Name: Protocolo de infecciones por Plasmodium falciparum en la determinación de fenotipo mosquitos y la infección (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: Aprende a evaluar infecciones por Plasmodium falciparum en mosquitos Anopheles mediante alimentación con membrana y cultivo de gametocitos. Este protocolo permite determinar fenotipos de infección en el intestino medio.

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A. Preparación de la cultura de gametocitos: <ol><li> Llevan la sangre humana fresca y suero a 37 º C en un baño de agua. </li><li> En una campana de extracción, bajo condiciones estériles, pipetas de 1 mL de sangre caliente en un tubo eppendorf. Haga girar la sangre en una centrifugadora durante 5 minutos a 2200 rpm. Eritrocitos se sedimentan, retirar y desechar el suero. Lavado de eritrocitos con un volumen igual de suero de nuevo 3 veces para obtener la sangre de los gametocitos. </li><li> Recuperar la cultura de gametocitos de la incubadora de CO2 o un tarro de velas. Esta cultura se debe mantener en medio RPMI y se alimenta a los mosquitos en el día 16 de la cultura. Para determinar el% gametocytemia (el día 16 de la cultura) que una capa delgada sobre un portaobjetos con una gota de sangre y realizar una Geimsa mancha. Determinar el número de gametos en un campo de cultivo de parásitos. Por lo general, en el rango de 2 a 4%. Calcular el volumen de sangre total que se necesita para lograr el deseado gametocytemia% final (0,3 -1%). </li><li> Eliminar la mayor parte de los medios de comunicación de su cultura gametocitos utilizando una pipeta, teniendo cuidado de no perturbar o absorben los parásitos (parásitos aparecerá como negro, mientras que los medios de comunicación será la luz de color rosa / rojo). Pipeta el resto de los medios de comunicación y los parásitos en un tubo de 15 ml halcón. Girar en una centrífuga durante 5 minutos a 2200 rpm. Parásitos y eritrocitos de pellets, quite y deseche los medios de comunicación sobrenadante sin perturbar los parásitos. </li><li> Combine los parásitos con el volumen de sangre total preparado (de paso A2) para darle la gametocytemia final deseado de acuerdo a los cálculos anteriores. Pipeta para mezclar bien. (~ 1 minuto) </li></ol> Esta es ahora la muestra que se alimentan a su mosquitos. Mantener a 37 º C en un baño de agua. B. mosquitos Alimentación: <ol><li> Ponga su mosquitos Anopheles (~ 30-50) en vasos de cartón forrado de cera cubierta con red de malla asegurada por una banda de goma o una tapa de cartón suministrado con la taza. Nosotros usamos un aspirador a pilas para este paso. </li><li> Prepare la circulación del agua de baño de la inserción de las boquillas en ambos lados de los alimentadores de vidrio para tubo de goma. Conecte como alimentadores que necesite de una serie, un extremo de la serie debe estar conectado mediante un tubo al termostato del baño de agua (la parte que empuja el agua a través de los comederos), el otro extremo de la serie debe consistir en un tubo de goma sumergido en el baño para que el agua distribuida a vaciar de nuevo en el baño. A su vez en el baño hasta que el agua es de unos 37 º C y el agua circule a través de los alimentadores y de vuelta al baño. Esto es esencial para mantener caliente la sangre y mantener los parásitos vivos. </li><li> Prepare la membrana (nosotros usamos pequeños cuadrados de estirado parafina) se extiende por todo el alimentador de membrana de vidrio, utilizando la presión para sellar herméticamente la apertura del alimentador. Esta membrana se imitan la piel. </li><li> Coloque un alimentador de la membrana hacia abajo en cada taza de mosquitos y alimentadores seguro utilizando grapas o cinta adhesiva. La membrana debe sentarse al ras de la red para que los mosquitos pueden acceder a él desde el interior de la taza. </li><li> Cuidadosamente pipeta parásitos harina de sangre (de paso A5) en el cuello de la alimentación, lo que hace que la sangre recorre todo el camino a través del cuello en el depósito, en contacto con la membrana que los mosquitos pueden tener acceso a la sangre. Usamos unos 200 l de sangre por cada alimentador, pero esto puede variar. </li><li> Permita que los mosquitos se alimentan. Permitimos que la alimentación de ≈ 30 minutos (variable, dependiendo de theexperiment, para la mayoría de los experimentos, de vez