Name: Un alelo-específicas Gene ensayo de expresión para probar la base funcional de las asociaciones genéticas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-03T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Aprende a medir la expresión génica alelo-específica mediante espectrometría de masas MALDI-TOF en líneas celulares heterocigotas. Este método permite cuantificar niveles endógenos de expresión genética sin manipulación molecular.

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Este trabajo fue financiado por el Wellcome Trust a través de subvenciones a la APM [076566/Z/05/Z], JCK [074.318] y un premio principal del Centro Wellcome Trust de Genética Humana [075491/Z/04].

1) Cultivos Celulares <ol><li> Seleccione los tipos de células que expresan el gen de interés. </li><li> Seleccione las líneas celulares heterocigotos tanto para las variantes de riesgo y el polimorfismo de ADN transcrito de codificación en el gen de interés (Figura 1). </li><li> La cultura de la líneas de células seleccionadas de acuerdo a las especificaciones del proveedor y preparar 2 x 10 cm placas de Petri para la extracción de ADN y ARN, respectivamente. </li><li> Cuando las células alcanzan el 80% de confluencia de iniciar el procedimiento para las células cosechas y aislar el ADN y el ARN o bien siguiendo el procedimiento descrito a continuación o utilizando los kits disponibles en el mercado. </li></ol> 2) Extracción de ADN <ol><li> Retire el medio del plato, lavar con PBS y añadir a la cazuela 500 l de una solución de lisis (0,6% SDS, 100 mM NaCl, 50 mM Tris, 20 mM EDTA y 50 mg / ml RNasa A). </li><li> Roca suavemente la placa durante 20 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Raspe el lisado de células en un tubo de microcentrífuga y se incuba a 37 ° C durante la noche. </li><li> Añadir proteinasa K a una concentración final de 100 mg / ml y se incuba a 37 ° C durante la noche. </li><li> Extraer el ADN con un volumen igual de fenol-cloroformo pH 8, repito, a continuación, extraer con un volumen igual de cloroformo / alcohol isoamílico. </li><li> Precipitar el ADN con 1 / 10 del volumen 3 M NaCl y 2,5 volúmenes de etanol al 100%. </li><li> Dejar en hielo durante 5 minutos y luego girar a 13.000 rpm durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Lavar el ADN con etanol al 70%, permiten secar al aire y volver a suspender en 200 l de TE. </li><li> Se incuba a 65 ° C durante 10 minutos y luego se van por 2 días a temperatura ambiente. </li><li> Almacenar a 4 ° C o largo plazo a -20 ° C. </li></ol> 3) La extracción de RNA <ol><li> Retire el medio del plato, lavar con PBS, se añade 1 ml de Trizol y se incuba durante 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Raspar las células, una pipeta de transferencia de un par de veces, en un tubo de microcentrífuga y se incuba durante 5 min. </li><li> Girar durante 10 minutos a 10.000 rpm a 4 ° C. </li><li> Transferir el sobrenadante en un tubo nuevo y añadir 200 l de cloroformo. </li><li> Agitar y girar durante 10 minutos a 10.000 rpm a 4 ° C. </li><li> Pasar la fase acuosa en un tubo nuevo y añadir un volumen igual de etanol al 70%. </li><li> Cargue la solución a 1 ó 2 (dependiendo del volumen) y la columna RNeasy spin durante 30 segundos a velocidad máxima. </li><li> A partir de aquí siga las instrucciones del kit RNeasy (Qiagen). </li></ol> 4) Preparación de muestras de ácidos nucleicos <ol><li> Cuantificar el ADN y la concentración de ARN utilizando un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific). </li><li> Preparar cDNA a partir de 500-1000 ng de ARN utilizando decámeros azar y superíndice III de la transcriptasa inversa (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li></ol> 5) Ensayo de PCR y la extensión de los iniciadores <ol><li> Diseño de dos pares de cebadores de PCR para cada uno de los marcadores de ADN, un par de amplificación de ADN genómico y el otro par para la amplificación de cDNA (Fig. 2). Lugar de avance y retroceso de imprimación para la amplificación de cDNA en diferentes exones para evitar la contaminación genómica. Diseño de la cartilla para obtener un producto de PCR en el rango de 100-500 pb de longitud. </li><li> Prepare una reacción de 10 l PCR incluyendo 0,5 U Taq Immolase (Bioline) 0,8 mM dNTPs, 2 mM MgCl 2, 0,2 M de cada cebador y 20 ng de cualquiera de