Plataformas microfabricated para el cultivo celular mecánico dinámico

El objetivo general del siguiente experimento consiste en microfabricar dispositivos utilizados para estimular mecánicamente células en entornos de cultivo bidimensionales y tridimensionales. Esto se logra mediante una técnica de moldeo y apilamiento en múltiples capas para producir una matriz de micropostes accionados verticalmente. Como segundo paso, se modifica la matriz de micropostes accionados verticalmente para estirar una película de cultivo, lo que aplica deformaciones bien controladas a las células cultivadas sobre la película.

Alternativamente, la matriz puede modificarse para comprimir construccos de biomateriales con microestructuras con el fin de aplicar estimulación mecánica a las células. Los resultados obtenidos al cultivar en una matriz de hidrogeles tridimensionales muestran la aplicación simultánea de una variedad de deformaciones biaxiales ecográficas bidimensionales y compresiones tridimensionales a lo largo de la matriz, basadas en el análisis de imágenes de marcadores fiduciales fluorescentes. Hola, soy Chris Mariahs de los laboratorios de Craig Simmons y U Sun del Departamento de Ingeniería Mecánica e Industrial y del Instituto de Biomateriales e Ingeniería Biomédica de la Universidad de Toronto.

Hoy les mostraremos un procedimiento para fabricar microdispositivos utilizados para estimular mecánicamente células. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar cómo las células responden a una variedad de fuerzas mecánicas en cultivo in vitro. Así que comencemos.

El proceso de fabricación del molde tipo sándwich incluye colocar una transparencia para retroproyector sobre poli(dimetilsiloxano) o PDMS no curado sobre un molde maestro SU-8. El sándwich se coloca en una pila de espuma, vidrio y metal y se cura en un horno bajo compresión. Finalmente, se desarma la pila y se retira la transparencia, dejando adherida la capa de PDMS con el patrón.

Para comenzar este proceso, mezcle completamente PDMS, monómero y agente de entrecruzamiento. En la proporción estándar de 10 a 1, coloque tres mililitros de la mezcla de PDMS sin curar sobre un molde maestro SU-8 previamente fabricado y desgasifique el polímero en una cámara de vacío. A continuación, coloque la almohadilla de espuma y el molde maestro SU-8 sobre una placa base de plexiglás.

Baje cuidadosamente el lado liso de una transparencia de inyección de tinta sobre el PDMS sin curar, asegurándose de evitar atrapar burbujas de aire. Luego, coloque un portaobjetos silanizado encima de la transparencia debajo de la segunda almohadilla de espuma y una placa superior de plexiglás. Sujete el conjunto con una abrazadera en C.

Coloque el sándwich de PDMS en un horno a 80 grados Celsius durante al menos cuatro horas para que cure. Después del curado, retire el sándwich del horno y déjelo enfriar. Una vez enfriado, retire la abrazadera y desarme el sándwich.

Retire cuidadosamente la transparencia del molde maestro SU-8, conservando la película de PDMS con el patrón. Recorte los bordes de la película patrón para eliminar el exceso de PDMS y almacene las capas patrón en un ambiente libre de polvo hasta que estén listas para su uso. La siguiente parte de este protocolo implica la construcción de un arreglo microfabricado de postes accionados verticalmente.

Se requiere un proceso de fabricación de múltiples capas para elaborar la matriz de micropostes. La capa inferior de PDMS patroneada se prepara mediante la fabricación de un molde tipo sándwich. Para estos experimentos, se utilizaron patrones circulares con diámetros que variaron entre 600 y 1.200 micrones.

Para transferir la capa de PDMS a un portaobjetos de vidrio limpio, utilice una unidad de descarga de corona para tratar las superficies de PDMS y vidrio con plasma de oxígeno. Luego, coloque las dos superficies en contacto entre sí. Coloque el conjunto sobre una placa calefactora a 80 grados Celsius durante 10 minutos para completar el proceso de unión.

Retire la transparencia y deséchela. Este proceso asegura que la película de PDMS patroneada nunca se libere de un sustrato rígido, lo que evita la contracción de las capas individuales. La segunda capa moldeada en sándwich se forma como un molde réplica negativo de la estructura deseada del diafragma y del poste.