en cuando el seguimiento de cómo muchos ya han tomado una comida mirando el contenido de sangre en el abdomen.) </li><li> Después de la alimentación, retire los alimentadores de las copas de los mosquitos. Apague el baño de agua y desconecte los alimentadores de la tubería. </li><li> Quitar la membrana y disfrutar alimentadores en 10% de lejía para desinfectar y enjuagar con agua. Coloque el material contaminado (membranas, toallas de papel, guantes, etc) en una pequeña bolsa de riesgo biológico y depositar en un recipiente grande de riesgo biológico. </li><li> Anestesiar a los mosquitos mediante la colocación de vasos en el refrigerador o cuarto frío. Una vez que los mosquitos son totalmente anestesiado, su transferencia en una placa de Petri incrustados en un cubo de hielo. Ordenar los mosquitos, mirando cuidadosamente el abdomen para detectar cualquier signo de una harina de sangre, y desechan las que no se alimentan. Algunos mosquitos serán completamente llena de sangre, mientras que otros muestran una estrecha banda de sangre ingerida, y todos son aceptables como &quot;alimentado&quot;. Ponga los mosquitos pasan a engrosar la vasos de cartón. </li><li> Proporcionar una comida de azúcar (un trozo de algodón empapado en 10% de sacarosa) a los mosquitos, y se incuba en condiciones normales de insectario durante 7 días. Todos los días, los mosquitos deben ser monitorizados por la tasa de mortalidad. Además, el algodón debe ser mojado con la sacarosa, por lo que no se les prive de los alimentos. Es mejor, sin embargo, al añadir una toalla de papel empapada en agua destilada, para mantener a los mosquitos húmedo. Estos mosquitos son P. falcipraum infectados, por lo que todos se debe tener cuidado para que no los mosquitos pueden escape de la copa. Lo mejor es poner los vasos en una protección cagefor doble pequeña. </li></ol> C. Disección midguts mosquito y la estimación de las cargas de ooquistes: <ol style="margin-top: 0in"><li style="tab-stops: list .5in"> Aspirar los mosquitos (desde el paso B) de vasos de cartón con un aspirador a pilas. Anestesiar a los mosquitos, que son en el interior del depósito de aspiración extraíble, al mudarse a una habitación fría o enterrar el depósito de hielo durante al menos 5 minutos o hasta que los mosquitos dejen de moverse. </li><li style="tab-stops: list .5in"> La transferencia de los mosquitos anestesiado desde el depósito hasta un plato de Petri de vidrio incrustados en el hielo. Propagación de los mosquitos de una sola capa y cubrir con una tapa de plato de plástico Petri. Los mosquitos que no se pueden acomodar en el plato de permanecer en el depósito, que se devuelve a la habitación fría o hielo. </li><li style="tab-stops: list .5in"> Utilizando unas pinzas de punta fina, la transferencia de un solo mosquito de la antena a 100 ul PBS contenida en un portaobjetos de vidrio montada en un microscopio de disección. Deja a los demás incluidos en el frío plato de petri. </li><li style="tab-stops: list .5in"> Utilizando unas pinzas de punta fina, mantener los mosquitos en el tórax y el abdomen posterior. Tire del cuerpo del otro hasta el intestino medio está expuesto. El uso de fórceps para extraer el exceso de tejido del intestino gut.The se parece a un blanco, en forma de saco del cuerpo. Retire el exceso de tejido de la gut.Mount el intestino en un pocillo de una placa de vidrio de 12 bien y sumergirse en l 50-10 del 0,2% mercurocromo. Aplastar el cuerpo y desechar el towel.Continue de papel húmeda para otros mosquitos hasta que la diapositiva de 12 y está lleno. Cubren las agallas montado con un cubreobjetos. </li><li style="tab-stops: list .5in"> Examinar las entrañas con un microscopio de luz, en busca de ooquistes ronda que se tiñen de color rosa brillante contra el tejido intestinal claro / rosa tenue. Contar con los ooquistes, registrar y seguir a la siguiente muestra. Seguir para todos los mosquitos de todos los tratamientos experimentales. </li><li style="tab-stops: list .5in"> Cuando haya terminado, pase de diapositivas limpiar con una toalla de papel. Coloque la toalla de papel con las tripas, y una toalla de papel con cadáveres, en la bolsa de riesgo biológico pequeñas y desechar en la basura. Se usan guantes durante todo el procedimiento. Hay que tener cuidado de no dejar que nadie se escape de mosquitos infectados. </li></ol>