cDNA o DNA. Amplificar cada muestra en cuatro reacciones independientes. </li><li> Ejecutar la reacción de PCR en las condiciones optimizadas para cada primer par mantener el número de ciclo en la fase lineal de amplificación. </li><li> Eliminar cebador de PCR y el exceso de dNTPs incubando el producto de PCR con exonucleasa I y fosfatasa alcalina del camarón (SAP) a 37 ° C durante 20 minutos. </li><li> Lugar de cada producto de PCR dos veces en una placa de 384 pozos, de manera que las mediciones de 8 estará disponible para cada muestra. </li><li> Diseño de la cartilla de extensión con el diseño del ensayo (Sequenom) de software para que el mismo cebador se puede utilizar para los productos de PCR tanto genómico y cDNA. Especificar la duración de imprimación en el rango de 14 a 18 pb y la mezcla de extensión, incluyendo las combinaciones de 3ddNTPs (Fig. 2). </li><li> Llevar a cabo la reacción de extensión del cebador y el análisis MALDI-TOF/MS utilizando el sistema de MassARRAY (Sequenom) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Una reacción de extensión del cebador típicos son un paso inicial a 94 ° C durante 2 minutos, seguido por 40 ciclos de 94 ° C durante 5 s, 52 ° C durante 5 s, y 72 ° C durante 5 s. </li><li> Los productos de extensión del cebador se limpian con resina SpectroCLEAN y se transfirió a los microarrays (chips) por SpectroPOINT dispensador nanolitre. </li><li> Los oligonucleótidos extendidas son cuantificados por MALDI-TOF utilizando un espectrómetro de masas SpectroREADER. </li></ol> 6) Análisis estadístico <ol><li> Comprobar los resultados con el software MALDI-TOF/MS Typer MassARRAY de la calidad general de la prueba. </li><li> Extracto del informe Allelotyping que incluye los datos del área del pico. </li><li> Para cada individuo calcular el espectro derelación entre el área del pico del alelo 1 y alelo 2 (relación de área de pico). </li><li> Para cada muestra de cDNA derivar un área promedio de relación de pico y la desviación estándar, usando la función correspondiente en Excel, a través de los 8 mediciones. </li><li> Derivar la misma proporción media del área del pico a través de los 8 Medicion de ADN genómico. </li><li> Divida la proporción media de ADNc por la relación genómica significa para evaluar la desviación a la espera una proporción de 1:1. </li></ol> 7) Control Experimental <ol><li> Para descartar artefactos experimentales, repetir el experimento por lo menos tres veces. </li><li> Siempre que sea posible, los ensayos de diseño de marcadores de ADN adicional. </li><li> Diseño de múltiples pares de cebadores de PCR y cebadores de extensión de líneas de recocido hacia adelante y hacia atrás. </li><li> Siempre que sea posible prueba como negativos los controles de líneas celulares que son heterocigotos para los marcadores de ADN, pero no llevan el ADN de variantes de riesgo asociados con el fenotipo (Fig. 1 y Fig. 3). </li></ol> 8) Los resultados representativos Un ejemplo de alelo específico de análisis de la expresión se muestra en la Figura 3 con ejemplos de trazas de espectrometría de masas. La figura muestra los resultados del análisis de cuatro alelo-específicas de los productos de extensión del cebador llevó a cabo el 4 de diferentes plantillas. Los gráficos de arriba representan los resultados obtenidos del análisis de ADN genómico de dos líneas celulares diferentes, que son heterocigotos para un polimorfismo transcrito de codificación. Sin embargo, sólo una línea celular es heterocigota para la variante de ADN de riesgo (Figura 1). Las gráficas inferiores representan los resultados obtenidos del análisis de la cDNA generada a partir de las mismas líneas celulares. Como resultado de artefacto experimental el primer pico es siempre mayor que el segundo pico, incluso en el análisis genómico. Por lo tanto, los resultados de los análisis genómico se utilizan para normalizar los datos de cDNA. Después de la normalización, la proporción de alelos es significativamente diferente de 1 en la línea celular A (donde aparece el segundo pico más bajo en comparación con los espectros de otros), mientras que es muy cercano a 1 en la línea celular B. Los datos sugieren que la línea celular A lleva a bordo un variante de ADN, en fase con el alelo medido por el segundo pico, lo que reduce la expresión del gen analizado. Línea de células B