En esta demostración, se utilizaron postes circulares de 500 micrones de diámetro para formar esta capa. Primero, fije temporalmente el molde de réplica negativa a una portaobjetos de vidrio usando cinta adhesiva doble cara y silicice en un desecador al vacío. Deposite PDMS sin curar sobre el sándwich, en la capa del molde, desgasifique y recubra mediante centrifugación durante 45 segundos a 1000 rotaciones por minuto, obteniendo un diafragma de accionamiento de 60 micrones de espesor. Cure parcialmente la capa de PDMS recubierta por centrifugación a 80 grados Celsius durante aproximadamente 20 minutos o hasta que el PDMS esté pegajoso pero no se deforme permanentemente. Al tacto, retire la portaobjetos de vidrio y la cinta adhesiva doble cara de la capa de PDMS parcialmente curada y la película de transparencia. Fíjela a un par de portaobjetos de vidrio para manipulación y aplique plasma.

Someta el PDMS parcialmente curado a un tratamiento, luego invierta el PDMS y colóquelo en un alineador hecho a medida. El alineador consiste en una pinza de vacío montada sobre un micromanipulador. A continuación, someta la primera capa de PDMS a un tratamiento con plasma y colóquela sobre una etapa rotatoria debajo de la pinza de vacío.

Observe el alineamiento entre las dos capas con un sistema de visión artificial con aumento de 12 veces. Utilizando el manipulador, alinee las capas y acérquelas cuidadosamente hasta que entren en contacto. Aplique una ligera presión con un dedo para adherir las capas entre sí.

Luego retire el sándwich del alineador. Retire las láminas de vidrio de manipulación y asegúrese de que las capas estén en contacto completo entre sí. Cure en un horno a 80 grados Celsius durante 30 minutos adicionales.

Después de 30 minutos, el molde de PDMS transparente y con réplica silolizada puede separarse del dispositivo y descartarse. Luego, el dispositivo se cura completamente a 80 grados Celsius durante al menos cuatro horas para realizar experimentos con células cultivadas sobre un sustrato bidimensional deformable. La matriz de microactuadores se modifica mediante la unión de una tercera capa de PDMS al dispositivo.

La tercera capa de PDMS consiste en una estructura de dos capas. El círculo inferior coincide con el tamaño de la cavidad de actuación situada debajo de los micropostes accionados. El diámetro del círculo superior es 100 micrones mayor que el diámetro de los postes de carga.

Un microcanal de 200 micrones de ancho conecta estas características con un área de conexión y se utilizará para lubricar los postes de carga y la película de cultivo. Para modificar el dispositivo para cultivo en 2D, primero fabrique y una los conectores a este según se describe en el protocolo escrito. Luego, aplique por centrifugado una capa de 10 a 15 micrones de PDMS sobre el lado liso de una transparencia y cure.

La película delgada de PDMS a 80 grados Celsius durante al menos cuatro horas. El siguiente paso es aplicar un vacío a los actuadores y unir la capa de PDMS al dispositivo. Para lograr esto.

Primero, aplique un vacío de bajo nivel a los actuadores, reduzca la matriz de postes, trate con plasma y una la película de PDMS recubierta por centrifugado al dispositivo microactuado según se describe en el protocolo escrito; los postes y la película de cultivo permanecerán hidrofílicos durante un breve periodo. A continuación, conecte la jeringa de lubricante al dispositivo y llene los canales de lubricación con una solución de glicerol al 90 % en agua desionizada.

Además de la lubricación, esta formulación mantiene indefinidamente la hidrofilicidad del PDMS, reduciendo los coeficientes de fricción. Coloque el dispositivo sobre una placa calefactora a 40 grados Celsius y continúe inyectando lubricante en el canal, lo que provocará un pequeño aumento de presión. Después de unos minutos, las burbujas de aire se difundirán a través del PDMS y todas las superficies quedarán lubricadas.

Para el último paso, retire la presión negativa liberando los postes con un escalpelo. Corte alrededor de la fina película de PDMS. Retire cuidadosamente el respaldo de transparencia del enlace por plasma del dispositivo.

Un sello de PDMS cortado a mano alrededor del área de cultivo del dispositivo. Esterilice el dispositivo sumergiéndolo en etanol al 70 % durante cinco minutos, seguido de un tratamiento bajo luz ultravioleta germicida en una cabina de seguridad biológica durante 45 minutos. Trate la superficie con plasma e incube con colágeno a 100 microgramos por mililitro durante la noche a cuatro grados Celsius.

Después de una incubación nocturna, lave el dispositivo con solución salina tamponada con fosfato estéril o PBS y siembre las células a una densidad de 10 a 15.000 células por centímetro cuadrado. Siguiendo protocolos estándar de cultivo celular, la matriz de microactuadores puede modificarse para realizar experimentos con células cultivadas en construcciones tridimensionales de hidrogel con patrones fotolitográficos. Primero, se fabrica una plataforma basada en PDMS de múltiples capas.