<ol><li>Avila, S. L., Ferreira, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+diagnosis%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Braz+J+Med+Biol+Res%22%5BJournal%5D)">Malaria diagnosis: a review.</a> Braz J Med Biol Res. 29 (4), 431-443 (1996).</li>
<li>Bell, A. S., Ranford-Cartwright, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+real-time+PCR+assay+for+quantifying+Plasmodium+falciparum+infections+in+the+mosquito+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A real-time PCR assay for quantifying Plasmodium falciparum infections in the mosquito vector.</a> Int J Parasitol. 34 (7), 795-802 (2004).</li>
<li>Collins, K. M., Hochberg, L. P., Ryan, P. R., Collins, W. E., Wirtz, R. A., Ryan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Plasmodium+malariae+infection+in+mosquito+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Trop+Med+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Quantification of Plasmodium malariae infection in mosquito vectors.</a> Ann Trop Med Parasitol. 98 (5), 469-472 (2004).</li>
<li>Czeher, C., Labbo, R., Djibrilla, A., Here, L., Arzika, I., Duchemin, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA+study+of+oocyst-sporozoite+transition+in+malaria+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite%22%5BJournal%5D)">ELISA study of oocyst-sporozoite transition in malaria vectors.</a> Parasite. 13 (3), 257-261 (2006).</li>
<li>Haghdoost, A. A., Mazhari, S., Bahadini, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+the+results+of+light+microscopy+with+the+results+of+PCR+method+in+the+diagnosis+of+Plasmodium+vivax%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vector+Borne+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparing the results of light microscopy with the results of PCR method in the diagnosis of Plasmodium vivax.</a> J Vector Borne Dis. 43 (2), 53-57 (2006).</li>
<li>Patsoula, E., Spanakos, G., Sofianatou, D., Parara, M., Vakalis, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-step%2C+PCR-based+method+for+the+detection+and+differentiation+of+Plasmodium+vivax%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Trop+Med+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A single-step, PCR-based method for the detection and differentiation of Plasmodium vivax.</a> Ann Trop Med Parasitol. 97 (1), 15-21 (2003).</li>
<li>Osta, M. A., Christophides, G. K., Kafatos, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+mosquito+genes+on+Plasmodium+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Effects of mosquito genes on Plasmodium development.</a> Science. 303 (5666), 2030-2032 (2004).</li>
<li>Srinivasan, P., Abraham, E. G., Ghosh, A. K., Valenzuela, J., Ribeiro, J. M., Dimopoulos, G., Kafatos, F. C., Adams, J. H., Fujioka, H., Jacobs-Lorena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Plasmodium+and+Anopheles+transcriptomes+during+oocyst+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Plasmodium and Anopheles transcriptomes during oocyst differentiation.</a> J Biol Chem. 279 (7), 5581-5587 (2004).</li>
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No puede haber algunas variaciones en la infección por Plasmodium y determinación fenotipo infección y los diferentes laboratorios pueden seguir diferentes técnicas.

protocolo de infecciones por plasmodium falciparum en la determinación de fenotipo mosquitos y la infección

Protocol for Plasmodium falciparum Infections in Mosquitoes and Infection Phenotype Determination

Una vez que un gen es identificado como potencialmente resistentes a la malaria, que debe ser evaluado por su papel en la prevención de las infecciones por Plasmodium en el mosquito. Este protocolo se ilustra cómo la extensión de la infección por Plasmodium de mosquitos se puede probar. Las técnicas para la preparación del cultivo de gametocitos, la alimentación de los mosquitos membrana de sangre humana, y analizando los títulos virales en el intestino del mosquito se ha demostrado.

