Name: Aplicación de una conductancia del receptor NMDA en las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo de rata con la técnica de sujeción dinámica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-21T15:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Aprende a aplicar conductancia del receptor NMDA en neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo de rata mediante la técnica de sujeción dinámica. Este método permite controlar con precisión la activación receptora y estudiar la actividad neuronal en tiempo real.

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Este trabajo fue apoyado por MH084494 (CJL), y MH079276 y NS060658 (CAP).

1. Preparación Cortar <ol><li> Cortar rodajas de cerebro usando un micrótomo de vibración. Hemos preparado 240 micras cortes horizontales del cerebro medio de una isoflurano anethetized ratas Sprague-Dawley (Charles River Laboratories) usando un microtomo vibrante (Microm HM 650V), de acuerdo con la Universidad de Texas en San Antonio de Cuidado de Animales institucional y el empleo. </li><li> Mantenga los segmentos en una cámara de incubación hasta que esté listo para grabar. Utilizamos un recipiente de incubación se calienta a 32 ° C y lleno de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF, en mM): NaCl 126, KCl 2,5, 1,25 NaH 2 PO 4, 4 MgCl 2, 2 CaCl2, 10 de dextrosa, 25 de NaHCO3, 1,3 de ácido ascórbico, 2,4 piruvato de sodio y glutatión 0,05. </li></ol> 2. Registro electrofisiológico <ol><li> La transferencia de la división para el equipo de grabación intracelular en el que un líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) a 35 ° C se perfundidos. Nosotros utilizamos la misma que en LCRa 1,2 excepto que 2mM de MgCl 2 fue utilizado y el glutatión se omitió. Para cortes en horizontal preparada, que normalmente atraviesan el corte a lo largo de la línea media. </li><li> Visualizar la neurona diana. Visualizamos cada sustancia negra neuronas dopaminérgicas con un sistema de gradiente de contraste de imagen. </li><li> Tirar de un electrodo con un extractor de electrodos electrónicos. Tiramos los electrodos con una resistencia de punta de 4.10 mW con un extractor P97 Micropipeta (Compañía Sutter Instrument). </li><li> Llenar un electrodo con la solución interna deseada. Utilizamos una solución que contiene (en mM): 138 K-gluconato, 10 HEPES, 2 MgCl 2, 0,2 EGTA, 0,0001 CaCl 2, 4 Na-ATP, 0,4 Na-GTP. La solución interna se ajustó a un pH de 7,3 con KOH 1M y una osmolaridad de 270-275 MOSMS. </li><li> Hacer un sello gigaohm en la neurona que desee. La ruptura con el sello de succión. Esto constituye un registro de células enteras. Un amplificador de MultiClamp 700B se utiliza en nuestra configuración. El amplificador debe ser colocado en el modo de pinza de corriente de la 'I = 0'. </li></ol> 3. Conductancia de aplicación con pinza dinámica <ol><li> RTXI (www.rtxi.org) fue ejecutado en la computadora pinza dinámica. Un modelo personalizado por escrito que contiene un receptor de NMDA se ha cargado en la memoria. La corriente que se inyecta en las células en tiempo real se calcula por la siguiente ecuación: I = NMDA NMDA-g * [1 / (1 ​​+ ([Mg] / 3,57) * e (-V m * 0.062))] * (V m - E NMDA) donde g es la conductancia NMDA deseada (en ns; por defecto es 0 ns), [Mg] es la concentración de magnesio (se establece en 1,5 mM en el ejemplo a continuación), E NMDA es el potencial de inversión para el receptor de NMDA (a 0 mV), y V m es el potencial de membrana de la célula de medida desde el amplificador (en milivoltios). </li><li> La salida de la computadora pinza dinámica se conecta a la entrada de comandos del amplificador a través de un convertidor de analógico a digital. </li><li> El amplificador se coloca en modo de pinza de corriente de la "IC". </li><li> Ingrese su conductividad deseada del receptor NMDA en RTXI (por ejemplo, 40 ns). Usted debe ver una explosión fásica de potenciales de acción. Por otra parte, la conductancia se puede dar a través de RTXI una salida analógica (Figura 1, 'g (t)'). Un factor de escala apropiado debe ser utilizado dentro de RTXI para convertir la señal de voltios a Siemens. </li></ol> 4. Resultados representante Una configuración de éxito para la aplicación de una conductividad usando la pinza dinámica se muestra en la Figura 1. Con esta instalación, hemos hecho una célula somática toda la grabación de una neurona dopaminérgica en la sustancia negra pars compacta. Las células dopaminérgicas general inflama espontáneamente en las tarifas bajas con un patrón similar al marcapasos. Una ráfaga de potenciales de acción puede ser provocado por la aplicación fásica de una conductancia del receptor NMDA con pinza dinámica (fig. 1B). <img src="/files/ftp_upload/2275/2275fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: Aplicación de una conductancia de los receptores NMDA mediante la técnica de la pinza dinámica. Configuración de hardware A. ilustra las conexiones entre el equipo de registro intracelular y el ordenador pinza dinámica. B. Una ráfaga de potenciales de acción es provocada por la aplicación de una conductancia de los receptores NMDA 40ns en una grabación de células enteras de una sustancia negra pars compacta dopaminérgicos neurona.

