Perfiles de metiltransferasas y Otros S-Adenosil- _L-Homocisteína proteínas que se unen mediante espectrometría de masas de captura compuesto (MCP)

El objetivo general del siguiente experimento es caracterizar metiltransferasas a partir de mezclas complejas de proteínas mediante espectrometría de masas con compuestos capturadores o CCMS. Las metiltransferasas se aíslan funcionalmente mediante compuestos capturadores trifuncionales que llevan como función de selectividad el inhibidor del producto general de las metiltransferasas, S-adenosil-L-homocisteína, abreviado SAH. En el flujo de trabajo que se muestra aquí, el aislamiento funcional se logra incubando un lisado celular con el compuesto capturador para establecer un equilibrio de unión reversible entre la función de selectividad del compuesto capturador y las proteínas diana. Como segundo paso, la mezcla se irradia con luz ultravioleta dentro de la caja capra.

La fotoirradiación activa la función de reactividad del compuesto captador. Esto induce la formación de un enlace cruzado covalente irreversible entre el compuesto captador y las proteínas diana. A continuación, los conjugados de compuesto captador y proteína se separan del lisado, se lavan exhaustivamente, se liberan del soporte sólido y se tratan con tripsina para identificar las proteínas capturadas mediante análisis espectrométrico de masas de los péptidos trípticos. Los resultados obtenidos muestran el aislamiento y la identificación directos de metiltransferasas a partir de un lisado celular de Escherichia coli basados en la espectrometría de masas con compuestos captadores.

Hola, soy Thomas Lentz del Laboratorio de CaTECH en el Departamento de Bioquímica. Soy Mathias Rega, también del Laboratorio de Bioquímica CapTech. Soy Mer Linsky del departamento de análisis.

Hoy les mostraremos el procedimiento para la captura en bateo de metiltransferasas a partir de lisado celular equilibrado. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar interacciones entre proteínas y moléculas pequeñas. El procedimiento permite el aislamiento y la identificación de subproteomas funcionales, como quinasas, metaloproteasas, GTPasas, AIS, por mencionar algunos.

También utilizamos este enfoque para el descubrimiento de dianas farmacológicas. Comencemos entonces. Para los experimentos de captura, se utiliza el kit L homocystine caper kit short SAH caper kit para caracoles.

Este kit incluye el compuesto captador de SAH y SAH libre como competidor. También incluye perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina de un micrómetro de diámetro, tampón de captura concentrado cinco veces y tampón de lavado concentrado cinco veces. Usando diferentes tubos de una tira de tubos PCR de 200 microlitros, prepare perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina cargadas con el compuesto captador de SAH mezclando 50 microlitros de perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina al 10 miligramos por mililitro con 25 microlitros de compuesto captador de SAH a 100 micromolar para cada Eloqua vigorosamente.

Agite las suspensiones resultantes a temperatura ambiente durante dos minutos para permitir la unión de la porción de biotina del compuesto de captura con la estreptavidina en la superficie de las perlas magnéticas. Luego, recoja magnéticamente las perlas capra en las tapas de los tubos PCR utilizando el capra mag, deseche el sobrenadante y resuspenda las perlas capra resultantes en 200 microlitros de tampón de lavado al uno por ciento. Vuelva a recolectar magnéticamente las perlas capra en las tapas de las tiras de tubos PCR y deseche el sobrenadante.

Luego, cierre los tubos para evitar el secado de las perlas. A continuación, etiquete nuevos tubos para el ensayo de captura y los controles necesarios, incluyendo el control de competencia. Realice el control de competencia del ensayo de precipitación y del ensayo combinado de captura más precipitación, y coloque los tubos etiquetados en la caja Capra para regular la temperatura entre cero y cuatro grados Celsius.