ofrece un control negativo muy conveniente. <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. La línea celular estrategia de selección. Las líneas celulares A y B son heterocigotos para un marcador transcrito de codificación (triángulo), pero sólo una línea celular es heterocigota para la variante de riesgo del ADN (círculo). El alelo azul de la variante de riesgo está asociado (ya sea con un efecto directo o porque en estrecha correlación con la variante funcional actual) con un menor nivel de la transcripción. <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Alelo específico de ensayo de extensión del cebador. Esta figura muestra el flujo de trabajo del procedimiento experimental realizado para los dos ADNc (izquierda) y genómica (derecha) plantillas. PCR (rectángulos grises) están diseñados para amplificar un polimorfismo heterocigota de codificación (triángulo). Para evitar la contaminación genómica PCR primers recocido secuencias colocados en diferentes exones (barras azules) cuando la amplificación se lleva a cabo en la plantilla de cDNA. El producto de PCR se utiliza como plantilla para una reacción de extensión del cebador llevado a cabo con una cartilla de extensión, recocido una base junto al polimorfismo, y la combinación adecuada de tres didesoxinucleótidos (ddNTPs) terminadores (cuadrados) y una desoxinucleótidos (círculo) se extienden a la imprimación de una o dos bases, respectivamente. Los productos resultantes de imprimación extensión tienen masas diferentes, que permiten la separación y cuantificación por espectrometría de masa MALDI-TOF. La cantidad de producto correspondiente al alelo azul del marcador de ADN es relativamente menor que el alelo rojo. <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Los resultados de un alelo específico de ensayo de expresión. La figura muestra los resultados de la espectrometría de masas a partir del análisis llevado a cabo en el ADN genómico y el cDNA de la línea celular A y la línea de células B (Figura 1).

<ol><li>Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+complex+disease+traits+with+global+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Mapping complex disease traits with global gene expression.</a> Nat Rev Genet. 10, 184-194 (2009).</li>
<li>Singer-Sam, J., LeBon, J. M., Dai, A., Riggs, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive%2C+quantitative+assay+for+measurement+of+allele-specific+transcripts+differing+by+a+single+nucleotide%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">A sensitive, quantitative assay for measurement of allele-specific transcripts differing by a single nucleotide.</a> PCR Methods Appl. 1, 160-163 (1992).</li>
<li>Yan, H., Yuan, W., Velculescu, V. E., Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+variation+in+human+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Allelic variation in human gene expression.</a> Science. 297, 1143-11 (2002).</li>
<li>Ding, C., Cantor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+gene+expression+analysis+technique+using+competitive+PCR+and+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A high-throughput gene expression analysis technique using competitive PCR and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight MS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 3059-3064 (2003).</li>
<li>Gabriel, S., Ziaugra, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+genotyping+using+Sequenom+MassARRAY+7K+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Hum+Genet+Chapter%22%5BJournal%5D)">SNP genotyping using Sequenom MassARRAY 7K platform.</a> Curr Protoc Hum Genet Chapter. Chapter 2 (Unit 2), 12-12 (2004).</li>
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<li>Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression-based+discovery+of+variation+in+the+human+glutathione+S-transferase+M3+promoter+and+functional+analysis+in+a+glioma+cell+line+using+allele-specific+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Expression-based discovery of variation in the human glutathione S-transferase M3 promoter and functional analysis in a glioma cell line using allele-specific chromatin immunoprecipitation.</a> Cancer Res. 65, 99-104 (2005).</li>