Protocolo de infecciones por Plasmodium falciparum en la determinación de fenotipo mosquitos y la infección

Una vez que se identifique un gen como potencialmente refractario a la malaria, se debe evaluar su función en la prevención de las infecciones por Plasmodium dentro de los...

Soy George Dimopoulos del Instituto de Investigación sobre la Malaria en la Escuela de Salud Pública Johns Hopkins, y ahora les mostraré un procedimiento para infectar mosquitos Anopheles gambiae con parásitos Plasmodium falciparum y cómo determinar el fenotipo de infección en el intestino medio del mosquito. Para este procedimiento, el equipo básico necesario incluye un incubador con CO2 para el cultivo del parásito. Alternativamente, si no se dispone de un incubador con CO2, se puede utilizar un frasco con vela.También necesitamos un insectario, por supuesto, equipos estándar de biología molecular y biología celular, como microscopios de disección y microscopios ópticos. Necesitamos baños de agua. Necesitamos un sistema alimentador de mosquitos con membrana y centrífugas.Hola, mi nombre es ISH y estoy en el laboratorio del Dr. George Depos. Soy postdoctorado. Mi nombre es Lindsay Garver y soy estudiante de doctorado.El primer paso de la infección con plásmido es tener lista la cultura del plásmido. Si no dispone de una incubadora de dióxido de carbono, puede utilizar un frasco con vela en el que colocar la placa de seis pocillos con la cultura del conjunto gato, encender la vela y luego sellar el frasco. El primer paso consiste en obtener sangre humana fresca y suero humano y colocarlos primero a 37 en un baño de agua para descongelarlos y también para calentarlos, ya que se necesita sangre y suero realmente tibios.Para preparar la sangre, debe asignar un animal por cada muestra de sangre humana fresca en un tubo eppendorf. Sí, la sangre fresca debe centrifugarse a 2000 RPM durante cinco minutos para sedimentar los eritrocitos. Una vez finalizada la centrifugación, se debe descartar el sobrenadante claro y el sedimento rojo, que corresponde a los GR, debe lavarse tres veces en suero humano.Agregamos un volumen igual de suero humano al pellet, mezclamos y centrifugamos nuevamente a 2000 RPM durante cinco minutos. Este paso se repite tres veces. Finalmente, se obtienen pellets de glóbulos rojos listos para ser añadidos al cultivo de ganote.Vale, el cultivo de plasmodio, que se encuentra en la incubadora de CO2, debe mantenerse en medio RPMA durante 16 días, y el día 16 estarán listos para la infección. Dado que trabajamos con el cultivo de plasmodio, debe tenerse cuidado en cada paso. El primer paso consiste en que los parásitos deben cultivarse en un laboratorio BC2 y debe realizarse en una cabina de seguridad biológica.Todos los puntas de pipeta y todos los accesorios usados deben descartarse en una caja de biohazard, y cualquier otra solución, como nuestro pipetman, debe lavarse con lejía al 10 %. Además, debe usarse guantes. Para la cultura del día 16, los mandiles de laboratorio deben tomar una pequeña gota de sangre sobre un portaobjetos, hacer un frotis y teñirlo, luego observarlo al microscopio óptico.Podemos determinar el porcentaje de GAMMAT a partir de un cultivo de gametocitos de 16 días de antigüedad. Retire la mayor parte del medio teniendo cuidado de no perturbar ni aspirar ningún parásito, que se encuentra fácilmente en el fondo del pozo. El resto del medio y los parásitos se transfieren a un tubo. Se mezclan los parásitos en los glóbulos rojos en un tubo aparte; esta suspensión se coloca luego en una centrífuga para girar a 2000 RPM durante cinco minutos.Después de la centrifugación, los parásitos se pelotarán junto con los glóbulos rojos. El sobrenadante es el medio