Luego, pipetee el volumen de agua milli Q calculado para un volumen final de reacción de 100 microlitros y 20 microlitros de tampón de captura cinco veces concentrado. Para cada reacción, añada 0,26 miligramos de lisado celular completo de E. coli DH5α a cada tubo y mezcle suavemente por inversión. Para el control de competencia y el control de competencia del ensayo de precipitación, añada 20 microlitros de solución competidora de SAH 10 milimolar.

Para el ensayo de captura, agregue 20 microlitros de agua milli Q en lugar de la solución de SAH, mezcle suavemente todos los tubos mediante inversión y centrifugue brevemente. Luego, suspenda las perlas Capra en el lisado respectivo e incube durante tres horas a cuatro grados Celsius. Mantenga las perlas en suspensión mediante rotación para permitir la unión reversible de las proteínas que se unen al SAH a la función de selectividad del compuesto de captura de SAH.

Tras la incubación, centrifugar brevemente y colocar las suspensiones en la caja Capra. Separar los tubos y retirar las suspensiones para la precipitación por afinidad y el control de competencia de la precipitación por afinidad, poniéndolas en hielo. Dejar las suspensiones restantes para el control de competencia del ensayo de captura y para el ensayo de captura combinado.

Coloque el botón de extracción en la caja Capra para irradiar las muestras con luz ultravioleta mientras las enfría simultáneamente. Irradie las muestras durante un tiempo total de 30 minutos con intervalos de irradiación de 2,5 minutos en los tubos cerrados entre cero y cuatro grados Celsius. Este proceso formará un enlace covalente cruzado entre la función de reactividad del compuesto captador SAH y las proteínas que se unen a SAH.

Retire las suspensiones de la caja Capra tras un intervalo de irradiación de 2,5 minutos. Enfríe en agua con hielo durante aproximadamente 15 segundos y mezcle varias veces invirtiendo los tubos. Luego, centrifugue brevemente las muestras para eliminar cualquier suspensión residual en las tapas y colóquelas nuevamente en la caja Capra para el siguiente intervalo de irradiación.

A continuación, incluya las suspensiones para la captura y el control de competencia de la captura, y agregue 20 microlitros de solución de SAH 10 milimolar al ensayo de captura para el control de competencia, el control de competencia de captura y el ensayo combinado de captura más captura. Añada 20 microlitros de agua milli Q. Incube las suspensiones durante 10 minutos a cuatro grados Celsius, manteniendo las perlas y la suspensión en rotación en el ensayo de captura. Las proteínas que se unen al SAH y que no están entrecruzadas con el compuesto de captura de SAH serán desplazadas.

Tras la incubación, recopile las perlas Capra de las suspensiones utilizando el Capra Mag y deseche el sobrenadante. Luego, lave las perlas mediante resuspensión, suspendiéndolas en 200 microlitros de tampón de lavado al uno por ciento y recopilando las perlas mediante separación magnética. Repita este lavado cinco veces, luego resuspenda las perlas en 200 microlitros de agua Milli-Q y recopile las perlas mediante separación magnética.

Re-suspender las perlas en 200 microlitros de acetonitrilo al 60% y recoger las perlas utilizando el capri mag. Repetir este lavado con acetonitrilo dos veces. Aplicar ultrasonido si las perlas no se pueden resuspender fácilmente.

A continuación, libere las proteínas capturadas de las perlas mediante la adición de 200 microlitros de acetonitrilo al 60%, ácido trifluoroacético al 0,2%, recién preparado, seguido de una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente con agitación vigorosa. Vuelva a aplicar ultrasonido si las perlas no se pueden resuspender fácilmente.

Finalmente, recoger magnéticamente las perlas y deséchelas. Corte la tira de tubos en tubos individuales, perfore las tapas y evapore el sobrenadante hasta sequedad. En esta etapa, utilizando un evaporador centrífugo, las proteínas capturadas pueden someterse a electroforesis SDS-PAGE o procesarse para espectrometría de masas como se describe en la siguiente sección; disuelva las proteínas capturadas liberadas de las perlas magnéticas en 10 microlitros de bicarbonato de amonio 50 milimolar.