<ol><li>Robinson, H. P., Kawai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+digitally+synthesized+synaptic+conductance+transients+to+measure+the+integrative+properties+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons.</a> J Neurosci Methods. 49, 157-165 (1993).</li>
<li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+clamp%3A+artificial+conductances+in+biological+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons.</a> Trends Neurosci. 16, 389-394 (1993).</li>
<li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clamp%3A+computer-generated+conductances+in+real+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons.</a> J Neurophysiol. 69, 992-995 (1993).</li>
<li>Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+clamp+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The dynamic clamp comes of age.</a> Trends Neurosci. 27, 218-224 (2004).</li>
<li>Deister, C. A., Teagarden, M. A., Wilson, C. J., Paladini, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intrinsic+neuronal+oscillator+underlies+dopaminergic+neuron+bursting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An intrinsic neuronal oscillator underlies dopaminergic neuron bursting.</a> J Neurosci. 29, 15888-15897 (2009).</li>
<li>Lobb, C. J., Wilson, C. J., Paladini, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+role+for+GABA+receptors+on+the+firing+pattern+of+midbrain+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">A dynamic role for GABA receptors on the firing pattern of midbrain dopaminergic neurons.</a> J Neurophysiol. 104, 403-413 (2010).</li>
</ol>

La técnica de la pinza dinámica demostrado aquí mejora de la técnica tradicional de la inyección de corriente continua al permitir que el experimentador para imitar los efectos eléctricos de la activación de un receptor. En este video, nos han demostrado que se puede añadir los efectos de la activación de un receptor de NMDA en la actividad espontánea de las neuronas dopaminérgicas, es decir, una ráfaga de potenciales de acción son evocados. Debido a la flexibilidad de la aplicación de hardware / software, una variedad de extensiones se pueden utilizar. El signo de la corriente inyectada se puede cambiar de negativo a positivo, lo que representa un escenario donde los efectos del receptor activado se elimina de una neurona. Neuronas modelo, representado en la forma de una serie de ecuaciones diferenciales, también puede ser resuelto numéricamente y permitir que el experimentador para investigar las redes pequeñas.

<table><tbody><tr><td>K-gluconato anhidro</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Reactivo</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; X 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Reactivo</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenglicol-bis(B-aminoetil éter)-N,N,N&amp;#8211;N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-tetraacético</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Reactivo</td><td>MP Biomedicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaGTP</td><td>Reactivo</td><td>MP Biomedicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Reactivo</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, Anhidro</td><td>Reactivo</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Reactivo</td><td>Acros Organics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Reactivo</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CholCl</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Reactivo</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Reactivo</td><td>Acros Organics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutatión</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Olympus BX51WI (con objetivo de 40x)</td><td>Microscopio</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 convertidores A/D</td><td>Equipo</td><td>Cualquier proveedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp 700B con etapa de cabezal CV-7B</td><td>Equipo</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas P-97 Flaming/Brown</td><td>Equipo</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agujas de jeringa Microfil</td><td>Equipo</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Equipo</td><td>Siskiyou, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monitor</td><td>Equipo</td><td>Triview</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

aplicación de una conductancia del receptor nmda en las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo de rata con la técnica de sujeción dinámica

