gatos. Se debe agregar una pequeña pizca.</td></tr><tr><td>Alimento C</td><td></td><td>Purina</td><td></td><td>Alimento para gatos. Se deben agregar dos tabletas.</td></tr><tr><td>RBC</td><td></td><td></td><td></td><td>glóbulos rojos preparados: 40 % de hematocrito en suero humano</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Medio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CPD</td><td></td><td></td><td></td><td>anticoagulante</td></tr><tr><td>suero</td><td></td><td></td><td></td><td>suero humano O+</td></tr><tr><td>alimentador de mosquitos</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>parafilm</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anopheles gambiae</td><td></td><td></td><td></td><td>mosquitos</td></tr><tr><td>sacarosa al 10 %</td><td></td><td></td><td></td><td>alimento para mosquitos</td></tr><tr><td>insectario</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protocolo para la cría de los mosquitos (a. gambiae)

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

Este protocolo describe la cría de mosquitos en el insectario. Las habitaciones se mantienen insectario a 28 ° C y ~ 80% de humedad, con un 12 horas. ciclo día / noche. Para este procedimiento, tendrá las jaulas de los mosquitos, el 10% de sacarosa solución estéril, toallas de papel, vaso de precipitados, papel de filtro Whatman, alimentadores de vidrio, la sangre humana y baño de suero, agua, parafina, agua destilada, limpia bandejas de plástico, alimentos mosquito (que se describe abajo), neto para cubrir las bandejas, de vacío, y una cámara de recogida para recoger los adultos del mosquito.

Este video muestra las técnicas generales utilizadas para criar Anopheles gambiae en el laboratorio. Los métodos para el cuidado de los mosquitos de laboratorio se ha demostrado en todas las etapas del ciclo de vida del organismo a partir de larvas a pupas a los adultos se alimentan de sangre.

Protocolo para la cría de los mosquitos (A. gambiae)

Este protocolo describe la cría de mosquitos en el insectario. Las salas del insectario se mantienen a 28 °C y aproximadamente un 80 % de humedad, con un ciclo de día/noche de 12 h...

Mi nombre es Shish y soy investigador posdoctoral en el laboratorio del Dr. George OU en la Escuela de Salud Pública Johns Hopkins, en el Departamento de Microbiología Molecular e Inmunología. Voy a mostrar cómo criar mosquitos de la especie *Anopheles gambiae*. En el laboratorio, los mantenemos en una sala de insectario, que habitualmente se mantiene a 27 grados centígrados y al 80% de humedad.La sala de insectario también se mantiene en un ciclo de 12 horas de día y 12 horas de noche para poder imitar las condiciones que existen en el medio natural. Así pues, esta es la sala de insectario que tenemos, una instalación central aquí, donde se cría este insecto. Como puede observarse, aquí hay varias bandejas con mosquitos en todas las etapas diferentes: el huevo, las distintas fases de las larvas y la pupa.Estas bandejas contienen larvas de aproximadamente 11 o 12 días de edad, y esta es una jaula donde recolectamos los mosquitos adultos y los mantenemos con una solución de sacarosa al 10%. Para iniciar el proceso de puesta de huevos en los mosquitos, necesitamos alimentarlos con sangre, ya que los mosquitos requieren la proteína de la sangre para poner huevos. Por lo tanto, el día

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Una vez que un gen es identificado como potencialmente resistentes a la malaria, que debe ser evaluado por su papel en la prevención de las infecciones por Plasmodium en el mosquito. Este protocolo se ilustra cómo la extensión de la infección por Plasmodium de mosquitos se puede probar. Las técnicas para la preparación del cultivo de gametocitos, la alimentación de los mosquitos membrana de sangre humana, y analizando los títulos virales en el intestino del mosquito se ha demostrado.

