Un alelo-específicas Gene ensayo de expresión para probar la base funcional de las asociaciones genéticas

El objetivo general del siguiente experimento es probar si una variante particular de ADN, como una asociada con una enfermedad, tiene un efecto sobre la expresión de un gen específico. Esto se logra seleccionando líneas celulares que sean heterocigotas tanto para esta variante como para un polimorfismo de un solo nucleótido (snip) en el gen de interés. Como segundo paso, se extraen ADN y ARN de las células y luego se utilizan como plantilla para una reacción de extensión primaria específica de alelo.

A continuación, los productos primarios de extensión se analizan mediante espectrometría de masas para cuantificar la abundancia relativa de los dos alelos. Se obtienen resultados que indican si la variante de ADN original asociada con una enfermedad también está asociada con una diferencia en la expresión génica basada en mediciones cuantitativas específicas de alelos mediante espectrometría de masas. Las principales ventajas de esta técnica son que, a diferencia de un ensayo de gen reportero con luciferasa, no requiere manipulación molecular y mide los niveles endógenos de expresión génica.

Además, somos capaces de comparar los niveles de expresión entre los dos alelos de manera internamente controlada, lo que elimina parte de la variabilidad experimental. Este método nos ayuda a responder preguntas clave en el campo de la genética humana, como los mecanismos moleculares que subyacen a las asociaciones genéticas. Planteamos por primera vez esta idea cuando identificamos una asociación genética que abarcaba tres genes y no pudimos precisar la señal en uno solo.

Mediante un mapeo genético más detallado. Las células utilizadas para este ensayo deben expresar el gen de interés y además cumplir dos requisitos genotípicos fundamentales. Deben ser heterocigotas tanto para las secuencias de ADN asociadas con la enfermedad como para los marcadores de ADN, que pueden distinguir los transcritos según su origen cromosómico. En la estrategia de selección de líneas celulares mostrada aquí, las líneas celulares A y B son heterocigotas para un marcador codificante transcrito representado por triángulos.

Sin embargo, la línea Omnicell A es heterocigótica para la secuencia de ADN asociada con la enfermedad, denominada variante de ADN de riesgo representada por círculos. El alelo azul de la variante de riesgo se asocia con un nivel más bajo de transcripción. Después de seleccionar el cultivo de la línea celular, las células en un matraz según las especificaciones del proveedor, utilizaremos fibroblastos en esta demostración. Aunque este ensayo es igualmente aplicable a otros tipos de células, incluidas las células primarias, prepare dos placas de Petri de 10 centímetros para extracciones de ADN y ARN, respectivamente.

Cuando las células alcancen el 80 % de confluencia, pueden cosecharse para extracciones de ADN y ARN utilizando métodos estándar, incluidos kits comercialmente disponibles que sean apropiados para el tipo celular seleccionado. Antes de realizar este ensayo, diseñe dos pares de cebadores de PCR para cada marcador de ADN, un par para la amplificación de ADN genómico y otro para la amplificación de ADNc; coloque los cebadores directo e inverso para la amplificación de ADNc en exones diferentes para evitar contaminación genómica; diseñe los cebadores para obtener un producto de PCR con una longitud entre 100 y 500 pares de bases para cada línea celular; prepare reacciones de PCR de ocho microlitros. Realice cuatro reacciones independientes para la amplificación de ADN genómico y cuatro reacciones independientes para la amplificación de ADNc cada vez.

El micro relacionado con la reacción de PCR contiene el ADN del MLA, dNTPs, cebadores, cloruro de magnesio y ya sea ADN genómico o ADNc. Realice las reacciones de PCR bajo las condiciones optimizadas para cada par de cebadores, manteniendo el número de ciclos dentro de la fase lineal de amplificación. Una vez completadas las reacciones de PCR, elimine los cebadores de PCR y los dNTPs en exceso añadiendo exonucleasa I y fosfatasa alcalina de camarón (SAP) a cada producto de PCR e incube a 37 grados Celsius durante 20 minutos, seguido de 15 minutos a 85 grados Celsius.

Coloque cada producto de PCR dos veces en una placa de 384 pocillos, de modo que haya ocho mediciones disponibles para cada muestra. Un total de 16 pocillos para el ensayo de extensión primario. Diseñe el cebador de extensión con el software de diseño de ensayos para que el mismo cebador pueda utilizarse tanto para productos genómicos como de C-D-N-A-P-C-R.

