Farmacología del Comportamiento en el condicionamiento clásico de la respuesta de Extensión probóscide en abejas de la miel ( Apis mellifera)

El objetivo general de este procedimiento es estudiar los mecanismos moleculares que subyacen a la formación del aprendizaje y la memoria. En las abejas melíferas, el primer paso consiste en recolectar abejas en vuelo libre desde su colmena. A continuación, las abejas se ensamblan en tubos de plástico.

El tercer paso del procedimiento consiste en realizar un condicionamiento clásico. Se pueden inyectar fármacos en determinados momentos alrededor del condicionamiento para estudiar su efecto sobre la formación del aprendizaje y la memoria. El paso final del procedimiento es evaluar la retención de la memoria.

En última instancia, los cambios en el comportamiento tras el tratamiento con fármacos pueden revelar los mecanismos moleculares que subyacen a la formación del aprendizaje y la memoria. En abejas melíferas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del aprendizaje y la memoria al descubrir los mecanismos moleculares de la formación de la memoria.

En general, los investigadores nuevos en este método tendrán dificultades porque el momento de la presentación de los estímulos durante el condicionamiento y la recuperación de la memoria debe ser exacto. Además, el régimen de alimentación es fundamental. El procedimiento será demostrado por Cutting Gearing y Johannes Faberg a estudiantes de posgrado de mi laboratorio. El día anterior al experimento, recolecte abejas entre las 2:00 y las 4:00 PM utilizando una pirámide de plexiglás permeable a la luz UV.

Una vez de regreso en el laboratorio, coloque la pirámide sobre su base y oscurezca las paredes con una toalla, dejando el ápice descubierto. Abra el ápice y sostenga un vial de vidrio sobre la abertura, permitiendo que una sola abeja entre en el vial antes de volver a cerrarlo. Continúe este procedimiento hasta que todas las abejas hayan sido transferidas a un vial de vidrio en otoño e invierno.

Cuando las abejas no están volando en el exterior, se mantiene una colmena dentro de un invernadero cubierta con una red; se capturan abejas individuales directamente de la red. Utilizando un frasco de vidrio por abeja, inmovilice a la abeja enfriando el frasco sobre hielo durante dos minutos y medio a tres minutos y medio. Observe cuidadosamente a la abeja y retírela del hielo tan pronto como deje de moverse.

Sujete la abeja inmovilizada en un tubo de plástico pequeño con cinta adhesiva. Asegúrese de que la abeja pueda mover libremente sus ósculos, pero no su cabeza, tórax ni patas. También es importante no comprimir el cuello.

Una vez que se prepara una abeja, coloque el tubo en un orificio numerado de un soporte. Para un mejor manejo y una identificación más sencilla.

Los tubos siempre se devuelven al mismo orificio. Después del manejo, alimente a las abejas entre las 4 y las 6:00 PM en un lugar distinto al sitio de condicionamiento. Provoque la respuesta de extensión del probóscide o PER tocando a las abejas y sus antenas.

Con una solución de sacarosa, permita que la abeja consuma una gota de aproximadamente cuatro microlitros de solución de SRAs. Asegúrese de no manchar las antenas, el probóscide o el tubo de plástico. Alimente a cada abeja hasta que ya no lo haga.

Muestre un PER rápido y confiable cuando se toque su antena con la solución. En las noches subsiguientes del experimento, alimente a cada abeja cuatro veces con una gota de solución de sacarosa. Llene un recipiente de plástico aproximadamente de 0,5 a un centímetro de altura con agua del grifo.

Coloque la bandeja con las abejas ensilladas en el recipiente utilizando placas lisas como plataforma. Cubra el recipiente con cartón y almacénelo a temperatura ambiente durante la noche. Las abejas reciben condicionamiento olfativo alrededor de las 10:00 a.m. de la mañana siguiente a su recolección.

30 minutos antes del inicio del experimento, coloque la rejilla con las abejas en arneses cerca del lugar de condicionamiento, pero lejos de la abertura del tubo de escape donde se entrenarán las abejas. A continuación, prepare el estímulo condicionado trabajando bajo una campana extractora.

Utilice una punta filtrante para pipetear cuatro microlitros de aceite de clavo sobre un papel de filtro redondo. Coloque el papel de filtro perfumado en una jeringa de 20 mililitros e introduzca el émbolo. Configure el reproductor de audio que entregará una señal acústica al experimentador.

Esto garantiza la temporización precisa del estímulo, inicio del estímulo, finalización del estímulo, duración y colocación. Prepárese para registrar el comportamiento de la abeja durante todo el proceso de condicionamiento. Se otorga una puntuación positiva si la abeja extiende su SSIS entre el inicio del estímulo condicionado y la presentación del estímulo incondicionado.

