Aplicación de una conductancia del receptor NMDA en las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo de rata con la técnica de sujeción dinámica

Los neurocientíficos estudian la función del cerebro investigando cómo las neuronas en el cerebro se comunican. Aquí, se inducen cambios en la actividad eléctrica de una sola neurona mediante la aplicación de una conductancia controlada experimentalmente utilizando la técnica de bloqueo dinámico. Primero, se cortan y almacenan finos fragmentos de tejido cerebral en una cámara de incubación llena de líquido cefalorraquídeo artificial.

A continuación, se transfiere una sección a un equipo de registro de voltaje y corriente. Se selecciona una neurona y luego se realiza un registro con un electrodo de grabación utilizando un ordenador con clamp dinámico conectado al amplificador de registro. Se aplica una conductancia del receptor NMDA en la célula.

Las grabaciones resultantes muestran un estallido de potenciales de acción, lo que sugiere que la activación de los receptores NMDA es un mecanismo celular mediante el cual las neuronas dopaminérgicas pueden generar ráfagas. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos actuales como la inyección de corriente directa o el tratamiento farmacológico es que podemos determinar con precisión los efectos de la activación de un receptor definido experimentalmente sobre la actividad eléctrica de una neurona viva. Después de extraer rápidamente el cerebro de una rata Bragg dolly anestesiada, se cortaron fetes horizontales del cerebro de 240 micrómetros utilizando un microtomo vibrante.

Mientras se cortan las secciones, utilice una pipeta de transferencia para colocarlas en una cámara de incubación a 32 grados Celsius llena de líquido cefalorraquídeo artificial hasta el momento de realizar los experimentos de registro. El sistema de registro intracelular consta de un microscopio con objetivos configurados para imágenes de contraste de gradiente, un monitor, un sistema de perfusión, un amplificador Multi Clamp 700 B, un convertidor analógico-digital, un micromanipulador y una etapa de cabeza. Un ordenador Mac Pro ejecuta el software de adquisición de datos, Axo Graph X y el software Multi Clamp Commander. Junto al sistema de registro intracelular y al ordenador Mac Pro se encuentra un ordenador Sun Microsystems que ejecuta Linux en tiempo real, junto con su convertidor analógico-digital, el cual se utilizará con la técnica de clamp dinámico.

El equipo de registro intracelular debe perfundir un líquido cefalorraquídeo artificial a aproximadamente 35 grados Celsius. Si la sección que se va a registrar fue preparada horizontalmente, utilice una pipeta de transferencia para colocarla en una placa de Petri con líquido cefalorraquídeo artificial y, con una herramienta de corte, divida la sección a lo largo de la línea media. A continuación, para realizar los registros electrofisiológicos, use una pipeta para transferir la sección al equipo de registro intracelular.

Utilizando el objetivo de 40 x, visualice la neurona diana aquí; se observa una neurona dopaminérgica individual de la sustancia negra. Observe el soma de forma elíptica con dos dendritas que se extienden. Utilizando un micropipeteador electrónico P 97, prepare electrodos con una resistencia de punta de cuatro a 10 megaohmios.

A continuación, utilizando una aguja de jeringa microfill, llene un electrodo con la solución interna. Introduzca el electrodo lleno en la media celda, conectada al cabezal del amplificador, usando una jeringa conectada a la media celda mediante un pequeño tramo de tubo. Aplique una pequeña cantidad de presión positiva al electrodo de registro.

Bajo guía visual, baje el electrodo hasta la neurona diana. Se observará un hundimiento en la superficie de la célula. Aplique una pequeña cantidad de presión negativa para crear un sello gigaseal en la neurona deseada.

Aplique succión mediante la boca para romper el sello. Esto constituye una grabación de célula íntegra. Después de que se haya roto el sello, utilice la interfaz de software multi clamp commander para colocar el amplificador en el modo de fijación de corriente, en el cual no se puede inyectar corriente.

Para aplicar una conductancia NMDA a esta célula, comience ejecutando el software RTXI en la computadora del clamp dinámico. Luego cargue un modelo escrito personalizado que contenga un receptor NMDA en la memoria. Una vez que el modelo se haya cargado en la memoria de RTXI, se calculará la corriente que se inyectará en la célula en tiempo real utilizando la ecuación mostrada aquí, donde G-N-M-D-A es la conductancia deseada en nanosiemens, establecida en cero nanosiemens.

Semmens, por defecto, MG es la concentración de magnesio. E-N-M-D-A es el potencial de reversión para el receptor NMDA, establecido en cero milivoltios, y VM es el potencial de membrana de la célula medido desde el amplificador en milivoltios. Ahora, con el cable BNC estándar, conecte la salida del ordenador de fijación dinámica a la entrada de comando del amplificador mediante un convertidor analógico a digital.

Coloque el amplificador en el modo estándar de fijación de corriente ic utilizando la interfaz de software Multi Clamp Commander. RTXI ha sido configurado para recibir la conductancia deseada GFT a partir de una señal de voltaje proveniente del software de adquisición de datos Axo Graph X. Aquí ejecutamos un protocolo sencillo de AXO Graph X en el que se aplica un escalón de conductancia de 40 nano Siemens durante un segundo a la célula.

Se evoca un estallido de potenciales de acción en respuesta al escalón de conductancia utilizando el montaje descrito en este video; se realizó un registro somático en todo el célula de una neurona dopaminérgica en la sustancia negra pars compacta. Las células dopaminérgicas generalmente disparan espontáneamente a tasas bajas con un patrón similar al de un marcapasos. Un estallido de potenciales de acción puede evocarse mediante la aplicación fásica de una conductancia del receptor NMDA con fijación dinámica.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aplicar una conductancia NMDA en una neurona dopaminérgica viva en un corte cerebral aislado. Sin embargo, esta técnica puede utilizarse para cualquier tipo celular que pueda registrarse mediante técnicas electrofisiológicas estándar. De manera similar, el clamp dinámico puede ampliarse para imitar los efectos eléctricos, pero una amplia variedad de tipos de receptores.

Esperamos que este video haya sido útil para demostrar en qué consiste la técnica del clamp dinámico y cómo la utilizamos en nuestro laboratorio. Gracias por verlo.