Especifique una longitud de cebador en el rango de 14 a 18 pares de bases. Realice la reacción de extensión primaria con la mezcla adecuada de tres terminadores desoxinucleotídicos y un desoxinucleótido. Una reacción típica de extensión primaria incluye una etapa inicial a 94 grados Celsius durante dos minutos, seguida de 40 ciclos de 94 grados Celsius durante cinco segundos, 52 grados Celsius durante cinco segundos y 72 grados Celsius durante cinco segundos.

Finalmente, los oligonucleótidos extendidos se cuantifican mediante espectrometría de masas con desorción/ionización láser asistida por matriz y tiempo de vuelo, utilizando un espectrómetro de masas lector de espectros. Un punto clave de este protocolo consiste en utilizar varias estrategias para controlar el ruido experimental y descartar artefactos. Es muy importante repetir el experimento al menos tres veces.

El mejor control para el experimento consiste en utilizar una línea celular heterocigota para el ensayo de snip del recubrimiento destinado a la extensión primaria, pero que no porte el alelo asociado a la enfermedad. Además, diseñe ensayos para marcadores codificantes de ADN transcrito alternativos. Si estos no están disponibles, se puede incluir un control adicional mediante pares alternativos de cebadores de PCR dirigidos a exones diferentes para el ensayo de extensión primaria.

Un control interno puede proporcionarse mediante el diseño de cebadores de extensión y el apareamiento con ambas cadenas, directa e inversa. Aquí se muestra un ejemplo de análisis de expresión alélica específica con ejemplos de trazas de espectrometría de masas. Esta figura muestra los resultados del análisis de cuatro productos primarios de extensión específicos de alelo realizados en cuatro plantillas diferentes.

Los dos gráficos superiores representan los resultados obtenidos del análisis de ADN genómico de dos líneas celulares diferentes, ambas heterocigotas para un polimorfismo codificante transcrito. Sin embargo, solo la línea celular A es heterocigota para la variante de ADN de riesgo. Estos dos gráficos inferiores representan los resultados obtenidos del análisis del ADNc generado a partir de las mismas líneas celulares como resultado de un artefacto experimental.

El primer pico siempre es más alto que el segundo pico, incluso en el análisis genómico. Por lo tanto, los resultados del análisis genómico se utilizan para normalizar los datos de ADNc. El análisis estadístico se realiza extrayendo el informe completo de tipificación ELO dentro del tipo de software de matriz de masas.

Este informe proporciona datos sobre el área del pico, y aquí mostramos un ejemplo relativo a dos líneas celulares, la célula A y la célula B heterocigotas para un polimorfismo de un solo nucleótido en una región codificante, pero en las que solo la célula A es heterocigota para un marcador asociado a una enfermedad. Las columnas sombreadas en gris son generadas directamente por el software, mientras que las columnas sombreadas en verde se derivan manualmente para cada célula. Hay ocho mediciones tanto para el ADNc como para el ADN genómico.

El software calculará el área bajo cada pico del espectro, que representa la abundancia de cada uno de los dos alelos. La proporción alélica se calcula dividiendo el área del alelo uno por el área del alelo dos para cada muestra de ADNc y genómica. Se calculan una media y un error estándar a partir de las ocho mediciones.

Un alto error estándar mayor que 0,1 indica que las mediciones no son consistentes y deben descartarse. Por último, la razón media de ADNc se normaliza utilizando la razón media de ADN genómico para estimar la desviación respecto a una razón de uno, lo cual se espera cuando no hay diferencia en la expresión alélica específica. La razón normalizada es diferente de uno en la célula A, pero cercana a uno en la célula B; los datos sugieren que la línea celular A porta una variante de ADN en fase con el alelo medido por el segundo pico, lo que reduce la expresión del gen bajo análisis.

La línea celular B proporciona un control negativo muy conveniente. Es realmente importante definir variantes genéticas informativas y establecer controles experimentales adecuados al intentar este procedimiento. Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos, como el inmunoprecipitado de cromatina específico de haplotipo, que ayudan a responder preguntas como dónde existen variantes genéticas para las cuales no hay marcadores transcritos disponibles para analizar la expresión génica específica de alelo.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión sobre cómo analizar el ARN de manera específica para cada alelo y cómo utilizar esto para comprender variantes funcionales genéticamente importantes.