Coloque las muestras en un baño de ultrasonidos y luego vortexéelas. A continuación, agregue un microlitro de tripsina al 0,5 microgramos por microlitro en HCl 1 milimolar, centrifugue brevemente e incube la solución a 37 grados Celsius durante la noche. Tras la incubación nocturna, desaline una solución que contenga los péptidos trípticos de las proteínas capturadas utilizando material C18, como puntas de etapa (stage tips) de 20 microlitros según las instrucciones del fabricante de Biosystems, y eluya los péptidos dos veces con 10 microlitros de metanol al 50%, ácido fórmico al 5%.

Luego, evapore el disolvente utilizando un evaporador centrífugo, dejando los péptidos desalados secos; disuelva los péptidos en 5,5 µL de ácido fórmico al 0,1 % aplicando ultrasonidos en un baño ultrasónico y agitando en vórtex. Finalmente, analice la muestra mediante cromatografía líquida de nano flujo acoplada a espectrometría de masas en tándem, como se describe en el protocolo escrito. Para analizar los datos de MS/MS, utilice un algoritmo de identificación de proteínas como Sequest implementado en el navegador Bioworks versión 3.3.1, SP1 y X!Tandem implementado en el software Scaffold 3.

Se realiza una búsqueda automatizada en la base de conocimientos más reciente del recurso universal de proteínas. Base de datos Swiss-Prot, versión publicada en www.xpai.org del organismo estudiado.

La base de datos utilizada para el presente estudio es una cepa de coli. K12 versión 57 guion 11 dentro de Seaquest configurada para búsquedas automatizadas en bases de datos con una tolerancia de cinco partes por millón para el precursor. Una tolerancia de unión de iones fragmento de una unidad de masa atómica y tripsina completa con especificidad permitiendo hasta dos cortes perdidos.

Establezca las modificaciones variables para permitir la fosforilación en serina, treonina y tirosina, la oxidación de metionina, la desamidación en asparagina y glutamina, la acetilación en lisina, la formilación en lisina y la metilación en arginina, lisina, serina, treonina y asparagina. No utilice modificaciones fijas en la búsqueda en la base de datos; cargue los archivos DTA o SRF generados por Seaquest en el software Scaffold 3, que realiza la evaluación de probabilidad de las asignaciones de péptidos y las identificaciones de proteínas combinando búsquedas en bases de datos de Seaquest y X!Tandem. Scaffold es útil para comparar, validar y visualizar fácilmente listas de proteínas provenientes de varias muestras.

Configure los parámetros en el software Scaffold Three para aceptar únicamente identificaciones de proteínas y para informar como identificaciones distintas. Establezca que las identificaciones contengan al menos un péptido discriminante que haya superado la validación de probabilidad. Según el análisis de Scaffold Three, considere únicamente péptidos con una probabilidad mayor o igual al 95 %, según lo especificado por el algoritmo Peptide Prophet dentro de Scaffold.

Tres programas informáticos establecen probabilidades de identificación proteica para múltiples asignaciones de péptidos mayores o iguales al 95 % según el algoritmo protein prophet. Para las identificaciones proteicas con un solo péptido, se establece arbitrariamente una probabilidad proteica mayor o igual al 50 % y se inspecciona manualmente el péptido correspondiente. Las proteínas cuyos espectros MS/MS comprenden péptidos similares y que no pueden diferenciarse únicamente mediante análisis MS/MS son agrupadas por el software para cumplir con los principios de parsimonia.

La tasa estimada de descubrimientos falsos en las identificaciones de péptidos puede determinarse utilizando el enfoque de la base de datos de proteínas invertida y debe ser inferior al 1%. Aquí, se muestra en el ensayo de captura un análisis por electroforesis SDS-PAGE teñido con plata de las proteínas intactas capturadas. Se añadió exceso de SAH libre después del paso de irradiación con UV para asegurar que solo se aíslan las proteínas que tienen el compuesto de captura unido covalentemente mediante la función de fotoactividad.