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

Los neurocientíficos estudiar la función del cerebro mediante la investigación de cómo las neuronas del cerebro se comunican. Muchos investigadores observar los cambios en la actividad eléctrica de una o más neuronas en respuesta a una entrada experimental controlado. La actividad eléctrica de las neuronas se pueden grabar en rodajas de cerebro aislado utilizando técnicas de patch clamp con micropipetas de vidrio. Tradicionalmente, los investigadores pueden simular la entrada neuronal mediante la inyección de corriente a través de la pipeta, la estimulación eléctrica de las células de otros o resto de conexiones axonal en el corte, o la manipulación farmacológica de los receptores situados en la membrana de la célula neuronal registrada. Inyección de corriente directa tiene la ventaja de transmitir una forma de onda predeterminada actual con una precisión temporal de alta en el lugar de la grabación (por lo general el soma). Sin embargo, eso no cambia la resistencia de la membrana neuronal, como no hay canales de iones son físicamente abierto. Inyección de corriente por lo general emplea pulsos rectangulares y por lo tanto no modelar la cinética de los canales iónicos. Por último, la inyección de corriente no pueden imitar los cambios químicos en la célula que se produce con la apertura de los canales iónicos. Receptores pueden ser físicamente activa por estimulación eléctrica o farmacológica. El experimentador tiene una buena precisión temporal de la activación del receptor con la estimulación eléctrica de la división. Precisión sin embargo, no se limita espacial de la activación del receptor y la naturaleza exacta de lo que se activa por estimulación es desconocida. Este último problema puede reducirse en parte mediante agentes farmacológicos específicos. Por desgracia, el curso temporal de la activación de los agentes farmacológicos suele ser lenta y la precisión espacial de las entradas registradas en la celda se desconoce. La técnica de la pinza dinámica permite un experimentador para cambiar la corriente pasa directamente a la celda sobre la base de información en tiempo real del potencial de membrana de la célula (Robinson y Kawai 1993, Sharp et al, 1993a, b;. Para revisión, ver Prinz et al. 2004). Esto permite que un experimentador para imitar los cambios eléctricos que ocurren en el lugar de la grabación en respuesta a la activación de un receptor. En tiempo real los cambios en la corriente aplicada se determina por una ecuación matemática implementado en el hardware. Recientemente, hemos utilizado la técnica de la pinza dinámica para investigar la generación de ráfagas de potenciales de acción por la activación fásica de los receptores NMDA en las neuronas dopaminérgicas de la sustancia nigra pars compacta (Deister et al, 2009;. Lobb et al, 2010).. En este vídeo, que muestran los procedimientos necesarios para aplicar una conductancia de los receptores de NMDA en la neurona dopaminérgica.

En este video, que muestra cómo aplicar una conductancia en una neurona dopaminérgica registrado en la configuración de célula entera, en rodajas de cerebro de rata. Esta técnica se llama la pinza dinámica.

Aplicación de una conductancia del receptor NMDA en las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo de rata con la técnica de sujeción dinámica

Los neurocientíficos estudian la función del cerebro investigando cómo se comunican las neuronas cerebrales. Muchos investigadores analizan los cambios en la ...