RPMI, y en la parte inferior, el pellet contiene los parásitos. Junto con los GR, retire el sobrenadante, que es el RPMI.Debe tenerse cuidado con el medio para no perturbar el parásito ni los glóbulos rojos. El porcentaje de GATOT, que se determina mediante los GIMs 10, suele estar en el rango de entre el dos y el 4%. Luego, cuando los glóbulos rojos y los parásitos están listos tras la centrifugación, se mezclan juntos y el volumen de sangre que debe añadirse se determina según el porcentaje final de GATOT. Este debe ser agudo y generalmente se encuentra en el rango de entre 0,3 y 1%, y esto es lo que se utilizará para la alimentación de los mosquitos phys.Para la infección por Presidium S, este es un alimentador de vidrio que utilizamos para la alimentación a través de membrana de los mosquitos. Introducimos la sangre por el orificio pequeño que ven, y queda contenida en su interior. En la parte inferior lateral hay dos boquillas, que están conectadas a nuestro baño de agua, mencionado anteriormente a 37 grados.Para preparar el alimentador para la alimentación, tomamos un pequeño trozo de afil. Estiramos desde los dos extremos hacia los cuatro lados, y luego colocamos esto en el lado abierto del alimentador de vidrio, de modo que forme una fina lámina de membrana que imite la piel. Esto es lo que se denomina alimentación mediante membrana.Este es un baño de agua circulante, que mantiene el agua a 37 °C y también la circula a través del alimentador de vidrio para que la sangre se mantenga caliente a 37 °C. Conectamos el alimentador de vidrio mediante pequeños capilares y lo conectamos al baño de agua circulante, luego encendemos el baño para que el agua circule; el agua y la sangre nunca se mezclan, ya que se encuentran en dos cámaras separadas. Este es un pequeño recipiente que contiene mosquitos *Phis Gambi*.Para comenzar, se coloca el alimentador de vidrio sobre la jaula y se pone un peso sobre el alimentador de vidrio para que la membrana, que es el phim, quede al ras con la red de malla. Alrededor de 200 microlitros de sangre, que contiene los parásitos, con el porcentaje requerido de gambotto se añaden al alimentador, asegurándose de que la sangre llegue hasta el fondo y los mosquitos puedan acceder a ella.El sangrado continúa durante aproximadamente 30 minutos. Una vez completado el sangrado, el alimentador de vidrio se lava cuidadosamente con agua y luego con lejía al 10%, y el resto de las membranas y la cinta se retiran y descartan en una caja de bioseguridad. Después del sangrado, es necesario separar los mosquitos no alimentados de los que sí se alimentaron.Para hacer esto, inmovilizamos a los mosquitos colocando los pequeños vasos que contienen los mosquitos alimentados con sangre en una cámara fría durante cinco a diez minutos. Como podemos ver, los mosquitos ya están inactivos debido al frío. Abrimos la tapa y transferimos los mosquitos a una pequeña placa de Petri, que se mantiene sobre un recipiente con hielo para que los mosquitos permanezcan fríos en todo momento y no puedan escapar.Recuerde, estas son mosquitos infectados con plasmodio, por lo que se debe tener extremo cuidado para no dejarlos escapar. Una vez que los mosquitos están inactivos en la sala fría, los transferimos al insectario normal, que se mantiene a temperatura ambiente, pero siempre colocamos los mosquitos en una placa de Petri, la cual se coloca dentro de un cubo de hielo, de modo que permanezcan inactivos. Puede observar cómo los mosquitos alimentados se pueden separar de los no alimentados.Los alimentados tienen sangre en su interior. Están completamente llenos. Algunos se han alimentado parcialmente de sangre, por lo que no están completamente llenos.Tienen poca sangre