Antígeno Específico de la En Vivo Matar ensayo utilizando CFSE células diana marcadas

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar la calidad funcional de las células T CD8 positivas en respuesta a un antígeno particular, investigando su capacidad para destruir células diana in vivo. Esto se logra primero induciendo células T efectoras CD8 positivas específicas para el antígeno mediante la inmunización de ratones receptores. Como segundo paso, se otorga especificidad a las células diana primarias o se las trata de otro modo, lo que completa la creación del sistema efector-diana específico.

A continuación, las células diana se administran a los ratones receptores mediante transferencia adoptiva retroorbital. Con el fin de observar la actividad citotóxica efectora in vivo, se obtuvieron resultados que indican si los linfocitos efectorores han destruido alguna de las células diana, basándose en el análisis citométrico de flujo de células teñidas con CFSE. Hola, mi nombre es Marina Ward.

Soy estudiante de posgrado en el laboratorio de Gary Splitter en la Universidad de Wisconsin Madison. Este método proporcionará información sobre la actividad citotóxica de los linfocitos T citotóxicos y también puede aplicarse al estudio de la proliferación y supervivencia celular. El procedimiento de transferencia adoptiva será demostrado por el Dr. Jerome Harms, un científico de mi laboratorio. Comience estratégicamente definiendo un sistema específico de células efectoras y dianas.

Por ejemplo, en un ensayo clásico de CTL in vivo, utilice una inmunización con péptido purificado para inducir linfocitos T CD8 positivos específicos; use el mismo péptido para pulsar las células diana singénicas, creando así un sistema específico de efecto sobre el blanco. Descontamine la superficie de trabajo de una campana de seguridad biológica para garantizar la esterilidad de las inyecciones. Prepare la inmunización con péptido colocándola primero en un tubo de dos mililitros.

50 microgramos de péptido purificado en 100 microlitros de DMSO al 10 % en PBS por ratón. A continuación, añada una cantidad igual de adyuvante incompleto frío con perlas de un milímetro para mezclar. Cierre la tapa del tubo con parafina y almacene el inmunógeno en hielo hasta la inyección.

Utilice un agitador de perlas ajustado a la velocidad máxima de rotaciones por minuto para mezclar la emulsión durante tres minutos, colocando inmediatamente después la emulsión de nuevo sobre hielo tras la mezcla. La emulsión resultante debe tener una consistencia similar a la de la mayonesa. Deje reposar la emulsión a cuatro grados Celsius durante la noche o hasta una semana, mezclando nuevamente si se observa alguna separación en el momento de la inmunización.

Identifique los ratones para esta parte del experimento. Utilice una jeringa de un mililitro y una aguja de calibre 20 para aspirar la emulsión. Tenga cuidado de no aspirar ninguna perla al preparar las células diana.

Se utilizan ratones ingénuos síngeños para sacrificar a estos ratones ingénuos. De acuerdo con las normas aprobadas por A-A-A-L-A-C. Rocíe el área correspondiente del ratón con etanol al 70 % para minimizar la posibilidad de contaminación proveniente del ratón, el pelo u otros contaminantes externos; utilizando tijeras de disección, haga un pequeño corte a través de la piel en el lado izquierdo del ratón.

Tire del colgajo de piel para descubrir la bolsa peritoneal y los órganos internos. Corte a través del peritoneo teniendo cuidado de no dañar ninguno de los órganos subyacentes. Localice el bazo, que está cerca de la superficie y tiene un color rojo oscuro.

Extraiga cuidadosamente el bazo e inmediatamente colóquelo en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de medio RPMI preparado sobre hielo. Continúe con los ratones restantes. Transfiera el bazo y el medio a un homogenizador de tejidos de vidrio.

Muela el bazo hasta que todos los tejidos hayan perdido su color. Pase los productos homogeneizados a través de un filtro celular de 70 micrones hacia un tubo cónico de 50 mililitros. Enjuague el homogeneizador una vez con medio fresco y combínelo con el homogenato de bazo vertiendo la mezcla a través del filtro. Centrifugue las muestras a cuatro grados Celsius y 1.300 revoluciones por minuto.

Durante siete minutos, decante y deseche el sobrenadante. Re suspenda el botón celular en 10 mililitros de lisado, reactivos e incube a 37 grados Celsius durante siete minutos. Añada hasta 50 mililitros con medio fresco y recoga las células por centrifugación.

Repita este lavado. Cuente las células y alícuota 10 millones de células por pocillo en una placa de cultivo celular de fondo redondo de 96 pocillos.

Incubar a cuatro grados Celsius durante una hora y media. Transferir al incubador de 37 grados Celsius durante los últimos 30 minutos. Preparar el reactivo CFSE fresco según las indicaciones del fabricante y diluirlo a una concentración de trabajo entre 0,5 y 25 micromolar.

Prepare dos soluciones de CFSE que difieran diez veces en concentración. Equilibre estas soluciones de CFSE de baja y alta concentración a 37 grados Celsius antes de la marcación. Retire la placa de 96 pocillos con las células diana del incubador y pelete las células por centrifugación.

A temperatura ambiente, agite suavemente la placa para eliminar el sobrenadante. Reuspenda las células en 200 microlitros de solución de CFSE de concentración baja o alta e incube durante 15 minutos en un incubador a 37 grados Celsius. Pelieta las células por centrifugación a temperatura ambiente, agite suavemente la placa para eliminar el sobrenadante, reuspenda las células en 200 microlitros de medio fresco e incube durante 30 minutos. Vuelva a pelotar las células por centrifugación a 37 grados Celsius, deseche el sobrenadante y resuspenda los pellet en 50 microlitros de PBS. Reserve parte de las células marcadas para controles sin transferencia durante el análisis de datos y también para su análisis en el citómetro de flujo en el experimento de transferencia adoptiva.

Añada una pocilga de células marcadas con CFSE de baja concentración a una pocilga de células marcadas con CFSE de alta concentración por ratón. Por lo tanto, la inyección resultante consiste en 50% de células diana específicas y 50% de células irrelevantes en 0,1 mililitro. Con el fin de facilitar la transferencia adoptiva, anestesie los ratones inmunizados con péptido e inyecte 0,1 mililitro de células diana marcadas por vía retroorbital en el receptor.

Después de seis horas, sacrificar los ratones receptores para la obtención de células, aislar el bazo del ratón y purificar la población celular mediante el mismo protocolo que se utilizó. Al preparar las células esplénicas diana, sembrar las células a un millón por pocillo en una placa de cultivo tisular de fondo redondo de 96 pocillos, fijar las células recuperadas y no transferidas con paraformaldehído, analizar las muestras en un citómetro de flujo y evaluar los datos. La presentación típica de los resultados de la lisis celular específica se muestra de dos maneras.

Un pico específico del epítopo reducido en el histograma FACS y el valor calculado indican lisis específica de células. Aquí, los números indican el porcentaje de células con fenotipo alto o bajo de CFSE en células control marcadas con CFSE no transferidas recuperadas de un ratón receptor inmunizado con PBS, y células marcadas con CFSE recuperadas de dos ratones receptores diferentes específicos para péptidos. Obsérvense los picos específicos del epítopo reducidos, indicativos de la destrucción específica de células.

Alternativamente, los resultados pueden presentarse gráficamente para indicar la lisis específica de células para cada grupo de ratones. PBS, péptido A y péptido B. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo desarrollar su propio ensayo in vivo de citotoxicidad de linfocitos T citotóxicos utilizando ratones.