Los neurocientíficos estudian la función del cerebro investigando cómo las neuronas en el cerebro se comunican. Aquí, se inducen cambios en la actividad eléctrica de una sola neurona mediante la aplicación de una conductancia controlada experimentalmente utilizando la técnica de bloqueo dinámico. Primero, se cortan y almacenan finos fragmentos de tejido cerebral en una cámara de incubación llena de líquido cefalorraquídeo artificial.A continuación, se transfiere una sección a un equipo de registro de voltaje y corriente. Se selecciona una neurona y luego se realiza un registro con un electrodo de grabación utilizando un ordenador con clamp dinámico conectado al amplificador de registro. Se aplica una conductancia del receptor NMDA en la célula.Las grabaciones resultantes muestran un estallido de potenciales de acción, lo que sugiere que la activación de los receptores NMDA es un mecanismo celular mediante el cual las neuronas dopaminérgicas pueden generar ráfagas. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos actuales como la inyección de corriente directa o el tratamiento farmacológico es que podemos determinar con precisión los efectos de la activación de un receptor definido experimentalmente sobre la actividad eléctrica de una neurona viva. Después de extraer rápidamente el cerebro de una rata Bragg dolly anestesiada, se cortaron fetes horizontales del cerebro de 240 micrómetros utilizando un microtomo vibrante.Mientras se cortan las secciones, utilice una pipeta de transferencia para colocarlas en una cámara de incubación a 32 grados Celsius llena de líquido cefalorraquídeo artificial hasta el momento de realizar los experimentos de registro. El sistema de registro intracelular consta de un microscopio con objetivos configurados para imágenes de contraste de gradiente, un monitor, un sistema de perfusión, un amplificador Multi Clamp 700 B, un convertidor analógico-digital, un micromanipulador y una etapa de cabeza. Un ordenador Mac Pro ejecuta el software de adquisición de datos, Axo Graph X y el software Multi Clamp Commander. Junto al sistema de registro intracelular y al ordenador Mac Pro se encuentra un ordenador Sun Microsystems que ejecuta Linux en tiempo real, junto con su convertidor analógico-digital, el cual se utilizará con la técnica de clamp dinámico.El equipo de registro intracelular debe perfundir un líquido cefalorraquídeo artificial a aproximadamente 35 grados Celsius. Si la sección que se va a registrar fue preparada horizontalmente, utilice una pipeta de transferencia para colocarla en una placa de Petri con líquido cefalorraquídeo artificial y, con una herramienta de corte, divida la sección a lo largo de la línea media. A continuación, para realizar los registros electrofisiológicos, use una pipeta para transferir la sección al equipo de registro intracelular.Utilizando el objetivo de 40 x, visualice la neurona diana aquí; se observa una neurona dopaminérgica individual de la sustancia negra. Observe el soma de forma elíptica con dos dendritas que se extienden. Utilizando un micropipeteador electrónico P 97, prepare electrodos con una resistencia de punta de cuatro a 10 megaohmios.A continuación, utilizando una aguja de jeringa microfill, llene un electrodo con la solución interna. Introduzca el electrodo lleno en la media celda, conectada al cabezal del amplificador, usando una jeringa conectada a la media celda mediante un pequeño tramo de tubo. Aplique una pequeña cantidad de presión positiva al electrodo de registro. Bajo guía visual, baje el electrodo hasta la neurona diana. Se observará un hundimiento en la superficie de la célula. Aplique una pequeña cantidad de presión negativa para crear un sello gigaseal en la neurona deseada.Aplique succión mediante la boca para romper el sello. Esto constituye una grabación de célula íntegra. Después de que se haya roto el sello, utilice la interfaz de software multi clamp commander para colocar el amplificador en el modo de fijación de corriente, en el cual no se puede inyectar corriente.Para aplicar una conductancia NMDA a esta célula, comience ejecutando el software RTXI en la computadora del clamp dinámico. Luego cargue un modelo escrito personalizado que contenga un receptor NMDA en la memoria. Una vez que el modelo se haya cargado en la memoria de RTXI, se calculará la corriente que se inyectará en la célula en tiempo real utilizando la ecuación mostrada aquí, donde G-N-M-D-A es la conductancia deseada en nanosiemens, establecida en cero nanosiemens.Semmens, por defecto, MG es la concentración de magnesio. E-N-M-D-A es el potencial de reversión para el receptor NMDA, establecido en cero milivoltios, y VM es el potencial de membrana de la célula medido desde el amplificador en milivoltios. Ahora, con el cable BNC estándar, conecte la salida del ordenador de fijación dinámica a la entrada de comando del amplificador mediante un convertidor analógico a digital.Coloque el amplificador en el modo estándar de fijación de corriente ic utilizando la interfaz de software Multi Clamp Commander. RTXI ha sido configurado para recibir la conductancia deseada GFT a partir de una señal de voltaje proveniente del software de adquisición de datos Axo Graph X. Aquí ejecutamos un protocolo sencillo de AXO Graph X en el que se aplica un escalón de conductancia de 40 nano Siemens durante un segundo a la célula.Se evoca un estallido de potenciales de acción en respuesta al escalón de conductancia utilizando el montaje descrito en este video; se realizó un registro somático en todo el célula de una neurona dopaminérgica en la sustancia negra pars compacta. Las células dopaminérgicas generalmente disparan espontáneamente a tasas bajas con un patrón similar al de un marcapasos. Un estallido de potenciales de acción puede evocarse mediante la aplicación fásica de una conductancia del receptor NMDA con fijación dinámica.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aplicar una conductancia NMDA en una neurona dopaminérgica viva en un corte cerebral aislado. Sin embargo, esta técnica puede utilizarse para cualquier tipo celular que pueda registrarse mediante técnicas electrofisiológicas estándar. De manera similar, el clamp dinámico puede ampliarse para imitar los efectos eléctricos, pero una amplia variedad de tipos de receptores.Esperamos que este video haya sido útil para demostrar en qué consiste la técnica del clamp dinámico y cómo la utilizamos en nuestro laboratorio. Gracias por verlo.

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