en su abdomen, mientras que otros tienen mucha sangre en su abdomen. Los UNFI no tienen ninguna sangre en su abdomen, por lo que se pueden distinguir fácilmente entre los alimentados y los no alimentados. Se muestran aquí las hembras adultas de mosquitos que se alimentaron de sangre; así que transferiremos estos mosquitos desde la placa de Petri a los vasos de cartón con línea de cera.Después de colocar los mosquitos alimentados con sangre en los vasos, se pone un pequeño trozo de algodón empapado en sacarosa al 10% para que puedan alimentarse de la sacarosa al 10% durante los próximos siete días de incubación, y también se coloca una pequeña toalla de papel doblada, para mantener la humedad dentro del vaso, el cual se cubre con una placa de Petri. Los mosquitos infectados con plasmodio se colocan en otra jaula pequeña, por lo que debe tener una doble protección, y se coloca la jaula en un laboratorio de nivel de contención 3, que se mantiene a 27 grados centígrados y 80% de humedad. Siete días después de la alimentación con sangre, los mosquitos que se mantuvieron en el insectario, dentro de la caja con doble jaula, se sacan del insectario y se trasladan a la cámara fría para inmovilizarlos.Una vez que los mosquitos están inactivos, se transfieren a una placa de Petri, que se mantiene sobre un recipiente con hielo. Ahora nos preparamos para diseccionar los mosquitos. Diseccionaremos el intestino medio y buscaremos el quiste.El primer paso consiste en agregar cien microlitros de PBS sobre un portaobjetos colocado en un microscopio de disección. El siguiente paso es utilizar una pinza fina. Transferimos un solo mosquito desde la placa de Petri al PBS, que se encuentra sobre el portaobjetos montado en el microscopio de disección.Los demás aún permanecen en el platillo de Petri frío. Para diseccionar los mosquitos, sostenga el tórax del mosquito con una de las pinzas y el abdomen posterior con otra pinza. Luego, tire lentamente de la parte del cuerpo hasta que el intestino medio quede expuesto.Tiene aspecto de una bolsa blanca; utilice pinzas para retirar el tejido excesivo y las demás partes del cuerpo. Sí, este es el intestino medio, que tiene forma de cuerpo similar a una bolsa blanca y que posee el os. Ahora transferiremos este intestino medio a una placa de vidrio de 12 pocillos e inmergeremos en cinco a 10 microlitros de pro micro al 0,2 %, lo que permitirá que el intestino medio se adhiera al portaobjetos.Con el cubreobjetos, realizamos este paso para todos los mosquitos infectados. El intestino tiene un aspecto rosa brillante, y transferiremos esta preparación a un microscopio óptico para contar la carga de OS. Ahora estamos observando el intestino medio diseccionado de los mosquitos infectados.El intestino medio tiene aspecto de cuerpo alargado y, con la tinción rom, presenta un color ligeramente rosado, mientras que el O SST debe mostrar un rosa brillante en contraste con el tejido intestinal de color rosa tenue. Estos intestinos medios, sin embargo, provienen de mosquitos infectados, pero no muestran ningún SST, por lo que podrían no estar infectados. Pero si un intestino medio estuviera infectado, el S se presentaría como un pequeño círculo rosa brillante, y puede haber numerosos lag entre 22 y 500, a veces dentro de un solo intestino medio.Este procedimiento consistió en infectar sangre humana con parásitos Plasmodium, alimentar con esa sangre infectada a mosquitos Anopheles gambiae, diseccionar el intestino medio de esos mosquitos y determinar los conteos de oocistos en esos intestinos medios infectados. Esta técnica es importante porque constituye la aproximación más cercana a la transmisión de la malaria humana que podemos replicar en el laboratorio.