Cruzar una línea virtual entre las mandíbulas abiertas Para comenzar un ensayo de adquisición, seleccione la abeja que se entrenará y colóquela frente al escape durante 10 segundos. Poco antes del final de este intervalo de diez segundos, coloque la jeringa que contiene el olor a tres centímetros de la abeja y sus antenas. Presente el olor durante cinco segundos empujando 20 mililitros de aire a través de la jeringa.

Después de tres segundos, introduzca el estímulo incondicionado tocando la parte ventral de las flagelas distales de ambas antenas con una solución de sacarosa, aplicada con un palillo húmedo. Teniendo cuidado de no depositar la solución sobre las abejas ni las antenas, se permite entonces que la abeja lame el palillo. Este estímulo compuesto dura cuatro segundos, tras lo cual las abejas se retiran del contexto de entrenamiento y se devuelven al estante.

13 segundos después de la presentación del estímulo condicionado, un ensayo de entrenamiento dura 28 segundos. Devuelva la abeja al sitio de entrenamiento tras un intervalo interensayo de 10 minutos. Realice el segundo de los tres ensayos como se mostró previamente, y espere otros 10 minutos antes de realizar el último apareamiento.

Una vez finalizado el entrenamiento del día, coloque nuevamente las rejillas en el recipiente. Recuerde alimentar a cada abeja cuatro veces con una gota de cuatro microlitros de solución de sacarosa entre las 4:00 y las 6:00 PM. Como se demostró anteriormente, las pruebas de retención pueden realizarse en intervalos que van desde minutos hasta días después del entrenamiento. Prepárese para la prueba de memoria colocando la rejilla de abejas cerca del sitio de condicionamiento durante 30 minutos.

Inicie la prueba colocando una abeja frente al escape durante 10 segundos. Presente el estímulo condicionado durante cinco segundos y observe la ocurrencia de una PER. Una vez finalizada la prueba del día, coloque nuevamente los estantes dentro del recipiente.

Recuerde alimentar a cada abeja cuatro veces con una gota de cuatro microlitros de solución de sacarosa entre las 4 y las 6:00 p.m., como se demostró anteriormente. Al finalizar todo el experimento, verifique que la abeja aún sea capaz de extender su probóscide tocando una antena con la solución de SRA para ser incluida en el análisis; las abejas deben sobrevivir a todo el experimento y presentar una PER intacta. En algunos estudios, se utilizan inyecciones sistémicas para estudiar el efecto de intervenciones farmacológicas sobre la memoria olfativa. Estas inyecciones pueden administrarse en diferentes momentos según el diseño del experimento.

Para comenzar, haga un pequeño orificio en el cutículo de la parte posterior del S scootin cerca de la fisura S scootle, por encima del músculo de vuelo, utilizando una aguja hipodérmica desechable. A continuación, llene un tubo capilar de vidrio con un microlitro de la solución que se va a probar. Introduzca el capilar en el orificio del cutículo e inyecte la solución en el músculo de vuelo.

Los experimentadores capacitados pueden inyectar una abeja cada 30 segundos, lo que permite un cronometraje preciso de la inyección y el condicionamiento. Aquí se presentan dos experimentos. El primer experimento examina el impacto de una inyección sistémica de solución salina administrada antes del entrenamiento sobre el aprendizaje de una memoria.

Hay tres grupos en este estudio: un grupo que no recibe tratamiento, un grupo que recibe una inyección sistémica de un microlitro de solución salina tamponada con fosfato o un grupo simulado. Estos tratamientos se administraron 30 minutos antes del entrenamiento, que se muestra aquí a la izquierda. El porcentaje de animales que mostraron la respuesta condicionada durante la adquisición aumentó a lo largo de los tres ensayos de entrenamiento, sin existir diferencias entre los grupos.

Los gráficos de barras a la derecha muestran que ni la inyección de PBS ni la lesión simulada afectaron la retención de la memoria. Veinticuatro horas después del entrenamiento, en el segundo experimento, se realizaron inyecciones 40 minutos después del entrenamiento; las abejas se dividieron en un grupo que recibió solución salina y otro que recibió un microlitro del inhibidor de la síntesis de proteínas y eritromicina. Los gráficos de barras a la derecha muestran una clara disminución en la retención de la memoria en las abejas que recibieron anisomicina. Estos resultados destacan la importancia de la síntesis de proteínas en la formación de la memoria olfativa.

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar grabaciones electrofisiológicas y electropisiológicas para responder preguntas adicionales, como cuál es la base neurofisiológica de la formación del aprendizaje y la memoria después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del estudio del aprendizaje y la memoria exploraran los mecanismos moleculares y neurofisiológicos involucrados en la formación de la memoria en la abeja melífera.