Las proteínas se identificaron mediante MS a partir de bandas de gel proteico cortadas tras la digestión con el triptícuo Ingel. Para comparación, la banda más a la izquierda muestra el 0,25 % del lisado total de células de e coli DH cinco alfa a partir del cual se aislaron las proteínas en el ensayo de captura. Esta comparación destaca la reducción drástica de la complejidad de la muestra lograda mediante la tecnología de compuestos de captura.

Los controles se realizaron en el centro del gel e incluyen el control de competencia del ensayo. Este control contiene exceso de SAH libre como competidor antes del paso de radiación UVI para evitar la unión de proteínas al compuesto de captura SAH mediante la función de selectividad por SAH. El control de competencia es esencial para determinar las proteínas capturadas de forma no específica que no se unen a SAH.

Por lo tanto, las proteínas identificadas en el ensayo de captura, pero no en el control de competencia, son proteínas específicas de unión a SAH. También se incluye un experimento de precipitación sin irradiación UV y sin adición de SAH libre.

El control de competencia del ensayo de precipitación tampoco se irradia, pero contiene SAH como competidor. Finalmente, el ensayo combinado de captura más precipitación se irradia con UV y no se agregó SAH libre durante el procedimiento. Es evidente que la reticulación por fotoactivación mejora el rendimiento y la sensibilidad del experimento, y que la especificidad puede evaluarse fácilmente en experimentos de competencia utilizando un exceso de SAH libre, en lugar de analizar las proteínas intactas capturadas mediante electroforesis SDS-PAGE.

Toda la mezcla de proteínas capturadas puede analizarse simultáneamente mediante cromatografía líquida de flujo en nanoacoplada a espectrometría de masas en tándem después de la digestión con Triptych. Este es el enfoque CCMS real y es mucho más sensible que el análisis mediante geles SDS-PAGE. Las METILTRANSFERASAS y otras proteínas seleccionadas identificadas mediante experimentos CCMS se muestran en esta tabla.

Los números indicados denotan el recuento espectral de péptidos sin ponderar por proteína; se identificaron muchas más metiltransferasas y otras proteínas que se unen a SAH en el ensayo de captura en comparación con el ensayo de precipitación. La especificidad por SAH se muestra por la ausencia casi completa de estas proteínas en el control de competencia. Se tabuló el número total de proteínas identificadas en los análisis de CCMS y el traslape de proteínas entre los análisis.

El número de proteínas identificadas con al menos dos péptidos se indica entre paréntesis. La alta reproducibilidad del método puede inferirse del elevado solapamiento de proteínas, principalmente inespecíficas, entre experimentos comparables, especialmente en las proteínas identificadas de forma robusta con al menos dos péptidos aquí. Los diagramas de Venn describen el solapamiento de proteínas identificadas en el ensayo de captura, el control de competición y el análisis de precipitación, mientras que los números de todas las proteínas identificadas se indican a la derecha, con los números de proteínas identificadas con al menos dos péptidos entre paréntesis; los números de metiltransferasas y de nucleasa SAH se muestran a la izquierda.

Acabamos de mostrarle cómo aislar e identificar metiltransferasas u otros subproteomas funcionales a partir de lisado celular de e coli o de otros tejidos o lisados celulares mediante espectrometría de masas con compuestos de captura o CCMS. Al realizar este procedimiento, es importante recordar evitar la exposición prolongada del compuesto de captura a la luz visible para mantener las muestras frías, preparar recientemente la solución de acetonitrilo con TFA utilizada para liberar las proteínas capturadas de las perlas magnéticas y evitar la contaminación de los experimentos por fuentes externas de proteínas, como la queratina proveniente del polvo o del experimentador.

Además, descubrimos que depende de la configuración específica, si la configuración fuera de fase, si la fotoenlazado ocurre entre el compuesto previo a la recaptura y las proteínas en solución o si la configuración en fase aquí descrita funciona mejor. Eso es todo. Gracias por verlo y buena suerte con sus experimentos.