<li>Knight, J. C., Keating, B. J., Rockett, K. A., Kwiatkowski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+characterization+of+regulatory+polymorphisms+by+allele-specific+quantification+of+RNA+polymerase+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">In vivo characterization of regulatory polymorphisms by allele-specific quantification of RNA polymerase loading.</a> Nat Genet. 33 (4), 469-475 (2003).</li>
<li>Pastinen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+genetic+and+epigenetic+variation+affecting+human+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">A survey of genetic and epigenetic variation affecting human gene expression.</a> Physiol Genomics. 16 (2), 184-193 (2004).</li>
<li>Francks, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+77-kilobase+region+of+chromosome+6p22.2+is+associated+with+dyslexia+in+families+from+the+United+Kingdom+and+from+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">A 77-kilobase region of chromosome 6p22.2 is associated with dyslexia in families from the United Kingdom and from the United States.</a> Am J Hum Genet. 75 (6), 1046-1058 (2004).</li>
<li>Paracchini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromosome+6p22+haplotype+associated+with+dyslexia+reduces+the+expression+of+KIAA0319%2C+a+novel+gene+involved+in+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The chromosome 6p22 haplotype associated with dyslexia reduces the expression of KIAA0319, a novel gene involved in neuronal migration.</a> Hum Mol Genet. 15 (10), 1659-1666 (2006).</li>
</ol>

Este método permite la evaluación del efecto de las enfermedades asociadas a las variantes de ADN en la expresión génica mediante la evaluación en el alelo-específicas vivo diferencia en el nivel de transcripción. En este protocolo la abundancia de transcripción relativa se mide por MALDI-TOF, pero otras tecnologías que permite la cuantificación alelo-específicas, tales como TaqMan 6,7, se puede utilizar. La principal limitación de este enfoque es la disponibilidad de transcribir los marcadores de codificación. Los métodos basados ​​en el principio descrito aquí, pero aprovechando las diferentes clases de polimorfismos, se han descrito. El ensayo haploChip medidas alelo específico de expresión utilizando los marcadores situados en 1 kb del inicio de la transcripción o en el sitio final de un gen que estaría presente en el material de la cromatina immunoprecipitated aisladas con anticuerpos específicos para la ARN polimerasa II 8. Por otra parte, SNPs intrónicas se puede utilizar cuando la plantilla es heteronuclear ARN 9. El protocolo específico descrito aquí, en combinación con el ensayo haploChip, se ha utilizado con éxito para identificar un gen candidato para la dislexia (o discapacidad de lectura). Inicialmente, un estudio de asociación genética identifica una secuencia de ADN asociados a la dislexia y que abarca tres genes 10. El alelo-específicas de ensayo de la expresión de genes mostró que en la presencia de la dislexia asociada a la variación de expresión de ADN variantes se observó en sólo uno de los tres genes, pero no los otros dos 11.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0416</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR international</td><td>27788.366</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134-500G</td><td></td></tr><tr><td>RNasa A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Proteasa K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Fenol: cloroformo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>VWR international</td><td>100777C</td><td></td></tr><tr><td>Etileno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32221-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Kit RNeasy</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Transcriptasa inversa SuperScript III</td><td>Invitrogen</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>Taq Immolase</td><td>Bioline</td><td>BIO-21048</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DNTP100A</td><td></td></tr><tr><td>Exonucleasa 1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0293S</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatasa alcalina de camarón</td><td>GE Healthcare</td><td>E70092Z</td><td></td></tr><tr><td>Resina SpectroCLEAN</td><td>Sequenom</td><td>10053</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla ddNTP/dNTP MassEXTEND</td><td>Sequenom</td><td></td><td>Varía según el diseño del ensayo</td></tr><tr><td>Termosecuenasa MassEXTEND</td><td>Sequenom</td><td>10052</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipamiento&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga refrigerada</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro NanoDrop</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispensador de nanolitros SpectroPOINT</td><td>Sequenom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrómetro de masas SpectroREADER</td><td>Sequenom</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un alelo-específicas gene ensayo de expresión para probar la base funcional de las asociaciones genéticas