Protocolo de infecciones por Plasmodium falciparum en la determinación de fenotipo mosquitos y la infección

Invertir enfoques genéticos han demostrado ser extremadamente útil para determinar qué genes de resistencia a patógenos vector subyacente en los mosquitos. Este protocolo de vídeo ilustra un método usado por el laboratorio Dimopoulos para inyectar dsRNA en los mosquitos Anopheles gambiae, que albergan el parásito de la malaria. La técnica de la manipulación de la configuración de la inyección y la inyección de dsRNA en el tórax se ilustra.

Protocolo para ensayos de RNAi en mosquitos adultos (A. gambiae)

Cruces genéticos de los parásitos de la malaria de roedores se llevan a cabo por la alimentación de dos parásitos genéticamente distintos a los mosquitos. Recombinante progenie clonada a partir de la sangre del ratón después de permitir que los mosquitos que pican ratones infectados. Este vídeo muestra cómo se producen los cruces genéticos...

Protocolo para la producción de un cruce genético de los parásitos de la malaria de roedores

Los análisis de RNA-Seq son cada vez más importantes para identificar los fundamentos moleculares de los rasgos adaptativos en organismos no modelo. Aquí, se describe un protocolo para identificar genes expresados diferencialmente entre mosquitos Aedes albopictus en diapausa y no diapausa, desde la cría de mosquitos, hasta la secuenciación de ARN y análisis bioinformáticos de datos de RNA-Seq.

Un Experimental y Protocolo Bioinformática para análisis de ARN-ss de fotoperiódica diapausa en el Mosquito Tigre Asiático, Aedes albopictus

A través de la inoculación con perlas, la técnica descrita permite la estimulación de la respuesta de melanización del mosquito en el sistema circulante de la hemolinfa. La cantidad de melanina que cubre las perlas se puede medir después de la disección como una medida de la respuesta inmunitaria.

Inoculador<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Los mosquitos con los granos para inducir y medir la respuesta inmune melanización

Los mosquitos Aedes aegypti infectados con Wolbachia están siendo liberados en las poblaciones naturales para suprimir la transmisión de arbovirus. Se describen métodos para posterior Ae. aegypti con Wolbachia infecciones en el laboratorio para los experimentos y la liberación del campo, tomar precauciones para reducir al mínimo la selección y adaptación de laboratorio.

Mantener los mosquitos Aedes aegypti infectados con Wolbachia

El sistema bipartito GAL4-UAS es una herramienta versátil para la modificación de la expresión génica de forma espaciotemporal controlada que permite el análisis genético funcional en Anopheles gambiae. Los procedimientos descritos para el uso de este sistema son una estrategia de clonación semi-estandarizada, sexado y cribado de pupas para marcadores de proteínas fluorescentes y fijación embrionaria.

Uso del sistema GAL4-UAS para genética funcional en Anopheles gambiae

El protocolo describe cómo lograr modificaciones dirigidas al sitio en el genoma de los mosquitos de la malaria Anopheles utilizando el sistema φC31 . Las modificaciones descritas incluyen tanto la integración como el intercambio de casetes transgénicos en el genoma de las líneas de acoplamiento que llevan attP.

Integración mediada por φC31 dirigida por sitios e intercambio de casetes en anopheles vectores de malaria

La técnica del insecto estéril (TIE) se utiliza para controlar poblaciones específicas de mosquitos médicamente importantes que pueden ser resistentes a los controles químicos. Aquí, describimos un método de cría masiva y preparación de mosquitos machos estériles para su liberación en un programa operativo de TIE dirigido al mosquito Aedes aegypti .

Preparación de mosquitos Aedes aegypti machos irradiados y marcados para su liberación en un programa operativo de técnica de insectos estériles

Las técnicas de microinyección son esenciales para introducir genes exógenos en los genomas de los mosquitos. Este protocolo explica un método utilizado por el laboratorio James para microinyectar construcciones de ADN en embriones de Anopheles gambiae para generar mosquitos transformados.

Método de microinyección para embriones de Anopheles gambiae

Aprenda a criar Anopheles gambiae en el laboratorio mediante alimentación con sangre, control de temperatura y humedad. Este protocolo facilita estudios sobre transmisión de malaria y biología de vectores.

Protocolo para la cría de los mosquitos (A. gambiae)

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