Después de cubrir la plataforma base con metacrilato, se inyecta una solución precursora de hidrogel en un cubreobjetos de vidrio relacionado. Luego, un biomaterial fotosensible se micropatronea en la matriz y se elimina por lavado la solución precursora remanente. La matriz de postes de carga accionados verticalmente puede entonces utilizarse para aplicar fuerzas mecánicas compresivas a células cultivadas en biomateriales tridimensionales, utilizando trozos de cinta adhesiva Scotch para enmascarar las áreas alrededor de los postes, y se recubre el dispositivo con paralina C en un sistema PDS 2010 Lab COTER dos.

Esto mejorará la cinética de polimerización para el sistema de biomaterial. Una vez recubierto, retire el dispositivo del sistema de recubrimiento y desprenda la cinta adhesiva, dejando una capa conformal de paralina C sobre los postes. Luego, silanice la cubreobjetos de vidrio con metacrilato mediante inmersión en una solución al 2% en volumen de trimetoxi metacrilato de propilo en etanol al 95% durante dos minutos.

Lave la cubierta. Incube en etanol al 100 %, seguido de cocción a 100 grados Celsius, dejando grupos metacrilato en la superficie. Coloque un espaciador de PDMS de 200 micrones de espesor.

Coloque la película en una placa de Petri y córtela en secciones pequeñas. Una mediante plasma cuatro de estas secciones pequeñas alrededor del borde del cubreobjetos relacionado con el meac. Luego, una mediante plasma los espacios a las áreas de PDMS del dispositivo que cubre el recubrimiento de Lene C.

Finalmente, esterilice el dispositivo lavándolo con etanol al 70 % y expóngalo a un germicida o luz UV en una cabina de seguridad biológica durante 45 minutos. Para patrones litográficos por luz de los hidrogeles de PEG cargados con células dentro de los dispositivos, prepare las soluciones precursora y de iniciador fotográfico según se describe en el protocolo escrito y mézclelas completamente para obtener una solución con una concentración de 0,4 % peso por volumen de iniciador fotográfico.

Filtre la mezcla a través de un filtro de jeringa de 0,45 micrones para esterilizar y eliminar partículas, las culturas celulares con tripsina en hielo y prepare una suspensión celular en medio de cultivo con una concentración dos veces mayor que la concentración final deseada. Luego, mezcle la suspensión celular y la solución filtrada del precursor del fotoiniciador del hidrogel en una proporción uno a uno. Inyecte la solución en el microdispositivo utilizando una aguja larga de calibre 25.

Evite cuidadosamente atrapar burbujas en el dispositivo. Alinee una máscara de transparencia impresa con las marcas de alineación en la superficie del dispositivo. Configure un sistema de iluminación UV para proporcionar una dosis de UV de 365 nanómetros de 17,5 milivatios por centímetro cuadrado en la superficie del dispositivo.

Ilumine el hidrogel a través de la máscara durante 195 segundos tras la iluminación. Lave con PBS la solución precursora de hidrogel no polimerizada y reemplace el PBS con medio de cultivo; active los postes de carga para comprimir los constructos de hidrogel. Aquí se muestra un dispositivo de muestra completado para cultivo mecanoestimulador en 2D.

Se utiliza un colorante rojo para marcar los canales de suministro de presión de accionamiento y el colorante azul D se utiliza para marcar la caracterización de la deformación en los canales de lubricación. Los experimentos pueden utilizarse para determinar los campos de deformación aplicados mediante el seguimiento del movimiento de microesferas fluorescentes sobre los sustratos. Los puntos rojos representan la ubicación original de las microesferas, mientras que los puntos verdes representan las ubicaciones deformadas.

Un dispositivo de ejemplo para experimentos compresivos tridimensionales se puede observar aquí, donde se utiliza un colorante verde para marcar los canales de presión de actuación. La vista superior del arreglo de micropostes revela el patrón del constructo de hidrogel sobre la parte superior de las imágenes reconstruidas lateralmente de las perlas fluorescentes en el constructo de hidrogel. Las condiciones de reposo y presiones de actuación de 55 kilopascales demuestran el proceso de caracterización de la deformación en un sistema de cultivo tridimensional.

Así que acaban de mostrarle cómo fabricar dispositivos utilizados para estimular mecánicamente células en sistemas de cultivo bidimensionales o tridimensionales. Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantener sus dispositivos lo más limpios y libres de polvo posible y ser paciente, especialmente durante los pasos de alineación. Eso es todo.

Gracias por ver el video y mucha suerte con sus experimentos.