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Investigación

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Biología

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Protocolo para las infecciones de dengue en mosquitos (Aedes aegypti) y determinación de fenotipo infección

Cruces genéticos de los parásitos de la malaria de roedores se llevan a cabo por la alimentación de dos parásitos genéticamente distintos a los mosquitos. Recombinante progenie clonada a partir de la sangre del ratón después de permitir que los mosquitos que pican ratones infectados. Este vídeo muestra cómo se producen los cruces genéticos...

Protocolo para la producción de un cruce genético de los parásitos de la malaria de roedores

Los mosquitos transmisores de la malaria tienen una serie de características epidemiológicamente importantes que solo pueden detectarse mediante técnicas moleculares. Utilizando una plataforma de genotipado de SNP basada en MALDI-TOF, desarrollamos un ensayo para detectar simultáneamente múltiples rasgos clave (especie, resistencia a insecticidas, infección por parásitos y elección de huésped) de los vectores de la malaria.

Un ensayo multi-detección para los mosquitos transmisores de la malaria

Describimos un modelo de ratón de malaria cerebral experimental y mostramos cómo se puede rastrear la patología inflamatoria y microvascular in vivo utilizando imágenes de resonancia magnética.

Seguimiento In Vivo del Desarrollo del Edema y Patología Microvascular en un Modelo de Malaria Cerebral Experimental usando Imágenes de Resonancia Magnética

Debido a las sorprendentes similitudes del ciclo de vida y la biología de los parásitos del paludismo de roedores con los parásitos del paludismo humano, los modelos de malaria de roedores se han vuelto indispensables para la investigación del paludismo. En este documento, estandarizamos algunas de las técnicas más importantes utilizadas en el análisis fenotípico de especies de malaria de roedores de tipo salvaje y transgénico.

Análisis fenotípico de las etapas de la sangre asexual y sexual del parásito de la malaria de los roedores y las etapas de los mosquitos

Las investigaciones detalladas sobre las etapas de los mosquitos de los parásitos de la malaria son fundamentales para diseñar estrategias efectivas de bloqueo de la transmisión. Este protocolo demuestra cómo cultivar eficazmente gametocitos infecciosos y luego alimentar a estos gametocitos a los mosquitos para generar etapas de mosquito de P. falciparum.

Plasmodium falciparum Cultivo de gametocitos e infección por mosquitos a través de la alimentación artificial por membrana

Este protocolo describe un ensayo de inmunoadsorción enzimática en sándwich para detectar esporozoítos de glándulas salivales en mosquitos. Mediante el uso de anticuerpos monoclonales fácilmente disponibles, el método permite la detección rentable y de alto rendimiento de mosquitos portadores de Plasmodium falciparum o Plasmodium vivax. El método es adecuado para la investigación de la transmisión del paludismo, incluidos los estudios de vectores.

Detección de esporozoítos de Plasmodium en mosquitos Anopheles mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas

El ensayo estándar de alimentación por membrana (SMFA) se considera el estándar de oro para la evaluación e identificación de posibles compuestos antipalúdicos. Este sistema de alimentación artificial se utiliza para infectar mosquitos para evaluar más a fondo los efectos de tales compuestos sobre la intensidad y prevalencia del parásito Plasmodium falciparum .

Ensayo estándar de alimentación por membrana para la detección de la infección por Plasmodium falciparum en mosquitos vectores Anopheles

La malaria se transmite a través de la inoculación de la etapa de esporozoíto de Plasmodium por mosquitos infectados. El Plasmodium transgénico nos ha permitido comprender mejor la biología de la malaria y ha contribuido directamente a los esfuerzos de desarrollo de vacunas contra la malaria. En este trabajo se describe una metodología simplificada para generar esporozoítos transgénicos de Plasmodium berghei .

Generación de esporozoítos de Plasmodium berghei modificados genéticamente

La genética química implica la sustitución de un residuo guardián por un aminoácido que contiene una cadena lateral diferente en el locus objetivo. Aquí, hemos generado un parásito mutante que contiene un alelo hipomórfico de cdpk1 e identificado las vías compensatorias adoptadas por el parásito en el fondo mutante.

Comprender el desarrollo de vías compensatorias en un parásito mutante de la malaria que alberga un alelo hipomórfico de quinasas similares a las plantas

El desarrollo sexual del Plasmodium ocurre en el intestino medio del mosquito. Dirigirse a las etapas sexuales del parásito es una estrategia prometedora para bloquear la transmisión. Desarrollamos Ookluc, un P. berghei transgénico que expresa nanoluciferasa después de la formación del cigoto, lo que permite el cribado de alto rendimiento de compuestos que bloquean la transmisión. En este artículo se detallan los métodos de cribado con Ookluc.

Ookluc: Una línea de Plasmodium berghei para la identificación de compuestos que bloquean la transmisión

Aprende a evaluar infecciones por Plasmodium falciparum en mosquitos Anopheles mediante alimentación con membrana y cultivo de gametocitos. Este protocolo permite determinar fenotipos de infección en el intestino medio.

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