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

El número de importantes asociaciones genéticas con rasgos comunes complejo está en constante aumento. Sin embargo, la mayoría de estas asociaciones no se han entendido a nivel molecular. Uno de los mecanismos que median el efecto de las variantes de ADN en los fenotipos es la expresión de genes, que ha demostrado ser particularmente relevante para los rasgos complejos 1. Este método de análisis en un contexto celular el efecto de las secuencias específicas de ADN sobre la expresión génica. El principio consiste en medir la abundancia relativa de las transcripciones resultantes de los dos alelos de un gen, el análisis de las células que llevan una copia de las secuencias de ADN asociadas con la enfermedad (las variantes de riesgo) 2,3. Por lo tanto, las células utilizan para este método debe cumplir dos requisitos fundamentales genotípica: tienen que ser heterocigotos para ambas variantes de riesgo del ADN y los marcadores de ADN, los polimorfismos general de codificación, que puede distinguir las transcripciones en base a su origen cromosómico (Figura 1). Variantes de ADN de riesgo y marcadores de ADN no es necesario que la frecuencia del alelo mismo, pero la fase (haplotípica) relación de los marcadores genéticos tiene que ser entendido. También es importante elegir los tipos de células que expresan el gen de interés. Este protocolo se refiere específicamente al procedimiento adoptado para extraer los ácidos nucleicos a partir de fibroblastos, pero el método es igualmente aplicable a otros tipos de células incluyendo las células primarias. ADN y el ARN se extraen de las líneas celulares seleccionadas y cDNA se genera. ADN y el cDNA se analizan con un ensayo de extensión del cebador, diseñado para los marcadores de ADN que codifica 4. El ensayo de extensión del cebador se lleva a cabo utilizando el MassARRAY (Sequenom) 5 plataforma de acuerdo a las especificaciones del fabricante. Productos de extensión del cebador son analizadas por láser asistida por matriz de desorción / ionización tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF/MS). Debido a que los marcadores seleccionados son heterocigotos que va a generar dos picos en los perfiles. El área de cada pico es proporcional a la abundancia de transcripción y se puede medir con una función del software Typer MassARRAY para generar una relación de alelos (alelo 1: alelo 2) Cálculo. La relación alélica obtenida para cDNA se normaliza el uso que se mide a partir del ADN genómico, donde se espera que la proporción de alelos de 1:1 para corregir los artefactos técnicos. Marcadores con una relación normalizada alélicas significativamente diferentes a 1 indican que la cantidad de transcripción generada a partir de los dos cromosomas de la célula misma es diferente, lo que sugiere que las variantes de ADN asociados con el fenotipo de tener un efecto sobre la expresión génica. Controles experimentales se debe utilizar para confirmar los resultados.

Asociaciones genéticas con frecuencia permanecen sin explicación a un nivel funcional. Este método tiene como objetivo evaluar el efecto del fenotipo asociado a los marcadores genéticos en la expresión génica mediante el análisis de las células heterocigotos para SNPs transcrito. La tecnología permite la medición precisa de MALDI-TOF espectrometría de masas para cuantificar alelo-específicas de los productos de extensión del cebador.

Un alelo-específicas Gene ensayo de expresión para probar la base funcional de las asociaciones genéticas

El número de asociaciones genéticas significativas con rasgos complejos comunes aumenta constantemente. Sin embargo, la mayoría de estas asociaciones no han sido...

El objetivo general del siguiente experimento es probar si una variante particular de ADN, como una asociada con una enfermedad, tiene un efecto sobre la expresión de un gen específico. Esto se logra seleccionando líneas celulares que sean heterocigotas tanto para esta variante como para un polimorfismo de un solo nucleótido (snip) en el gen de interés. Como segundo paso, se extraen ADN y ARN de las células y luego se utilizan como plantilla para una reacción de extensión primaria específica de alelo.A continuación, los productos primarios de extensión se analizan mediante espectrometría de masas para cuantificar la abundancia relativa de los dos alelos. Se obtienen resultados que indican si la variante de ADN original asociada con una enfermedad también está asociada con una diferencia en la expresión génica basada en mediciones cuantitativas específicas de alelos mediante espectrometría de masas. Las principales ventajas de esta técnica son que, a diferencia de un ensayo de gen reportero con luciferasa, no requiere manipulación molecular y mide los niveles endógenos de expresión génica.Además, somos capaces de comparar los niveles de expresión entre los dos alelos de manera internamente controlada, lo que elimina parte de la variabilidad experimental. Este método nos ayuda a responder preguntas clave en el campo de la genética humana, como los mecanismos moleculares que subyacen a las asociaciones genéticas. Planteamos por primera vez esta idea cuando identificamos una asociación genética que abarcaba tres genes y no pudimos precisar la señal en uno solo.Mediante un mapeo genético más detallado. Las células utilizadas para este ensayo deben expresar el gen de interés y además cumplir dos requisitos genotípicos fundamentales. Deben ser heterocigotas tanto para las secuencias de ADN asociadas con la enfermedad como para los marcadores de ADN, que pueden distinguir los transcritos según su origen cromosómico. En la estrategia de selección de líneas celulares mostrada aquí, las líneas celulares A y B son heterocigotas para un marcador codificante transcrito representado por triángulos.Sin embargo, la línea Omnicell A es heterocigótica para la secuencia de ADN asociada con la enfermedad, denominada variante de ADN de riesgo representada por círculos. El alelo azul de la variante de riesgo se asocia con un nivel más bajo de transcripción. Después de seleccionar el cultivo de la línea celular, las células en un matraz según las especificaciones del proveedor, utilizaremos fibroblastos en esta demostración. Aunque este ensayo es igualmente aplicable a otros tipos de células, incluidas las células primarias, prepare dos placas de Petri de 10 centímetros para extracciones de ADN y ARN, respectivamente.Cuando las células alcancen el 80 % de confluencia, pueden cosecharse para extracciones de ADN y ARN utilizando métodos estándar, incluidos kits comercialmente disponibles que sean apropiados para el tipo celular seleccionado. Antes de realizar este ensayo, diseñe dos pares de cebadores de PCR para cada marcador de ADN, un par para la amplificación de ADN genómico y otro para la amplificación de ADNc; coloque los cebadores directo e inverso para la amplificación de ADNc en exones diferentes para evitar contaminación genómica; diseñe los cebadores para obtener un producto de PCR con una longitud entre 100 y 500 pares de bases para cada línea celular; prepare reacciones de PCR de ocho microlitros. Realice cuatro reacciones independientes para la amplificación de ADN genómico y cuatro reacciones independientes para la amplificación de ADNc cada vez.El micro relacionado con la reacción de PCR contiene el ADN del MLA, dNTPs, cebadores, cloruro de magnesio y ya sea ADN genómico o ADNc. Realice las reacciones de PCR bajo las condiciones optimizadas para cada par de cebadores, manteniendo el número de ciclos dentro de la fase lineal de amplificación. Una vez completadas las reacciones de PCR, elimine los cebadores de PCR y los dNTPs en exceso añadiendo exonucleasa I y fosfatasa alcalina de camarón (SAP) a cada producto de PCR e incube a 37 grados Celsius durante 20 minutos, seguido de 15 minutos a 85 grados Celsius.Coloque cada producto de PCR dos veces en una placa de 384 pocillos, de modo que haya ocho mediciones disponibles para cada muestra. Un total de 16 pocillos para el ensayo de extensión primario. Diseñe el cebador de extensión con el software de diseño de ensayos para que el mismo cebador pueda utilizarse tanto para productos genómicos como de C-D-N-A-P-C-R.Especifique una longitud de cebador en el rango de 14 a 18 pares de bases. Realice la reacción de extensión primaria con la mezcla adecuada de tres terminadores desoxinucleotídicos y un desoxinucleótido. Una reacción típica de extensión primaria incluye una etapa inicial a 94 grados Celsius durante dos minutos, seguida de 40 ciclos de 94 grados Celsius durante cinco segundos, 52 grados Celsius durante cinco segundos y 72 grados Celsius durante cinco segundos.Finalmente, los oligonucleótidos extendidos se cuantifican mediante espectrometría de masas con desorción/ionización láser asistida por matriz y tiempo de vuelo, utilizando un espectrómetro de masas lector de espectros. Un punto clave de este protocolo consiste en utilizar varias estrategias para controlar el ruido experimental y descartar artefactos. Es muy importante repetir el experimento al menos tres veces.El mejor control para el experimento consiste en utilizar una línea celular heterocigota para el ensayo de snip del recubrimiento destinado a la extensión primaria, pero que no porte el alelo asociado a la enfermedad. Además, diseñe ensayos para marcadores codificantes de ADN transcrito alternativos. Si estos no están disponibles, se puede incluir un control adicional mediante pares alternativos de cebadores de PCR dirigidos a exones diferentes para el ensayo de extensión primaria.Un control interno puede proporcionarse mediante el diseño de cebadores de extensión y el apareamiento con ambas cadenas, directa e inversa. Aquí se muestra un ejemplo de análisis de expresión alélica específica con ejemplos de trazas de espectrometría de masas. Esta figura muestra los resultados del análisis de cuatro productos primarios de extensión específicos de alelo realizados en cuatro plantillas diferentes.Los dos gráficos superiores representan los resultados obtenidos del análisis de ADN genómico de dos líneas celulares diferentes, ambas heterocigotas para un polimorfismo codificante transcrito. Sin embargo, solo la línea celular A es heterocigota para la variante de ADN de riesgo. Estos dos gráficos inferiores representan los resultados obtenidos del análisis del ADNc generado a partir de las mismas líneas celulares como resultado de un artefacto experimental.El primer pico siempre es más alto que el segundo pico, incluso en el análisis genómico. Por lo tanto, los resultados del análisis genómico se utilizan para normalizar los datos de ADNc. El análisis estadístico se realiza extrayendo el informe completo de tipificación ELO dentro del tipo de software de matriz de masas.Este informe proporciona datos sobre el área del pico, y aquí mostramos un ejemplo relativo a dos líneas celulares, la célula A y la célula B heterocigotas para un polimorfismo de un solo nucleótido en una región codificante, pero en las que solo la célula A es heterocigota para un marcador asociado a una enfermedad. Las columnas sombreadas en gris son generadas directamente por el software, mientras que las columnas sombreadas en verde se derivan manualmente para cada célula. Hay ocho mediciones tanto para el ADNc como para el ADN genómico.El software calculará el área bajo cada pico del espectro, que representa la abundancia de cada uno de los dos alelos. La proporción alélica se calcula dividiendo el área del alelo uno por el área del alelo dos para cada muestra de ADNc y genómica. Se calculan una media y un error estándar a partir de las ocho mediciones.Un alto error estándar mayor que 0,1 indica que las mediciones no son consistentes y deben descartarse. Por último, la razón media de ADNc se normaliza utilizando la razón media de ADN genómico para estimar la desviación respecto a una razón de uno, lo cual se espera cuando no hay diferencia en la expresión alélica específica. La razón normalizada es diferente de uno en la célula A, pero cercana a uno en la célula B; los datos sugieren que la línea celular A porta una variante de ADN en fase con el alelo medido por el segundo pico, lo que reduce la expresión del gen bajo análisis.La línea celular B proporciona un control negativo muy conveniente. Es realmente importante definir variantes genéticas informativas y establecer controles experimentales adecuados al intentar este procedimiento. Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos, como el inmunoprecipitado de cromatina específico de haplotipo, que ayudan a responder preguntas como dónde existen variantes genéticas para las cuales no hay marcadores transcritos disponibles para analizar la expresión génica específica de alelo.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión sobre cómo analizar el ARN de manera específica para cada alelo y cómo utilizar esto para comprender variantes funcionales genéticamente importantes.

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